Isolamento di polmonare cellule muscolari lisce di topi neonati

Riepilogo

Abbiamo sviluppato una nuova tecnica e riproducibile per isolare colture primarie di cellule muscolari lisce delle arterie polmonari (PASMC) da topi giovani come P7, consentendo in tal modo una migliore studio delle vie di segnalazione coinvolte nella contrazione delle cellule muscolari lisce neonatale e relax.

Abstract

L'ipertensione polmonare è una causa importante di morbilità e mortalità nei neonati. Storicamente, sono stati fatti significativi studio delle vie di segnalazione coinvolte nella contrazione del muscolo liscio vascolare in PASMC di pecora fetale. Mentre pecore fanno un eccellente modello di ipertensione polmonare termine, sono molto costosi e non hanno il vantaggio di manipolazione genetica presente nei topi. Viceversa, l'incapacità di isolare PASMC da topi era una limitazione significativa di tale sistema. Qui abbiamo descritto l'isolamento di colture primarie di topo PASMC da P7, P14, P21 e topi utilizzando una variazione della tecnica precedentemente descritta di Marshall et al. ²⁶ precedentemente utilizzato per isolare ratto PASMC. Questi PASMC murino rappresentare un nuovo strumento per lo studio delle vie di segnalazione nel periodo neonatale. Brevemente, un impasto di 0,5% (w / v) di agarosio + 0,5% di particelle di ferro in M199 media sta infuse nel letto vascolare polmonare attraverso il ventricolo destro (RV). Gliparticelle di ferro sono 0,2 micron di diametro e non possono passare attraverso il letto capillare polmonare. Così, le logge di ferro nelle piccole arterie polmonari (PA). I polmoni sono gonfiati con agarosio, rimosso e dissociato. I vasi contenenti ferro sono tirato giù con una calamita. Dopo collagenasi (80 U / ml) e l'ulteriore trattamento dissociazione, i vasi vengono posti in coltura tissutale in piatto M199 terreni contenenti il ​​20% di siero fetale bovino (FBS) e antibiotici (M199 mezzi completi) per consentire la migrazione delle cellule nel piatto di coltura . Questa piastra iniziale di cellule è una miscela 50-50 di fibroblasti e PASMC. Così, la discesa procedura è ripetuta più volte per ottenere una popolazione PASMC più puro e rimuovere eventuali residui di ferro. Smooth identità delle cellule muscolari è confermata da immunoistochimica per la muscolatura liscia e miosina desmin.

Introduzione

Ipertensione polmonare è normale durante la vita intrauterina poiché la placenta funge da organo principale di scambio di gas e solo il 10% della gittata cardiaca viene fatto circolare attraverso il letto vascolare polmonare. In utero, pressione polmonare sono simili alle pressioni sistemiche dovute a elevata resistenza vascolare polmonare . Come gestazione progredisce, vi è una rapida crescita del piccolo PA all'interno del polmone, preparando il feto per il drammatico aumento del flusso sanguigno polmonare che si verifica alla nascita ^1. Quando la normale transizione perinatale fallisce nei neonati a breve termine e pieno termine, il risultato è l'ipertensione polmonare persistente del neonato (PPHN). PPHN è una sindrome clinica causata da molte diverse patologie sottostanti. Tuttavia, tutti questi bambini condividono caratteristiche fisiopatologiche comuni come l'elevata resistenza vascolare polmonare, ipossiemia, e shunt da destra a sinistra del flusso di sangue attraverso le connessioni persistenti fetali come il dotto arterioso o peramen ovale. PPHN colpisce 2-6 per 1.000 nati vivi e trasmette un rischio 8-10% di mortalità, così come significative a breve termine e lungo termine morbilità ^2. Inoltre, molto basso peso alla nascita i neonati prematuri possono sviluppare ipertensione polmonare come conseguenza della loro malattia polmonare sottostante. La più comune malattia polmonare sottostante dei neonati prematuri è displasia broncopolmonare (BPD). Mentre il rischio complessivo di BPD è correlata con l'età gestazionale e peso alla nascita, non è chiaro perché un sottoinsieme di questi bambini si sviluppa ipertensione polmonare significativa e come trattare in modo appropriato questi bambini. Scarsi risultati, tra ricoveri ospedalieri prolungati e aumento della mortalità, sono comuni ^3-6.

Storicamente, ovina PASMC fetale o suina PASMC fetale da animali sani sono stati utilizzati per studiare le vie di segnalazione coinvolte nel normale transizione vascolare polmonare dopo la nascita. Questi sono tipicamente isolati da quinta resistenza PA generazione di unn ovina o suina feto che viene consegnato ed eutanasia prima di ogni respirazione spontanea ^7-9. Inoltre, alcuni ricercatori hanno isolato e utilizzato PASMC da leggermente più vecchio e respiro spontaneo agnelli e maialini a 3 giorni, 2 settimane e 4 settimane ^10-12. Più recentemente, alcuni gruppi hanno isolato con successo ed utilizzato PASMC isolato da agnelli con PPHN per esaminare le alterazioni in vie di segnalazione dello stato della malattia ^13-17. Queste cellule hanno dimostrato di essere un valido strumento per esaminare quali vie di segnalazione sono cruciali sia nel sistema vascolare polmonare normale e malato breve termine e durata. Tuttavia, essi non danno comprensione nei percorsi di segnalazione impattati nei neonati prematuri con ipertensione polmonare. Né permettono le possibilità di manipolazione genetica visto in modelli murini di malattia.

Modelli di ratto e di topo sono stati a lungo utilizzati per modello BPD e più di recente vengono utilizzati per hy polmonare modellopertension derivanti da BPD ^18-22. Ratti neonati sono allettanti per lavorare con per la loro dimensione più grande, ma soffrono anche per la mancanza di potenziale di modificazione genetica. Animali geneticamente modificati sono stati ampiamente utilizzati per studiare gli effetti di specifici obiettivi del gene su tutta la fisiologia degli animali in topi neonati, ma fino ad oggi nessuno ha precedentemente isolato con successo PASMC da questi piccoli topi. Isolando PASMC, maggiori informazioni sono disponibili su come percorsi cambiano in risposta a stimoli ambientali e / o di modificazione genetica in particolare nella muscolatura liscia arteriosa polmonare. Ulteriormente, vivo PASMC può essere ripreso in tempo reale per esaminare rapidi cambiamenti molecole di segnalazione chiave come calcio e specie reattive ^23-25. Recentemente abbiamo descritto l'isolamento di successo di PASMC da topi adulti utilizzando una variazione della tecnica di Marshall et al. ²⁶ usato per isolare ratto PASMC ^23,25,26. Ora abbiamo adattato unnd esteso questa tecnica per piccoli topi 7-21 giorni di età (P7, P14 e P21). Il limite principale di questa nuova tecnica di isolamento PASMC è che richiede mouse multipli per generare cellule sufficiente per esperimenti e che le cellule crescono molto lentamente, che è caratteristica delle cellule muscolari lisce primarie. Nonostante questi limiti, crediamo che questa tecnica per isolare neonatale PASMC del mouse consentirà la migliore ricerca delle vie di segnalazione chiave coinvolti nello sviluppo di ipertensione polmonare e rappresenta un significativo passo avanti in questo campo.

Protocollo

La cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la Northwestern University hanno approvato questo protocollo.

1. Pulmonary Artery Isolamento da topi neonati - Day One

1. Preparare i completi M199 media - Mix 400 ml M199 con 100 ml (concentrazione finale = 20%) di calore FBS inattivato e 5 ml (concentrazione finale = 1%) penicillina / streptomicina.
2. Preparare i livelli di free M199 Media - Mix 500 ml M199 con 5 ml (concentrazione finale = 1%) penicillina / streptomicina.
3. Preparare la PA agarosio - Mix 0,05 g di agarosio, più 0.05 g particelle di ferro in 10 ml sterili, privi di siero M199 media.
4. Preparare il polmone agarosio - Mix 0.1 g di agarosio in 10 ml sterili, privi di siero M199 media.
5. Preparare la Collagenasi - Mix collagenasi in sterili, senza siero M199 supporti ad una concentrazione finale di 80 U / ml e poi filtro sterile questa miscela.
6. Impostare tutte le attrezzature prima del tempo prima di eutanasia il mouse.
7. Set PA agarosio e polmone agarosio a bollire a destra prima di eutanasia il mouse.
8. Euthanize il mouse nel vaso anestesia con isoflurano overdose e fare attenzione a non lasciare il mouse cucciolo a venire in contatto con l'isoflurano. La resa migliore cella si ottiene quando le cellule sono raccolte immediatamente dopo la morte per evitare micro-coaguli che si formano nella circolazione dopo la morte.
9. Rimuovere il mouse dal vaso anestetico, fissare il mouse al bordo di funzionamento, e sterilizzare il mouse, strumenti e guanti con l'alcol.
10. Caricare il bisturi con la lama e incidere il mouse dal collo all'addome inferiore.
11. Aprire l'addome sul lato sinistro del mouse, esporre il rene, e tagliare l'arteria renale per permettere il mouse per exsanguinate, evitando così la formazione di coaguli nei piccoli vasi dei polmoni.
12. Usare le forbici per tagliare lungo il lato sinistro del toposterno per aprire il torace.
13. Usare con attenzione bisturi per tagliare il diaframma su entrambi i lati e aprire completamente la cavità toracica. Usare pinze o perni per tenere la cavità toracica aperta.
14. Attaccare il camper con un 27 G ½ pollice ago diretto verso la PA e nei profumi della RV / PA / polmoni con PBS sterile fino a quando i polmoni appaiono bianchi (tutto il sangue lavata della circolazione polmonare). Ciò richiederà circa 3-5 ml di PBS a seconda delle dimensioni del mouse. È importante lavare prima per prevenire la formazione di coaguli nei piccoli vasi polmonari.
15. Usare con attenzione smussa per esporre la trachea e filo uno sotto di sutura.
16. Mettete le pinze più piccole sotto la trachea per il supporto e posizionare il angiocatheter 24 G nella trachea. Posizionare il angiocatheter come se mettendo una flebo.
17. Fissare il angiocatheter nella trachea con la sutura infilato nel passo 1.16.
18. Fate bollire PA agarosio di acqua bollente, e miscelare bene. Raffreddare la AgaroSE a circa temperatura corporea agitando il ghiaccio. L'agarosio deve rimanere in soluzione ma non essere così caldo che danneggia le cellule della PA.
19. Attaccare il camper con un 27 G ½ ago pollici e profumato il RV / PA / polmoni con PA agarosio fino a quando i polmoni appaiono grigie. Le particelle di ferro nella miscela agarosio renderanno i polmoni appaiono di colore grigio. Ciò richiederà circa 3-5 ml di agarosio PA seconda delle dimensioni del mouse. E 'anche importante procedere lentamente come iniettando troppo veloce potrebbe causare il ferro di infiltrarsi nella vie aeree.
20. Prendere l'agarosio polmone di acqua bollente e miscelare bene. Poi raffreddare l'agarosio a circa temperatura corporea agitando il ghiaccio. L'agarosio deve rimanere in soluzione ma non essere così caldo che danneggia le cellule del polmone.
21. Redigere l'agarosio polmone e allegare la siringa al angiocatheter G 24 nella trachea. Infondere l'agarosio attraverso la trachea per gonfiare completamente i polmoni. I polmoni saranno easier per tritare (vedi punti successivi) se i polmoni sono opportunamente gonfiati.
22. Rimuovere il blocco cuore-polmone, e immergerlo in 25 ml di PBS freddo ghiaccio a solidificare l'agarosio (~ 5 min). Utilizzare questo tempo per ripulire l'area chirurgica.
23. Per i topi neonati (P7-P21), il miglior rendimento PASMC deriva dalla combinazione di 2-3 cuccioli in una serie di celle. PASMC preferiscono essere in contatto con altre cellule per la salute e la crescita cellulare ottimale. Se un mouse viene utilizzato per l'isolamento, allora le cellule sono molto scarse e non crescono bene. Quando si combinano gli animali, raccolta e raffreddare i blocchi cuore-polmone insieme e poi passare a tritare una volta tutti i blocchi di cuore-polmone sono stati rimossi dagli animali.
24. Passare alla cappa coltura cellulare per la sterilità da questo punto in poi.
25. Collocare i polmoni refrigerati nel coperchio del piatto di coltura 10 cm tissutale e trasferire il cuore, timo, trachea, e qualsiasi tessuto connettivo dai polmoni.
26. Spostare i polmoni al fondo del piatto di coltura 10 cm tissutalee aggiungere circa 1 ml ghiacciata PBS sterile.
27. Tritare i polmoni in pezzi molto piccoli (1-2 mm) con 2 bisturi.
28. Rompere la punta fuori di una sterile 5 ml pipetta sierologica. Pipetta tritata liquami polmone in sterile da 50 ml tubo conico. Utilizzare ulteriori sterile PBS freddo per lavare la piastra per assicurare che tutto il tessuto polmonare entra nel tubo da 50 ml.
29. Collocare la provetta da 50 ml sul magnete. Attendere per il tessuto contenente ferro per spostarsi lato del tubo vicino al magnete. A seconda del rapporto di contenente ferro vaso di tessuto polmonare, alcune delle navi possono ancora essere galleggiante, a questo punto. Aspirare il PBS fuori lentamente e con attenzione cercando di non aspirare il tessuto polmonare fluttuante poiché non è chiaro se contiene vasi.
30. Lavare il pellet polmone 3x con 5 ml di PBS sterile, nuovamente cercando di minimizzare la quantità di tessuto polmonare che viene aspirato.
31. Risospendere il pellet polmonare in 3 ml di collagenasi e versare in 60 millimetri piatto di coltura di tessuti. Noncercano di dispensare questo, i pezzi di polmone si attacchi al l'interno della vostra pipetta.
32. Utilizzare un ulteriore 3 ml per sciacquare il tubo dopo la colata, e versare questo in 60 millimetri piatto di coltura di tessuti pure.
33. Luogo in 37 ° C di coltura tissutale incubatore per 1 ora.
34. Pipetta tessuto + collagenasi slurry su e giù con una G 15 smussato ago su una siringa da 5 ml fino a quando tutti i grandi pezzi polmonari sono interrotti. Il tessuto + collagenasi impasto sarà nuvoloso, a questo punto, senza pezzi di tessuto visibili.
35. Versare in una nuova sterile da 50 ml tubo conico e si attaccano al magnete.
36. Lavare il piatto di coltura tissutale con circa 5 ml di mezzi completi M199 per assicurare che tutto il tessuto sono stati raccolti, e versare questo nel tubo conico.
37. Aspirare al largo della collagenasi + supporti surnatante. Questa volta ci sarà molto poche miodesopsie, e un compatto contenente ferro pellet sarà sul lato del tubo conico accanto al magnete.
38. Lavare con 5 ml completo media 3x. Questo è necessario per inattivare la collagenasi.
39. Aggiungere 3 ml di mezzi completi, e mescolare su e giù un paio di volte per risospendere il pellet contenente ferro.
40. Versare il sedimento risospeso in un piatto di coltura di tessuti di 35 mm. Utilizzando un microscopio, ci saranno piccoli frammenti galleggiamento sia intorno con particelle di ferro contenute nel lume del vaso.
41. Posizionare la cultura piatto tessuto (etichettato piastra zero) nel tessuto culturale incubatore durante la notte. Le prime cellule a migrare fuori sulla piastra pari a zero sono circa il 50% e il 50% fibroblasti PASMC, sulla base di colorazione per i marcatori muscolari lisce. Questa piastra è chiamato a zero placcato ed infine scartato dopo i passi successivi arricchimento.

2. Pulmonary Artery Isolamento da topi neonati - Day Two

1. Versate i media surnatante da piastra a zero in un tubo da 50 ml conica pulito.
2. Aspirare il surnatante media. Questa volta non ci sarà quasi nessuna mosche volanti, e una compatta di ferro containing pellet formerà sul lato del tubo conico accanto al magnete.
3. Lavare con 5 ml di mezzi completi 3x.
4. Aggiungere 3 ml di mezzi completi, e mescolare su e giù un paio di volte per risospendere il pellet contenente ferro.
5. Versare in un piatto di coltura di tessuti di 35 mm. Utilizzando un microscopio, piccoli frammenti di vasi che galleggiano intorno con particelle di ferro contenute nel lume del vaso si vedono. Questo sarà una piastra (Figura 1A).
6. Posizionare il piatto di coltura tissutale nella coltura tissutale incubatore.

3. Pulmonary Artery Isolamento da topi neonati - Sesto giorno

1. Versare il supporto supernatante dal piatto uno in una provetta conica da 50 ml pulito. Ripetendo questa operazione più volte assicura che tutte le cellule muscolari lisce residenti nella parete del vaso abbiano la possibilità di migrare via sopra una piastra di coltura cellulare. C'è un ritorno diminuendo con ogni passo cioè ogni piatto avrà sempre meno cellule aderiscono.
2. Refeed piatto uno con completi M199 media, e il luogo di nuovo nel tessuto culturale incubatore.
3. Aspirare il surnatante media. Questa volta non ci saranno quasi nessun miodesopsie, e un compatto contenente ferro pellet si forma sul lato del tubo conico accanto al magnete.
4. Lavare con 5 ml di mezzi completi 3x.
5. Aggiungere 3 ml di mezzi completi, e mescolare su e giù un paio di volte per risospendere il pellet contenente ferro.
6. Versare in un piatto di coltura di tessuti di 35 mm. Utilizzando un microscopio, piccoli frammenti di vasi che galleggiano intorno con particelle di ferro contenute nel lume del vaso si vedono. Questo sarà piastra due.
7. Posizionare il piatto di coltura tissutale nella coltura tissutale incubatore.

4. Pulmonary Artery Isolamento da topi neonati - Nono giorno

1. Versare il surnatante multimediale dal tessuto cultura piatto piatto due in un tubo da 50 ml conica pulito.
2. Piastra refeed due con completi M199 media, e posto di nuovo nel tessuto della culturaincubatrice.
3. Aspirare il surnatante media. Questa volta non ci saranno quasi nessun miodesopsie, e un compatto contenente ferro pellet si forma sul lato del tubo conico accanto al magnete.
4. Lavare con 5 ml di mezzi completi 3x.
5. Aggiungere 3 ml di mezzi completi e mescolare su e giù un paio di volte per risospendere il pellet contenente ferro.
6. Versare in un piatto di coltura di tessuti di 35 mm. Utilizzando un microscopio, piccoli frammenti di vasi che galleggiano intorno con particelle di ferro contenute nel lume del vaso si vedono. Questo sarà piastra tre.
7. Posizionare il piatto di coltura tissutale nella coltura tissutale incubatore.

5. Pulmonary Artery Isolamento da topi neonati - Day Thirteen

1. Aspirare i media off di piastre 1-3.
2. Lavare delicatamente le cellule con il caldo, PBS sterile.
3. Aggiungi una sottile pellicola di tripsina (~ 0,25-0,5 ml) tripsina ad ogni piatto per trypsinize le cellule. Cellule sono molto aderente e dovranno essere in tripsina nel tessuto culri incubatrice per circa 10 minuti per sollevare la piastra.
4. Celle di raccolta al largo delle piastre in 5 ml mezzi completi in una provetta da 50 ml attaccato al magnete per estrarre eventuali particelle di ferro residuo.
5. Lavare ciascuna delle piastre con un ulteriore 0,5 ml di mezzi completi e aggiungere quel supporto per il tubo da 50 ml.
6. Questa volta, prendere il surnatante dei media (non aspirare), e scartare il ferro particella pellet.
7. Piastra le cellule in 5 ml completi M199 media in un piatto di 60 millimetri di avere cellule confluenti in pochi giorni. In alternativa, la piastra le cellule in 10 ml completi M199 media in un cm piastra 10 e PASMC prenderanno circa altre 1-2 settimane per raggiungere confluenza.

6. Pulmonary Artery Isolamento da topi neonati - Day Fourteen

1. Cambiare il supporto per nuovi completi M199 mezzi per rimuovere ogni residuo di tripsina. Ci sarà una popolazione sottile di PASMC sulla coltura tissutale piatto (Figura 1B).

7. Routine Cura

1. Cambiare il supporto per nuovi completi M199 dei media circa 2 volte a settimana.
2. Quando si divide queste cellule, sono richieste circa 10 min in incubatrice in un film di tripsina (0,25-0,5 ml) per le cellule per sollevare la piastra. Utilizzando il film tripsina permette replating del PASMC senza far mai fermare le cellule. Se viene usato troppo tripsina, allora il PASMC devono essere centrifugate a girare la tripsina, o le cellule non readhere alla piastra. A volte, dopo la filatura giù per le cellule, è difficile ottenere il PASMC risospeso in completi M199 media.
3. Nelle osservazioni, il PASMC isolato si comportano come le cellule muscolari lisce in modo affidabile per 4-5 passaggi, ma le cellule isolate si macchia di cellule muscolari lisce marcatori fino al passaggio 7. Contare il primo pool di 60 millimetri o 10 cm Piatto del giorno tredici come passaggio 2 (placcatura dopo la prima esposizione a tripsina).

Risultati

Durante e dopo l'isolamento, PASMC sono esaminate sia al microscopio ottico e da immunoistochimica per marcatori di cellule muscolari lisce. Al microscopio ottico all'inizio del protocollo, PASMC sono visti migrazione sulla cultura piatto tessuto dal piccolo ferro contenente vasi (Figura 1A). Dopo la messa in comune piastre da uno a tre il giorno tredici, poi le particelle di ferro non sono più visti come quelli che sono stati tirati fuori nella fase finale di messa in comune. Invece, una popol...

Discussione

In questo manoscritto, si descrive per la prima volta l'isolamento di PASMC da topi a P7, P14, e P21. Per ottenere questo risultato, un impasto di agarosio e 0,2 particelle di ferro m sono infusa attraverso il camper nella PA. A causa della piccola dimensione delle particelle di ferro, non possono passare attraverso il letto capillare polmonare e sono quindi depositati nel piccolo PA. I polmoni sono gonfiati, rimossi e dissociato. I vasi contenenti ferro sono estratti di soluzione con un magnete. In definitiva, i va...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bard Parker surgical blade handle	BD	371030
Stainless steel surgical blades #10 (sterile)	Miltex	4-310
Syringes (3 ml and 5 ml, sterile)	BD	309657 and 306646
Needles (27 G, sterile)	BD	305109
Angiocatheter (24 G, sterile)	BD	381412
Monoject blunt cannula (15 G)	Kendall	SWD202314Z
Sutures	Fisher Scientific	NC9782896
Dynal magnet particle collector	Invitrogen	120-01D	This is a critical tool for the protocol.
Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile)	BD	353001, 353004, and 353003	Any brand of tissue culture plates will be fine.
Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel)	American Diagnostic Corporation	3424
Forceps (4 inch stainless steel)	Quick Medical	L5-5004
D-PBS	Mediatech	21-031-CV
M199 media	Mediatech	10-060-CV
Penicillin/streptomycin	VWR	TX16777-164NWU
Fetal bovine serum	Hyclone/Thermo Scientific	SH3091003	Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor.
Iron particles (iron (II, III) oxide powder)	Aldrich Chemical Company	#31,006-9
Agarose	Sigma	A9539
Collagenase (made to 80 U/ml)	Sigma	C5138
Isoflurane	Butlet Schein	NDC 11695-6776-1
Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera	Nikon	TE2000-U	Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture.
Anti-desmin antibody	Sigma	D-8281	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Anti-smooth muscle myosin	Biomedical Technologies	BT-562	Use at 1:2,000 dilution for immunostaining.
Rhodamine-red anti-rabbit secondary	Molecular Probes/Invitrogen	R-6394	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera	Nikon	TE300	Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining.
Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit	Enzo Life Sciences	BML-AK800-0001	This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available.
Sildenafil	Sigma	PZ-0003	A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis.