Isolement de l'artère pulmonaire cellules musculaires lisses de souris néonatales

Résumé

Nous avons développé une nouvelle technique et reproductible pour isoler les cultures primaires de cellules musculaires lisses de l'artère pulmonaire (PASMC) de souris dès l'âge de P7, ce qui permet une meilleure étude des voies de signalisation impliquées dans la contraction des cellules musculaires lisses néonatale et de détente.

Résumé

L'hypertension artérielle pulmonaire est une cause importante de morbidité et de mortalité chez les nourrissons. Historiquement, il ya eu une importante étude des voies de signalisation impliquées dans vasculaire contraction des muscles lisses dans PASMC de foetus de mouton. Alors que les moutons font un excellent modèle de l'hypertension pulmonaire terme, ils sont très chers et n'ont pas l'avantage de la manipulation génétique des souris. Inversement, l'incapacité à isoler PASMC de souris était une limitation importante de ce système. Ici, nous avons décrit l'isolement des cultures primaires de souris PASMC de P7, P14, P21 et souris en utilisant une variante de la technique décrite précédemment de Marshall et al. ²⁶ qui a déjà été utilisé pour isoler PASMC de rat. Ces PASMC murine représentent un nouvel outil pour l'étude des voies de signalisation dans la période néonatale. En bref, une suspension de 0,5% (p / v) d'agarose + particules de fer de 0,5% en M199 support est infusé dans le lit vasculaire pulmonaire par le ventricule droit (RV). Ledes particules de fer sont de 0,2 m de diamètre et ne peuvent pas passer à travers le lit capillaire pulmonaire. Ainsi, les pavillons de fer dans les petites artères pulmonaires (AP). Les poumons sont gonflés avec de l'agarose, enlevé et dissociées. Les récipients contenant du fer sont tirés vers le bas avec un aimant. Après la collagénase (80 U / ml) un traitement et autre dissociation, les vaisseaux sont placés dans une boîte de culture tissulaire dans M199 milieu contenant 20% de sérum de veau fœtal (FBS) et des antibiotiques (M199 milieu complet) pour permettre la migration des cellules sur la boîte de culture . Cette plaque initiale des cellules est un mélange 50-50 de fibroblastes et PASMC. Ainsi, l'attraction procédure baisse est répété plusieurs fois pour atteindre une population de PASMC plus pur et enlever le fer résiduel. Identité de la cellule musculaire lisse est confirmée par immunomarquage pour la myosine du muscle lisse et la desmine.

Introduction

L'hypertension artérielle pulmonaire est normale au cours de la vie intra-utérine depuis le placenta sert de l'organe majeur des échanges gazeux et seulement 10% du débit cardiaque est distribué à travers le lit vasculaire pulmonaire. In utero, les pressions pulmonaires sont semblables à des pressions systémiques en raison de la résistance vasculaire pulmonaire élevée . En gestation progresse, il ya une croissance rapide de la petite PA dans le poumon, la préparation du fœtus de l'augmentation spectaculaire du débit sanguin pulmonaire qui survient à la naissance ^1. Lorsque la transition périnatale normale échoue dans nourrissons nés à terme à court terme et complète, le résultat est l'hypertension pulmonaire persistante du nouveau-né (PPHN). PPHN est un syndrome clinique causé par de nombreuses pathologies sous-jacentes. Cependant, tous ces enfants ont des caractéristiques physiopathologiques communs tels que la résistance élevée pulmonaire vasculaire, l'hypoxémie, et shunt droite-gauche de la circulation sanguine à travers les connexions persistantes foetales telles que la persistance du canal artériel ou pourAmen ovale. PPHN affecte 2-6 pour 1000 naissances vivantes et transmet un risque de 8-10% de la mortalité ainsi que la morbidité significative à court terme et à long terme ^2. En outre, les poids de naissance prématurés très faibles peuvent développer une hypertension pulmonaire par suite de leur maladie pulmonaire sous-jacente. La maladie pulmonaire sous-jacente la plus fréquente des prématurés est une dysplasie broncho-pulmonaire (DBP). Bien que le risque global de BPD est corrélée avec l'âge gestationnel et le poids à la naissance, on ne sait pas pourquoi un sous-ensemble de ces nourrissons développe l'hypertension artérielle pulmonaire importante et la façon de traiter de manière appropriée ces nourrissons. Les mauvais résultats, y compris des hospitalisations prolongées et une mortalité accrue, sont communs ^3-6.

Historiquement, PASMC fœtus ovin ou porcin PASMC fœtus d'animaux sains ont été utilisées pour étudier les voies de signalisation impliquées dans la transition vasculaire pulmonaire normale après la naissance. Ceux-ci sont généralement isolés du cinquième PA de résistance de génération d'unn ovine ou porcine fœtus qui est livré et euthanasié avant toute respiration spontanée ^7-9. En outre, certains chercheurs ont isolé et utilisé PASMC d'un peu plus âgés et respirant spontanément agneaux et les porcelets à 3 jours, 2 semaines et 4 semaines ^10-12. Plus récemment, certains groupes ont réussi à isoler et utilisé PASMC isolé des agneaux avec PPHN d'examiner les dérangements dans les voies de signalisation de l'état de la maladie ^13-17. Ces cellules se sont révélés être un outil précieux pour étudier les voies de signalisation qui sont essentiels à la fois dans le système vasculaire pulmonaire normal et pathologique à court terme et long terme. Cependant, ils ne donnent pas un aperçu des voies de signalisation affectées chez les enfants prématurés atteints d'hypertension pulmonaire. Pas plus qu'ils ne permettent les possibilités de manipulations génétiques observés dans des modèles murins de la maladie.

des modèles de rats et de souris ont longtemps été utilisés pour modèle TPL et plus récemment sont utilisés pour modéliser hy pulmonairepertension résultant de BPD ^18-22. Rats nouveau-nés sont alléchantes pour travailler avec en raison de leur plus grande taille, mais ils souffrent aussi d'un manque de potentiel de la modification génétique. Les animaux génétiquement modifiés ont été largement utilisés pour étudier les effets des gènes cibles spécifiques sur la physiologie de l'animal entier chez les souris néonatales, mais à ce jour personne n'a déjà réussi à isoler PASMC de ces petites souris. En isolant PASMC, plus d'informations peuvent être obtenues sur la façon dont les voies changent en réponse aux stimuli environnementaux et / ou modification génétique spécifiquement dans le muscle lisse de l'artère pulmonaire. En outre, en direct PASMC peut être visualisé en temps réel pour examiner les changements rapides de molécules de signalisation clés tels que le calcium et les espèces réactives de l'oxygène ^23-25. Nous avons récemment décrit l'isolement réussi de PASMC de souris adultes en utilisant une variante de la technique de Marshall et al. ²⁶ utilisé pour isoler rat PASMC ^23,25,26. Nous avons maintenant adapté unend étendu cette technique aux petites souris 7-21 jours d'âge (P7, P14, P21 et). La principale limitation de cette nouvelle technique d'isolation PASMC est qu'il nécessite plusieurs souris à produire suffisamment de cellules pour des expériences et que les cellules se développent très lentement, ce qui est caractéristique des cellules musculaires lisses primaires. Malgré ces limites, nous pensons que cette technique d'isoler PASMC néonatal de la souris permettra d'enquête améliorée de voies de signalisation clés impliqués dans le développement de l'hypertension artérielle pulmonaire et représente une avancée significative dans ce domaine.

Protocole

La protection des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation de la Northwestern University ont approuvé ce protocole.

1. Isolement de l'artère pulmonaire de souris néonatales - Day One

1. Préparer les médias complètes M199 - Mélanger 400 ml M199 avec 100 ml (concentration finale = 20%) chaleur FBS inactivé et 5 ml (concentration finale = 1%) pénicilline / streptomycine.
2. Préparer le sérum gratuites M199 médias - Mélanger 500 ml M199 avec 5 ml (concentration finale = 1%) pénicilline / streptomycine.
3. Préparer la PA Agarose - Mix 0,05 g d'agarose plus 0,05 g de particules de fer dans 10 ml stériles, exempts de sérum M199 médias.
4. Préparer le poumon Agarose - Mélanger 0,1 g d'agarose dans 10 ml stériles, exempts de sérum M199 médias.
5. Préparer la collagénase - collagénase Mix en stériles, exempts de sérum M199 médias à une concentration finale de 80 U / ml, puis filtre stérile de ce mélange.
6. Mettre en place tout le matériel à l'avance avant d'euthanasier la souris.
7. Réglez PA agarose et du poumon agarose à ébullition juste avant l'euthanasie de la souris.
8. Euthanasier la souris dans le bocal anesthésie avec l'isoflurane surdosage et faire attention de ne pas laisser la souris chiot à entrer en contact avec l'isoflurane. Le meilleur rendement de la cellule est obtenu lorsque les cellules sont recueillies immédiatement après la mort, afin d'éviter des micro-caillots qui se forment dans la circulation après la mort.
9. Retirer la souris dans le bocal anesthésique, sécuriser la souris au conseil d'exploitation, et stériliser la souris, les instruments et les gants avec de l'alcool.
10. Chargez le scalpel avec la lame et inciser la souris à partir du cou à l'abdomen inférieur.
11. Ouvrez l'abdomen sur le côté gauche de la souris, exposer le rein, et couper l'artère rénale pour permettre à la souris d'être exsangue, ce qui évite les caillots dans les petits vaisseaux des poumons.
12. Utilisez des ciseaux pour couper le long du côté gauche de la souris dele sternum pour ouvrir le thorax.
13. Soigneusement utiliser un scalpel pour couper la membrane des deux côtés et ouvrir complètement la cavité thoracique. Utilisez une pince ou épingles pour maintenir la cavité thoracique ouverte.
14. Collez le RV avec une aiguille 27 G ½ pouce dirigé vers le PA et perfuser le RV / PA / poumons avec du PBS stérile jusqu'à ce que les poumons apparaissent en blanc (tout le sang évacuée de la circulation pulmonaire). Cela prendra environ 3-5 ml de PBS en fonction de la taille de la souris. Il est important de rincer abord afin d'éviter la formation de caillots dans les petits vaisseaux pulmonaires.
15. Soigneusement utiliser dissection pour exposer la trachée et un fil de dessous de suture.
16. Mettre les petites pinces en dessous de la trachée pour le support et placer le angiocathéter G 24 dans la trachée. Placez le angiocathéter comme si placer un IV.
17. Fixez le angiocathéter dans la trachée avec la suture enfilée à l'étape 1.16.
18. Prenez ébullition PA agarose hors de l'eau bouillante, et inverser pour bien mélanger. Refroidir le agaroSE à environ la température du corps en faisant tourbillonner sur la glace. L'agarose a besoin pour rester en solution, mais pas si chaud que cela peut endommager les cellules de la PA.
19. Collez le RV avec un 27 G ½ pouces aiguille et perfuser le RV / PA / poumons avec PA agarose jusqu'à ce que les poumons apparaissent en gris. Les particules de fer dans le mélange agarose feront les poumons apparaissent de couleur grise. Cela prendra environ 3-5 ml de PA agarose selon la taille de la souris. Il est également important d'aller lentement que l'injection trop rapide peut provoquer la fonte de s'infiltrer dans les voies respiratoires.
20. Prenez le poumon agarose hors de l'eau bouillante et inverser pour bien mélanger. Puis refroidir la gélose à environ la température du corps en faisant tourbillonner sur la glace. L'agarose a besoin pour rester en solution, mais pas si chaud que cela peut endommager les cellules du poumon.
21. Dresser la gélose du poumon et fixer la seringue à la G angiocathéter 24 dans la trachée. Faire infuser le agarose à travers la trachée pour gonfler entièrement les poumons. Les poumons seront EASIEr pour hacher (voir étapes ultérieures) si les poumons sont gonflés de façon appropriée.
22. Retirez le bloc cœur-poumons, et le plonger dans 25 ml de PBS froid pour solidifier la gélose (~ 5 min). Utilisez ce temps pour nettoyer la zone chirurgicale.
23. Pour les souris néonatales (P7-P21), le meilleur rendement PASMC vient de la combinaison 2-3 chiots dans un lot de cellules. PASMC préfèrent être en contact avec d'autres cellules pour la santé optimale des cellules et la croissance. Si une souris est utilisée par l'isolement, puis les cellules sont très rares et ne poussent pas bien. En combinant les animaux, la récolte et refroidir les blocs de coeur-poumon ensemble et de passer ensuite à hacher une fois tous les blocs cœur-poumons ont été retirés des animaux.
24. Passez à la hotte de culture cellulaire pour la stérilité de ce point de Onward.
25. Placez les poumons réfrigérés dans le couvercle de la boîte de culture cm 10 tissus et retirer délicatement le cœur, le thymus, la trachée et les tissus conjonctif des poumons.
26. Déplacer les poumons pour le fond de la boîte de culture cm 10 tissulaireet ajouter environ 1 ml glacée PBS stérile.
27. Émincer les poumons en petits morceaux (1-2 mm) avec 2 scalpels.
28. Casser l'embout hors d'une pipette sérologique stérile de 5 ml. Pipette hachée suspension du poumon dans le tube conique stérile de 50 ml. Utilisation supplémentaire stérile PBS glacé à laver la plaque d'assurer que tout le tissu pulmonaire pénètre dans le tube conique de 50 ml.
29. Placer le tube conique de 50 ml sur l'aimant. Attendre le tissu contenant du fer pour passer à côté du tube à côté de l'aimant. Selon le rapport de la cuve contenant du fer au tissu pulmonaire, certains bateaux peuvent encore flotter à ce point. Aspirer le PBS lentement et soigneusement essaie de ne pas aspirer les tissus pulmonaires flottante, car il est difficile de savoir si elle contient des vaisseaux.
30. Laver le poumon granulés 3x avec 5 ml de PBS stérile, encore une fois essayer de réduire la quantité de tissu pulmonaire qui est aspiré.
31. Reprendre le culot dans 3 ml poumon collagénase et verser dans 60 mm boîte de culture tissulaire. Ne pasessaient de pipette ce, les morceaux de poumon colleront à l'intérieur de votre pipette.
32. Utilisation d'un 3 ml supplémentaires de rincer le tube après le coulage, et le verser dans cette boîte de 60 mm de la culture de tissus ainsi.
33. Placer dans 37 ° C incubateur de culture tissulaire pendant 1 heure.
34. Tissus pipette + collagénase boue de haut en bas avec un G émoussé aiguille sur une seringue de 5 ml 15 jusqu'à ce que tous les gros morceaux de poumon sont perturbés. Le tissu + suspension de la collagénase sera nuageux à ce point avec aucun des morceaux de tissus visibles.
35. Verser dans un nouveau tube conique stérile de 50 ml et joindre à l'aimant.
36. Laver la boîte de culture tissulaire avec environ 5 ml de M199 milieu complet pour s'assurer que tous les tissus ont été recueillis, et versez le tout dans le tube conique.
37. Aspirer la collagénase + médias surnageant. Cette fois, il y aura très peu de flotteurs, et un compact contenant du fer granulés sera sur le côté du tube conique à côté de l'aimant.
38. Laver avec 5 ml complète mediA 3x. Cela est nécessaire pour inactiver la collagénase.
39. Ajouter 3 ml de milieu complet, et mélanger monter et descendre plusieurs fois pour remettre le contenant du fer granulés.
40. Verser le culot remis en suspension dans une boîte de culture de tissu de 35 mm. Utilisation d'un microscope, il y aura des petits fragments de vaisseau flottant autour de particules de fer contenues dans la lumière du vaisseau.
41. Placez la boîte de culture tissulaire (étiqueté plaque zéro) dans l'incubateur de culture tissulaire pendant la nuit. Les premières cellules à migrer loin sur la plaque zéro sont environ 50% des fibroblastes et 50% PASMC, basé sur la coloration des marqueurs musculaires lisses. Cette plaque est appelée nulle plaqué et, finalement éliminé après les étapes d'enrichissement ultérieures.

2. Isolement de l'artère pulmonaire de souris néonatales - Day Two

1. Verser le milieu surnageant de plaque zéro dans un tube conique de 50 ml propre.
2. Aspirer le surnageant des médias. Cette fois, il n'y aura presque pas de flotteurs, et un compact fer-containing culot se forme sur le côté du tube conique en regard de l'aimant.
3. Laver avec 5 ml de milieu complet 3x.
4. Ajouter 3 ml de milieu complet, et mélanger monter et descendre plusieurs fois pour remettre le contenant du fer granulés.
5. Verser dans un plat de culture de tissu de 35 mm. En utilisant un microscope, de petits fragments de navires qui circulent avec des particules de fer contenues dans la lumière du vaisseau sont vus. Ce sera une plaque (figure 1A).
6. Placez la boîte de culture tissulaire dans l'incubateur de culture tissulaire.

3. Isolement de l'artère pulmonaire de souris néonatales - Six Jours

1. Verser le milieu surnageant de plaque l'un dans un tube conique de 50 ml propre. La répétition de cette étape plusieurs fois assure que toutes les cellules de muscles lisses qui résident dans la paroi de la cuve ont l'occasion de migrer hors sur une plaque de culture cellulaire. Il ya un rendement décroissant à chaque étape soit chaque plaque aura cellules adhèrent de moins en moins.
2. Plaque Réinsérer un avec M199 complètes médias, et remettez-les dans l'incubateur de culture tissulaire.
3. Aspirer le surnageant des médias. Cette fois, il n'y aura presque pas de flotteurs, et un compact contenant du fer culot se forme sur le côté du tube conique à côté de l'aimant.
4. Laver avec 5 ml de milieu complet 3x.
5. Ajouter 3 ml de milieu complet, et mélanger monter et descendre plusieurs fois pour remettre le contenant du fer granulés.
6. Verser dans un plat de culture de tissu de 35 mm. En utilisant un microscope, de petits fragments de navires qui circulent avec des particules de fer contenues dans la lumière du vaisseau sont vus. Ce sera deux plaques.
7. Placez la boîte de culture tissulaire dans l'incubateur de culture tissulaire.

4. Isolement de l'artère pulmonaire de souris néonatales - Day Nine

1. Verser le surnageant de support de la plaque de boîte de culture tissulaire deux dans un tube conique de 50 ml propre.
2. Plaque réalimentation deux avec M199 milieux complets, et remettez-les dans la culture de tissusincubateur.
3. Aspirer le surnageant des médias. Cette fois, il n'y aura presque pas de flotteurs, et un compact contenant du fer culot se forme sur le côté du tube conique à côté de l'aimant.
4. Laver avec 5 ml de milieu complet 3x.
5. Ajouter 3 ml de milieu complet et mélanger monter et descendre plusieurs fois pour remettre le contenant du fer granulés.
6. Verser dans un plat de culture de tissu de 35 mm. En utilisant un microscope, de petits fragments de navires qui circulent avec des particules de fer contenues dans la lumière du vaisseau sont vus. Ce sera la plaque trois.
7. Placez la boîte de culture tissulaire dans l'incubateur de culture tissulaire.

5. Isolement de l'artère pulmonaire de souris néonatales - Treizième jour

1. Aspirer les médias hors de plaques 1-3.
2. Lavez délicatement les cellules au chaud, PBS stérile.
3. Ajouter un film mince de la trypsine (~ 0,25 à 0,5 ml), de la trypsine pour chaque plaque à trypsiniser hors des cellules. Les cellules sont très adhérentes et devront être à la trypsine dans la cultu tissulairere incubateur pendant environ 10 min à décoller de la plaque.
4. Récolte des cellules situées au large des plaques dans 5 ml de milieu complet dans un tube conique de 50 ml attachés à l'aimant de se retirer toutes les particules de fer résiduel.
5. Laver chacune des plaques avec un supplément de 0,5 ml de milieu complet et ajouter ce support au tube conique de 50 ml.
6. Cette fois, prenez le surnageant médias (ne pas aspirer) et jeter le culot de particules de fer.
7. Plaque les cellules dans 5 ml complets M199 médias dans une boîte de 60 mm d'avoir cellules confluentes dans quelques jours. Sinon, plaque les cellules dans 10 ml complets M199 médias dans une plaque de 10 cm, et PASMC auront encore environ 1-2 semaines pour atteindre la confluence.

6. Isolement de l'artère pulmonaire de souris néonatales - quatorze jours

1. Modifiez les médias pour M199 milieux frais complets pour enlever toute la trypsine résiduelle. Il y aura une faible population de PASMC sur la boîte de culture tissulaire (figure 1B).

7. Entretien de routine

1. Modifiez les médias pour M199 milieux frais complets d'environ 2 fois par semaine.
2. Lors de la séparation de ces cellules, environ 10 min dans l'incubateur dans un film de trypsine (0,25-0,5 ml) est nécessaire pour les cellules à se décoller de la plaque. En utilisant le film trypsine permet réensemencement de la PASMC sans filer vers le bas les cellules. Si trop de trypsine est utilisé, le PASMC doit être centrifugé pour échapper à la trypsine, ou les cellules ne readhere à la plaque. Parfois, après le filage bas des cellules, il est difficile d'obtenir la remise en suspension dans PASMC M199 milieux complets.
3. Dans ses observations, le PASMC isolé se comporter comme des cellules musculaires lisses de manière fiable pour 4-5 passages, mais les cellules isolées va tacher de cellules musculaires lisses Marqueurs jusqu'à passage 7. Comptez le premier regroupé 60 mm ou 10 cm sur plaque de treize jours en tant que passage 2 (placage après la première exposition à la trypsine).

Résultats

Pendant et après l'isolement, PASMC sont examinés à la fois par microscopie optique et par immunomarquage pour les marqueurs de cellules musculaires lisses. Par microscopie optique tôt dans le protocole, PASMC sont vus migration sur la boîte de culture de tissu du petit fer contenant navires (figure 1A). Après la mise en commun des plaques un à trois sur treize jours, puis les particules de fer ne sont plus considérés comme ceux-ci ont été retirées dans l'étape finale de mise en com...

Discussion

Dans ce manuscrit, nous décrivons pour la première fois l'isolement de PASMC de souris à P7, P14, P21 et. Pour ce faire, une suspension d'agarose et 0,2 particules de fer pm sont infusé à travers la RV dans le PA. En raison de la petite taille des particules de fer, ils ne peuvent pas passer à travers le lit capillaire pulmonaire et sont donc déposés dans la petite PA. Les poumons sont gonflés, enlevés et dissociés. Les récipients contenant du fer sont retirés de la solution à l'aide d'un a...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bard Parker surgical blade handle	BD	371030
Stainless steel surgical blades #10 (sterile)	Miltex	4-310
Syringes (3 ml and 5 ml, sterile)	BD	309657 and 306646
Needles (27 G, sterile)	BD	305109
Angiocatheter (24 G, sterile)	BD	381412
Monoject blunt cannula (15 G)	Kendall	SWD202314Z
Sutures	Fisher Scientific	NC9782896
Dynal magnet particle collector	Invitrogen	120-01D	This is a critical tool for the protocol.
Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile)	BD	353001, 353004, and 353003	Any brand of tissue culture plates will be fine.
Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel)	American Diagnostic Corporation	3424
Forceps (4 inch stainless steel)	Quick Medical	L5-5004
D-PBS	Mediatech	21-031-CV
M199 media	Mediatech	10-060-CV
Penicillin/streptomycin	VWR	TX16777-164NWU
Fetal bovine serum	Hyclone/Thermo Scientific	SH3091003	Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor.
Iron particles (iron (II, III) oxide powder)	Aldrich Chemical Company	#31,006-9
Agarose	Sigma	A9539
Collagenase (made to 80 U/ml)	Sigma	C5138
Isoflurane	Butlet Schein	NDC 11695-6776-1
Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera	Nikon	TE2000-U	Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture.
Anti-desmin antibody	Sigma	D-8281	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Anti-smooth muscle myosin	Biomedical Technologies	BT-562	Use at 1:2,000 dilution for immunostaining.
Rhodamine-red anti-rabbit secondary	Molecular Probes/Invitrogen	R-6394	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera	Nikon	TE300	Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining.
Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit	Enzo Life Sciences	BML-AK800-0001	This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available.
Sildenafil	Sigma	PZ-0003	A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis.