El aislamiento de la arteria pulmonar células musculares lisas de los ratones recién nacidos

Resumen

Hemos desarrollado una técnica novedosa y reproducibles para aislar los cultivos primarios de células musculares lisas de las arterias pulmonares (PASMC) a partir de ratones tan jóvenes como de P7, permitiendo de ese modo un mejor estudio de las vías de señalización implicadas en la contracción de las células del músculo liso neonatal y relajación.

Resumen

La hipertensión pulmonar es una causa importante de morbilidad y mortalidad en recién nacidos. Históricamente, ha habido estudio significativo de las vías de señalización implicadas en la contracción del músculo liso vascular en PASMC de oveja fetal. Mientras ovejas crea un excelente modelo de hipertensión pulmonar plazo, que son muy caros y carecen de la ventaja de la manipulación genética que se encuentra en ratones. Por el contrario, la incapacidad de aislar PASMC de los ratones era una limitación significativa de ese sistema. Aquí hemos descrito el aislamiento de cultivos primarios de ratón PASMC desde P7, P14, y P21 ratones usando una variación de la técnica descrita anteriormente de Marshall et al. ²⁶ que se utilizó anteriormente para aislar PASMC rata. Estos PASMC murino representan una nueva herramienta para el estudio de las vías de señalización en el período neonatal. Brevemente, una suspensión de 0,5% (w / v) de agarosa + 0,5% de partículas de hierro en medio M199 se infunden en el lecho vascular pulmonar a través del ventrículo derecho (VD). Lapartículas de hierro son 0,2 m de diámetro y no pueden pasar a través del lecho capilar pulmonar. Por lo tanto, las logias de hierro en las pequeñas arterias pulmonares (PA). Los pulmones se inflan con agarosa, y se disocia. Los vasos que contienen hierro se tiran hacia abajo con un imán. Después de la colagenasa (80 U / ml) el tratamiento y aún más la disociación, los vasos se colocan en un plato de cultivo de tejidos en medio M199 que contienen 20% de suero bovino fetal (FBS), y antibióticos (medio M199 completos) para permitir la migración de células en la placa de cultivo . Esta placa inicial de las células es una mezcla 50-50 de fibroblastos y PASMC. Por lo tanto, el procedimiento de extracción hacia abajo se repite varias veces para lograr una población PASMC más pura y eliminar todo el hierro residual. Identidad de la célula del músculo liso se confirmó mediante inmunotinción para la miosina del músculo liso y desmina.

Introducción

La hipertensión pulmonar es normal durante la vida intrauterina desde la placenta sirve como el principal órgano de intercambio de gas y se hace circular sólo el 10% del gasto cardíaco a través del lecho vascular pulmonar. En el útero, las presiones pulmonares son similares a las presiones sistémicas debido a la elevación de la resistencia vascular pulmonar . Como gestación progresa, hay un rápido crecimiento de la pequeña PA dentro del pulmón, la preparación del feto para el dramático aumento en el flujo sanguíneo pulmonar que se produce en el nacimiento ^1. Cuando la transición perinatal normal de falla en los bebés a corto plazo y de plazo completo, el resultado es la hipertensión pulmonar persistente del recién nacido (PPHN). HPP es un síndrome clínico causado por diferentes patologías de base. Sin embargo, todos estos lactantes comparten características fisiopatológicas comunes, tales como elevada resistencia vascular pulmonar, hipoxemia, y derivación de derecha a izquierda del flujo de sangre a través de conexiones fetales persistentes, tales como el conducto arterioso o paraAmén ovale. PPHN afecta a 2-6 por cada 1.000 nacidos vivos y transmite un riesgo 8-10% de la mortalidad y la morbilidad significativa a corto plazo y largo plazo ^2. Además, los bebés prematuros de muy bajo peso pueden desarrollar hipertensión pulmonar como resultado de su enfermedad pulmonar subyacente. La enfermedad pulmonar subyacente más común de los bebés prematuros es la displasia broncopulmonar (DBP). Mientras que el riesgo general de BPD se correlaciona con la edad gestacional y el peso al nacer, no está claro por qué un subconjunto de estos niños desarrollan hipertensión pulmonar importante y cómo tratar adecuadamente a estos niños. Los malos resultados, incluyendo estancias hospitalarias prolongadas y aumento de la mortalidad, son comunes ^3-6.

Históricamente, PASMC fetal ovina o PASMC fetal porcino procedente de animales sanos se han utilizado para estudiar las vías de señalización implicadas en la transición vascular pulmonar normal después del nacimiento. Estos son típicamente aislados de resistencia PA de quinta generaciónn ovina o porcina feto que se entrega y sacrificados antes de cualquier respiración espontánea ^7-9. Además, algunos investigadores han aislado y utilizado PASMC desde un poco más viejo y con respiración espontánea corderos y lechones a los 3 días, 2 semanas y 4 semanas ^10-12. Más recientemente, algunos grupos han aislado y utilizado con éxito PASMC aislado de corderos con hipertensión pulmonar persistente para examinar las alteraciones en las vías de señalización en el estado de la enfermedad ^13-17. Estas células han demostrado ser una herramienta valiosa para estudiar las vías de señalización que son cruciales tanto en la vasculatura pulmonar normal y enfermo a corto plazo y de plazo. Sin embargo, no se dan una idea de las vías de señalización afectadas en los bebés prematuros con hipertensión pulmonar. Tampoco permiten que las posibilidades de manipulación genética visto en los modelos de ratón de la enfermedad.

Modelos de rata y el ratón han sido utilizados para modelar BPD y más recientemente se están utilizando para modelar hy pulmonarpertensión resultante de BPD ^18-22. Ratas neonatales son muy atractivos para trabajar con debido a su mayor tamaño, sino que también sufren de falta de potencial para la modificación genética. Los animales genéticamente modificados se han utilizado ampliamente para investigar los efectos de los objetivos específicos de genes en la fisiología animal entero en ratones recién nacidos, pero hasta la fecha nadie ha aislado previamente con éxito PASMC de estos pequeños ratones. Al aislar PASMC, mayor información se puede obtener acerca de cómo las vías cambian en respuesta a los estímulos ambientales y / o la modificación genética específicamente en el músculo liso de la arteria pulmonar. Además, en vivo PASMC se pueden obtener imágenes en tiempo real para examinar los cambios rápidos en las moléculas de señalización clave, tales como el calcio y las especies reactivas de oxígeno ^23-25. Recientemente hemos descrito el aislamiento con éxito de PASMC a partir de ratones adultos usando una variación de la técnica de Marshall et al. ²⁶ utilizado para aislar rata PASMC ^23,25,26. Ahora hemos adaptado unND extendió esta técnica para pequeños ratones 7-21 días de edad (P7, P14, y P21). La principal limitación de esta nueva técnica de aislamiento PASMC es que requiere varios ratones para generar suficientes células para los experimentos y que las células crecen muy lentamente, lo que es característico de las células musculares lisas primarias. A pesar de estas limitaciones, creemos que esta técnica para aislar neonatal PASMC ratón permitirá la mayor investigación sobre las vías de señalización clave que participan en el desarrollo de la hipertensión pulmonar y representa un avance significativo en este campo.

Protocolo

El animal de Atención Institucional y el empleo Comisión de la Universidad Northwestern aprobaron este protocolo.

1. Arteria Pulmonar Aislamiento de ratones recién nacidos - Day One

1. Preparar las completas medio M199 - M199 Mix 400 ml con 100 ml (concentración final = 20%) FBS inactivado por calor y 5 ml (concentración final = 1%) Penicilina / Estreptomicina.
2. Preparar los Libres en Suero M199 Media - Mezcla 500 ml M199 con 5 ml (concentración final = 1%), penicilina / estreptomicina.
3. Preparar la agarosa PA - Mix 0,05 g de agarosa, más 0,05 g de partículas de hierro en 10 ml estériles, medio M199 libre de suero.
4. Preparar el pulmón de agarosa - Mezclar 0,1 g de agarosa en 10 ml estériles, medio M199 libre de suero.
5. Preparar la colagenasa - colagenasa mezcla estériles, en medio M199 libre de suero a una concentración final de 80 U / ml y después se filtro estéril de esta mezcla.
6. Configurar todos los equipos antes de tiempo antes de la eutanasia con el ratón.
7. Set PA agarosa y pulmón agarosa a ebullición justo antes de la eutanasia con el ratón.
8. La eutanasia del ratón en el frasco con la sobredosis de anestésico isoflurano y tener cuidado de no permitir que el ratón cachorro a entrar en contacto con el isoflurano. Se obtiene el mejor rendimiento celular cuando las células se recogen inmediatamente después de la muerte con el fin de evitar la micro-coágulos que se forman en la circulación después de la muerte.
9. Retire el ratón de la jarra anestesia, asegure el ratón para el tablero de operación, y esterilizar el ratón, los instrumentos y los guantes con alcohol.
10. Cargar el bisturí con la cuchilla de incisión y el ratón desde el cuello hasta el abdomen inferior.
11. Abra el abdomen en el lado izquierdo del mouse, exponer el riñón, y cortar la arteria renal para permitir el ratón para Exsanguinate, evitando así los coágulos en los vasos sanguíneos pequeños de los pulmones.
12. Utilice unas tijeras para cortar a lo largo del lado del botón izquierdo delel esternón para abrir el tórax.
13. Utilizar con cuidado bisturí para cortar el diafragma en ambos lados y abra completamente la cavidad torácica. El uso de fórceps o alfileres para sujetar la cavidad torácica abierta.
14. Pegue la RV con una aguja de 27 G ½ pulgadas dirigido a la Autoridad Palestina y la perfusión del VD / PA / pulmones de PBS estéril hasta que los pulmones se ven blancos (toda la sangre enrojeció de la circulación pulmonar). Esto tomará aproximadamente 3-5 ml de PBS en función del tamaño del ratón. Es importante para eliminar primero para evitar la formación de coágulos en los pequeños vasos pulmonares.
15. Utilizar con cuidado disección roma para exponer la tráquea y el hilo de sutura debajo de uno.
16. Poner las pinzas más pequeñas debajo de la tráquea para apoyo y colocar el G angiocatéter 24 en la tráquea. Coloque el angiocatéter como la colocación de una vía intravenosa.
17. Asegure el angiocatéter en la tráquea con la sutura enhebrada en el paso 1.16.
18. Tome hirviendo PA agarosa de agua hirviendo, e invierta para mezclar bien. Se enfría la agarosí a aproximadamente la temperatura corporal por agitación en hielo. La agarosa debe permanecer en la solución, pero no es tan caliente que puede dañar las células de la PA.
19. Pegue la RV con una aguja 27 G ½ pulgadas y la perfusión del VD / PA / PA pulmones de agarosa hasta que los pulmones se ven grises. Las partículas de hierro en la mezcla de agarosa harán los pulmones aparecen de color gris. Esto tomará aproximadamente 3-5 ml de agarosa PA en función del tamaño del ratón. También es importante para ir lentamente como la inyección demasiado rápido podría provocar que el hierro se filtre en las vías respiratorias.
20. Tome la agarosa pulmón de agua hirviendo y se invierta para mezclar bien. Luego enfriar la agarosa hasta aproximadamente la temperatura corporal por agitación en hielo. La agarosa tiene que permanecer en solución, pero no ser tan caliente que se va a dañar las células del pulmón.
21. Elaborar la agarosa pulmón y conectar la jeringa al angiocatéter 24 G en la tráquea. Infundir la agarosa a través de la tráquea para inflar completamente los pulmones. Los pulmones serán Easier para picar (consulte los pasos posteriores) si los pulmones están infladas apropiadamente.
22. Retire el bloque corazón-pulmón, y se sumergen en 25 ml de PBS frío para solidificar la agarosa (~ 5 min). Aproveche este tiempo para limpiar el área de la cirugía.
23. Para los ratones neonatales (P7-P21), el mejor rendimiento PASMC proviene de la combinación 2-3 crías en un lote de células. PASMC prefieren estar en contacto con otras células para la salud y el crecimiento celular óptimo. Si un ratón se utiliza por el aislamiento, a continuación, las células son muy escasos y no crecen bien. Cuando se combinan los animales, la cosecha y enfriar los bloques de corazón-pulmón juntos y luego pasar a picar una vez que todos los bloques de corazón-pulmón se han eliminado de los animales.
24. Mover a la campana de cultivo celular para la esterilidad a partir de este punto.
25. Coloque los pulmones refrigerados en la tapa de la placa de cultivo de 10 cm de tejido y retirar con cuidado el corazón, timo, tráquea, y cualquier tejido conectivo de los pulmones.
26. Mover los pulmones a la parte inferior de la placa de cultivo de 10 cm de tejidoy añadir aproximadamente 1 ml de helado de PBS estéril.
27. Picar los pulmones en trozos muy pequeños (1-2 mm) con 2 escalpelos.
28. Rompa la punta de una pipeta de 5 ml serológica estéril. Pipetear picada suspensión de pulmón en el tubo cónico estéril de 50 ml. El uso adicional de PBS estéril enfriada en hielo para lavar la placa para asegurarse de que todo el tejido del pulmón se mete en el tubo cónico de 50 ml.
29. Colocar el tubo cónico de 50 ml en el imán. Esperar a que el tejido que contiene hierro se mueva hacia el lado del tubo al lado del imán. Dependiendo de la relación de recipiente que contiene hierro en el tejido pulmonar, algunos de los vasos todavía pueden ser flotando en este punto. Aspirar el PBS lenta y cuidadosamente tratando de no aspirar tejido pulmonar flotante ya que no está claro si contiene vasos.
30. Lavar el sedimento de pulmón 3x con 5 ml de PBS estéril, de nuevo tratando de minimizar la cantidad de tejido pulmonar que se aspira.
31. Resuspender el precipitado de pulmón en 3 ml de colagenasa y se vierte en 60 mm de placa de cultivo tisular. No hagatratan de pipeta esto, los trozos de pulmón se adhieren al interior de la pipeta.
32. Utilice un 3 ml adicionales para enjuagar el tubo después de verter, y verter esta en 60 mm de plato de cultivo de tejidos también.
33. Lugar en 37 ° C incubadora de cultivo de tejido durante 1 hora.
34. Tejido pipeta + colagenasa lechada de arriba abajo con una G aguja roma 15 en una jeringa de 5 ml hasta que se interrumpen todas las piezas grandes de pulmón. El tejido + pasta colagenasa será despejado en este punto, sin trozos de tejido visibles.
35. Verter en un nuevo tubo cónico estéril de 50 ml y adjuntar al imán.
36. Lavar la placa de cultivo de tejido con aproximadamente 5 ml de medio M199 completos para asegurar que todo el tejido ha sido recogido, y verter esta en el tubo cónico.
37. Aspirar el sobrenadante de los medios de comunicación colagenasa +. Esta vez no será muy pocos flotadores, y un sedimento compacto que contiene hierro estará en el lado del tubo cónico próximo al imán.
38. Lavar con 5 ml med completaia 3x. Esto es necesario para inactivar la colagenasa.
39. Añadir 3 ml de medio completo, y se mezcla arriba y abajo varias veces para resuspender el precipitado que contiene hierro.
40. Verter el sedimento resuspendido en una placa de cultivo tisular de 35 mm. El uso de un microscopio, habrá pequeños fragmentos de vasijas que flotan alrededor con partículas de hierro contenidas en la luz del vaso.
41. Coloque la placa de cultivo de tejido (con la etiqueta placa de cero) en el incubador de cultivo de tejido durante la noche. Las primeras células que migran fuera en la placa cero son aproximadamente 50% fibroblastos y 50% PASMC, basado en la tinción para marcadores de músculo liso. Esta placa se llama cero plateado y en última instancia desecharse después de las etapas de enriquecimiento posteriores.

2. Arteria Pulmonar Aislamiento de ratones recién nacidos - Segundo día

1. Verter el sobrenadante de los medios de comunicación de la placa de cero en un tubo cónico de 50 ml limpio.
2. Aspirar el sobrenadante de los medios de comunicación. Esta vez no habrá casi ninguna flotadores y un pacto de hierro containing pellet se forma en el lado del tubo cónico próximo al imán.
3. Lavar con 5 ml de medio completo 3x.
4. Añadir 3 ml de medio completo, y se mezcla arriba y abajo varias veces para resuspender el precipitado que contiene hierro.
5. Vierta la mezcla en una placa de cultivo tisular de 35 mm. El uso de un microscopio, pequeños fragmentos de vasijas que flotan alrededor con partículas de hierro contenidas en la luz del vaso se ven. Esta será una placa (Figura 1A).
6. Coloque la placa de cultivo tisular en el incubador de cultivo de tejido.

3. Arteria Pulmonar Aislamiento de ratones recién nacidos - Seis Días

1. Verter el sobrenadante de los medios de comunicación de la placa de uno en un tubo cónico de 50 ml limpio. La repetición de este paso varias veces asegura que todas las células del músculo liso residentes en la pared del recipiente tienen la oportunidad de migrar fuera en una placa de cultivo celular. Hay un rendimiento decreciente con cada paso, es decir cada placa tendrá menos y menos células se adhieren.
2. Placa de realimentación que tiene completos M199 medios de comunicación, y el lugar de nuevo en el cultivo de tejidos incubadora.
3. Aspirar el sobrenadante de los medios de comunicación. Esta vez no será casi no flotadores, y un sedimento compacto que contiene hierro se forma en el lado del tubo cónico próximo al imán.
4. Lavar con 5 ml de medio completo 3x.
5. Añadir 3 ml de medio completo, y se mezcla arriba y abajo varias veces para resuspender el precipitado que contiene hierro.
6. Vierta la mezcla en una placa de cultivo tisular de 35 mm. El uso de un microscopio, pequeños fragmentos de vasijas que flotan alrededor con partículas de hierro contenidas en la luz del vaso se ven. Esta será la placa dos.
7. Coloque la placa de cultivo tisular en el incubador de cultivo de tejido.

4. Arteria Pulmonar Aislamiento de ratones recién nacidos - Día Nueve

1. Verter el sobrenadante de los medios de comunicación desde el cultivo en placa de plato de tisú de dos en un tubo cónico de 50 ml limpio.
2. Placa de realimentación con dos completos M199 medios de comunicación, y el lugar de nuevo en el cultivo de tejidosincubadora.
3. Aspirar el sobrenadante de los medios de comunicación. Esta vez no será casi no flotadores, y un sedimento compacto que contiene hierro se forma en el lado del tubo cónico próximo al imán.
4. Lavar con 5 ml de medio completo 3x.
5. Añadir 3 ml de medio completo y se mezcla arriba y abajo varias veces para resuspender el precipitado que contiene hierro.
6. Vierta la mezcla en una placa de cultivo tisular de 35 mm. El uso de un microscopio, pequeños fragmentos de vasijas que flotan alrededor con partículas de hierro contenidas en la luz del vaso se ven. Esta será la placa de tres.
7. Coloque la placa de cultivo tisular en el incubador de cultivo de tejido.

5. Arteria Pulmonar Aislamiento de ratones recién nacidos - Trece días

1. Aspirar los medios de comunicación fuera de las placas 1-3.
2. Lave suavemente las células con una cálida, PBS estéril.
3. Añadir una película delgada de tripsina (~ 0,25-0,5 ml) tripsina a cada placa a trypsinize fuera de las células. Las células son muy adherente y tendrán que estar en tripsina en el tejido cultuvolver a la incubadora durante aproximadamente 10 minutos para levantar la placa.
4. Células de la cosecha de las planchas en 5 ml de medio completo en un tubo cónico de 50 ml unido al imán para sacar las partículas de hierro residual.
5. Lavar cada uno de las placas con un 0,5 ml adicionales de medio completo y añadir que los medios de comunicación para el tubo cónico de 50 ml.
6. Esta vez, toma el sobrenadante medios (no aspirar) y descartar la partícula de pellets de hierro.
7. Placa de las células en 5 ml de medio M199 completos en un plato de 60 mm a tienen células confluentes en unos pocos días. Alternativamente, la placa de las células en 10 ml M199 medio completo en una placa de 10 cm, y PASMC tardarán aproximadamente otros 1-2 semanas para alcanzar la confluencia.

6. Arteria Pulmonar Aislamiento de ratones recién nacidos - Día Catorce

1. Cambie el soporte a nuevos completos M199 medios para eliminar la tripsina residual. Habrá una población delgada de PASMC en la placa de cultivo tisular (Figura 1B).

7. Cuidado de rutina

1. Cambie el soporte a nuevos completos medio M199 aproximadamente 2 veces por semana.
2. Al dividir estas células, se requiere aproximadamente 10 min en la incubadora en una película de tripsina (0,25-0,5 ml) para las células para levantar la placa. Usando la película tripsina permite replating del PASMC sin dejar de dar vueltas a las células. Si se utiliza demasiado tripsina, a continuación, la PASMC debe ser centrifugado a girar a cabo la tripsina, o las células no readhere a la placa. A veces, después de dar vueltas al de las células, es difícil obtener la PASMC resuspendieron en medio M199 completos.
3. En sus observaciones, el PASMC aislado se comportan como células de músculo liso fiable para 4-5 pasajes, pero las células aisladas se mancha de células de músculo liso marcadores hasta el paso 7. Cuente el primer combinado de 60 mm o de 10 cm de placa con Trece día que pase 2 (planchas después de la primera exposición a tripsina).

Resultados

Durante y después del aislamiento, PASMC se examinan tanto por microscopía de luz y por inmunotinción para marcadores de células musculares lisas. Mediante microscopía de luz temprano en el protocolo, PASMC se ven en la migración de la placa de cultivo de tejido de la pequeña de hierro que contiene vasos (Figura 1A). Después de agrupar las placas del uno al tres con Trece días, entonces las partículas de hierro ya no se ven como los han sacado en el paso final pooling. En su lugar, una poblaci...

Discusión

En este manuscrito, se describe por primera vez el aislamiento de PASMC a partir de ratones en P7, P14, y P21. Con el fin de lograr esto, una suspensión de agarosa y 0,2 partículas de hierro mu M se infunden a través de la RV en la PA. Debido al pequeño tamaño de las partículas de hierro, que no pueden pasar a través del lecho capilar pulmonar y por lo tanto se deposita en la pequeña PA. Los pulmones se inflan, y se disocia. Los vasos que contienen hierro se sacan de la solución utilizando un imán. En última ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bard Parker surgical blade handle	BD	371030
Stainless steel surgical blades #10 (sterile)	Miltex	4-310
Syringes (3 ml and 5 ml, sterile)	BD	309657 and 306646
Needles (27 G, sterile)	BD	305109
Angiocatheter (24 G, sterile)	BD	381412
Monoject blunt cannula (15 G)	Kendall	SWD202314Z
Sutures	Fisher Scientific	NC9782896
Dynal magnet particle collector	Invitrogen	120-01D	This is a critical tool for the protocol.
Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile)	BD	353001, 353004, and 353003	Any brand of tissue culture plates will be fine.
Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel)	American Diagnostic Corporation	3424
Forceps (4 inch stainless steel)	Quick Medical	L5-5004
D-PBS	Mediatech	21-031-CV
M199 media	Mediatech	10-060-CV
Penicillin/streptomycin	VWR	TX16777-164NWU
Fetal bovine serum	Hyclone/Thermo Scientific	SH3091003	Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor.
Iron particles (iron (II, III) oxide powder)	Aldrich Chemical Company	#31,006-9
Agarose	Sigma	A9539
Collagenase (made to 80 U/ml)	Sigma	C5138
Isoflurane	Butlet Schein	NDC 11695-6776-1
Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera	Nikon	TE2000-U	Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture.
Anti-desmin antibody	Sigma	D-8281	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Anti-smooth muscle myosin	Biomedical Technologies	BT-562	Use at 1:2,000 dilution for immunostaining.
Rhodamine-red anti-rabbit secondary	Molecular Probes/Invitrogen	R-6394	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera	Nikon	TE300	Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining.
Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit	Enzo Life Sciences	BML-AK800-0001	This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available.
Sildenafil	Sigma	PZ-0003	A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis.