肺动脉平滑肌细胞从新生小鼠隔离

摘要

我们已经开发了一种新的和可重复的技术来隔离为P7作为年轻的小鼠原代培养的肺动脉平滑肌细胞（PASMC），从而使更好地参与新生儿平滑​​肌细胞的收缩和舒张的信号转导通路的研究。

摘要

肺动脉高压是在婴幼儿的发病率和死亡率的一个重要原因。在历史上，一直存在重大研究信号通路参与血管平滑肌收缩的肺动脉平滑肌细胞从胎羊。虽然羊长期肺动脉高压的一个很好的模型，他们都非常昂贵，缺乏发现在小鼠遗传操作的优势。相反，该​​系统是一个重大的限制无法从小鼠分离的PASMC。在这里，我们描述了的的小鼠肺动脉平滑肌细胞的原代培养的隔离P7，P14，和P21小鼠使用先前所描述的技术，Marshall 等的变形例^26中 ，曾用于隔离大鼠PASMC。这些鼠肺动脉平滑肌细胞代表了一种新的工具在新生儿期的信号转导途径的研究。简单地说，淤浆的0.5％（重量/体积）的琼脂糖+通过右心室（RV）的M199培养基中的0.5％的铁粒子注入肺血管床。该铁颗粒是直径为0.2μM，并不能穿过肺毛细血管床。因此，铁肺小动脉（PA）递交。琼脂糖，取出游离肺膨胀。含铁船舶用磁铁被拉下来。胶原酶（80单位/毫升）处理，并进一步解离后，将容器放入一个组织培养皿中的M199培养基含有20％胎牛血清（FBS）和抗生素（M199完全培养基）中，以允许到培养皿中的细胞迁移。初始板的细胞，成纤维细胞和肺动脉平滑肌细胞是50-50混合物。因此，下拉过程重复多次，以实现更纯净的的PASMC人口和消除任何残余的铁。平滑肌细胞的身份被确认通过免疫组化平滑肌肌球蛋白和结。

引言

肺动脉高压是正常期间宫内寿命时间作为气体交换的主要器官，胎盘在子宫内的心输出量只有10％被循环通过肺血管床。类似全身的压力，由于肺血管阻力升高，肺动脉压力。随着妊娠的进展，有快速增长的小PA在肺部，准备对胎儿的肺血流量的急剧增加，发生在出生^1。当正常的围产期过渡失败，在近期和足月，其结果是持续性肺动脉高压（PPHN）的新生儿。 PPHN是由许多不同的相关病症引起的一组临床综合征。然而，所有这些婴儿有着共同的病理生理功能，如肺血管阻力升高，低​​氧血症，由右至左分流血流跨持续胎儿连接，如动脉导管未闭或阿门未闭。 PPHN每千名活产和影响2-6，传达的死亡率，以及显着的短期和长期患病² 8-10％的风险。此外，极低出生体重早产儿可能会由于其潜在的肺部疾病发展肺动脉高压。最常见的潜在肺疾病的早产儿支气管肺发育不良（BPD）。虽然BPD的整体风险与胎龄和出生体重，目前还不清楚为什么一个子集，这些婴儿的发展显着的肺动脉高压，以及如何适当地对待这些婴儿。差的结果，包括住院时间延长，死亡率增加，是常见的^3-6。

从历史上看，从健康动物绵羊胎儿肺动脉平滑肌细胞或猪胎儿肺动脉平滑肌细胞已被用来研究信号通路参与在正常出生后肺血管过渡。这些通常是孤立的第五代性PAÑ ​​绵羊或猪胎儿的交付实施安乐死之前，任何自发呼吸^7-9。此外，一些研究者已经分离并利用PASMC从年龄稍大的自主呼吸的羔羊和仔猪在3天，2周，4周^10-12。最近，一些团体已经成功地分离和利用PASMC孤立羔羊PPHN检查紊乱信号通路在疾病状态^13-17。这些细胞已被证明是一个有价值的工具来检查信号通路是至关重要的正常和病变的近期和长期的肺血管。然而，他们不给洞察信号通路的影响，早产儿肺动脉高压。他们也不可以看出，在小鼠疾病模型的遗传操作的可能性。

长期以来，大鼠和小鼠模型已被用于模型BPD以及最近正被用于模型肺HYpertension造成BPD ^18-22。新生大鼠是诱人的工作，由于其较大的规模，但他们也遭受缺乏基因改造的潜力。转基因动物已被广泛用于研究特定基因的目标，整个动物生理学新生小鼠的影响，但至今没有任何人曾成功分离PASMC从这些小老鼠。通过隔离PASMC，可以得到更多的信息，关于如何在应对环境刺激和/或遗传修饰，特别是在肺动脉平滑肌途径改变。此外，现场PASMC可以成像实时的，，检查快速变化的关键信号分子，如钙和活性氧^23-25。最近，我们描述了使用的变化的技术，Marshall 等从成年小鼠肺动脉平滑肌细胞成功地分离出²⁶用于隔离大鼠肺动脉平滑肌细胞^23,25,26。我们现在已经适应了ND扩展这种技术小老鼠7-21日龄（P7，P14，P21）。到这个新的PASMC隔离技术的主要限制是，它要求多鼠标，以产生足够的用于实验的细胞，细胞的生长非常缓慢，这是主平滑肌细胞的特征。尽管有这些限制，我们相信这种技术来隔离新生小鼠PASMC将允许增强调查的关键信号通路参与了肺动脉高压的发展，并表示在这一领域的一个显着的进步。

研究方案

在西北大学的机构动物护理和使用委员会批准该协议。

1。从新生小鼠肺动脉隔离 - 第一天

1. 准备完成的M199媒体 - M199混合400毫升，用100毫升（最终浓度= 20％）热灭活的胎牛血清和5毫升（最终浓度= 1％），青霉素/链霉素。
2. 准备用5毫升（终浓度= 1％），青霉素/链霉素的无血清M199媒体-混合500毫升M199。
3. 准备PA琼脂糖 -混合0.05克的琼脂糖凝胶加0.05克的铁颗粒在10毫升无菌，无血清的M199媒体。
4. 准备的龙琼脂糖 -混合0.1克的琼脂糖在10毫升无菌，无血清的M199媒体。
5. 成无菌的，无血清的M199媒体准备的胶原酶 -混合胶原酶的终浓度为80 U / ml的无菌过滤器，然后该混合物。
6. 设置所有的设备的时间提前，然后再实施安乐死鼠标。
7. 设置PA琼脂糖和肺琼脂糖煮沸前右安乐死鼠标。
8. 安乐死鼠标在异氟醚麻醉的jar过量，要小心，不要让鼠标小狗接触到异氟醚。最佳小区的产率时，收获细胞，以避免微血栓形成在流通死后死后立即获得。
9. 麻醉罐子取出鼠标，固定鼠标的操作板，消毒的鼠标，仪器仪表，用酒精和手套。
10. 手术刀放入刀片切开鼠标，从颈部到下腹部。
11. 打开鼠标的左侧腹部，肾脏暴露，并切断肾动脉，让鼠标抽血，从而避免在肺部的小血管血栓。
12. 用剪刀剪下沿着鼠标的左侧胸骨，打开胸腔。
13. 小心地用手术刀切割膜片两侧完全打开胸腔。使用镊子或针保持打开胸腔。
14. 坚持RV G½英寸与27针朝向PA灌注的RV / PA /用无菌PBS肺部直到肺部出现白色的（所有血液冲出肺循环）。根据鼠标的大小，这将需要约3-5毫升的PBS。重要的是先冲洗，以防止在小肺血管的凝块的形成。
15. 小心使用钝性分离暴露气管和线缝合下方。
16. 气管下方支撑将最小的镊子和进气管将地下24 angiocatheter的。将angiocatheter，如果放置的IV。
17. 固定拧在步骤1.16中与缝合入气管的angiocatheter。
18. 以水煮出来的开水，PA琼脂糖和反转拌匀。冷却阿加罗的本身的体温约在冰上旋流。琼脂糖需要留在溶液中，但不会这么热，它会损害细胞的PA。
19. 坚持RV一个27 G½英寸的针，的灌注的RV / PA / PA琼脂糖肺部直到肺部出现灰色。琼脂糖混合物的铁粒子将使肺部出现灰色的颜色。这将需要约3-5毫升PA的琼脂糖根据鼠标的大小。同样重要的是去慢慢注射速度过快，可能会导致泄漏到气道的铁。
20. 肺琼脂糖的开水和反转拌匀。如果是，冷却琼脂糖约体温通过在冰上旋流。琼脂糖需要留在溶液中的，但不这么热，会损坏细胞的肺。
21. 肺琼脂糖和连接注射器在气管的地下24 angiocatheter的。通过气管注入琼脂糖充分膨胀肺部。肺将EASIEr来剁碎（见后面的步骤）如果肺部得到适当充气。
22. 取出心脏肺集团，浸入到25毫升冰冷的PBS中，以固化琼脂糖（〜5分钟）。利用这段时间来清理手术区。
23. 对于新生小鼠（P7-P21），最佳PASMC产量来自2-3幼仔组合成一个批次的细胞。的PASMC偏好是最佳的细胞的健康和生长与其他细胞接触。如果隔离每一个鼠标，那么细胞是非常稀疏，不能很好地生长。当动物，收获和寒冷心脏肺集团的结合在一起，然后将切碎，一旦所有心脏肺集团已从动物。
24. 从这点起，移动到上述细胞培养无菌罩。
25. 将冷冻肺部进入10厘米的组织培养皿的盖子，小心地取出心脏，胸腺，气管，任何从肺部结缔组织。
26. 肺部移动到10厘米的组织培养皿的底部并添加约1毫升冰冷的无菌PBS。
27. 剁碎成非常小的碎片（1-2毫米）2手术刀肺部。
28. 打破通风报信灭菌的5毫升血清吸管。移液器剁碎肺浆到无菌的50毫升锥形管。使用额外的无菌冰冷的PBS洗板，以确保所有的肺组织进入50毫升锥形管。
29. 到磁铁上，将50毫升的锥形管。等待含铁组织移动到磁铁旁边的侧管。根据含铁船只肺组织的比例，船舶可能仍然会漂浮在这一点上。吸PBS缓慢而仔细地试图不吸以来浮动肺组织目前还不清楚它是否包含血管。
30. 将猪肺洗净沉淀3次，用5毫升无菌PBS，再次尝试，以尽量减少吸气量的肺组织。
31. 重悬肺颗粒在3毫升胶原酶，倒入60毫米组织培养皿中。别尽量吸取试剂;，肺块将坚持移液器的内部。
32. 使用额外的3毫升冲洗管浇筑后，倒到60毫米组织培养皿。
33. 放入37℃组织培养孵化1小时。
34. 移液器组织+胶原酶浆向上和向下一个15 G钝针5毫升注射器，直到所有的大肺片被打乱。该组织+胶原酶浆将是多云的在这一点上，没有明显的组织块。
35. 倒入一个新的无菌的50毫升锥形管，并附着到磁体上。
36. 用约5ml，以确保所有的组织已收集完整的M199媒体组织培养皿洗净，然后倒入到锥形管中。
37. 吸胶原酶+媒体上清。这时候会非常少的浮子，和一个紧凑的含铁颗粒将上侧的磁铁旁边的锥形管。
38. 洗净，用5毫升完整的MED保险业监督3倍。这是必需的，以钝化胶原酶。
39. 加入3毫升的完整的​​媒体，和混合上下几次含铁颗粒悬浮。
40. 倒入到35毫米组织培养皿中悬浮的颗粒。利用显微镜，会有小血管周围的血管腔中包含的铁颗粒漂浮的片段。
41. 在组织培养孵化器中的组织培养皿中（标记板零）放置过夜。细胞迁移到板零约50％的成纤维细胞和50％的肺动脉平滑肌细胞，平滑肌标记染色。此板被称为镀零点和随后的浓缩步骤之后最终被丢弃。

2。从新生小鼠肺动脉隔离 - 第二天

1. 倒入板零上清到一个干净的50毫升锥形管媒体。
2. 吸媒体上清。这时会有几乎没有飞蚊症，和一个紧凑的铁CONTA伊宁颗粒将磁铁旁边的锥形管的一侧上形成。
3. 洗净，用5毫升完整的媒体3倍。
4. 加入3毫升的完整的​​媒体，和混合上下几次含铁颗粒悬浮。
5. 倒入35毫米组织培养皿。利用显微镜，左右浮动血管腔中包含的铁颗粒的小血管片段能够被看见。这将是板1（ 图1A）。
6. 将组织培养孵化器的组织培养皿中。

3。从新生小鼠肺动脉隔离 - 第六天

1. 倒入媒体上清板块之一到一个干净的50毫升锥形管。多次重复上述步骤，确保所有驻留在容器器壁的平滑肌细胞迁移到细胞培养板有机会。有一个收益递减，每一步， 即每块板将有越来越少，细胞附着。
2. 再供给板一个完整的M199媒体和地方进入组织培养孵化器。
3. 吸媒体上清。这个时候就会几乎没有浮子，和一个紧凑的含铁颗粒将形成上侧的锥形管，磁铁旁边。
4. 洗净，用5毫升完整的媒体3倍。
5. 加入3毫升的完整的​​媒体，和混合上下几次含铁颗粒悬浮。
6. 倒入35毫米组织培养皿。利用显微镜，左右浮动血管腔中包含的铁颗粒的小血管片段能够被看见。这将是板两种。
7. 将组织培养孵化器的组织培养皿中。

4。从新生小鼠肺动脉隔离 - 第九天

1. 媒体上清液倒入到一个干净的组织培养皿板两个50毫升锥形管。
2. 再供给板两个完整的M199媒体，并放回到组织文化孵化器。
3. 吸媒体上清。这个时候就会几乎没有浮子，和一个紧凑的含铁颗粒将形成上侧的锥形管，磁铁旁边。
4. 洗净，用5毫升完整的媒体3倍。
5. 加入3毫升的完整的​​媒体和混合上下几次含铁颗粒悬浮。
6. 倒入35毫米组织培养皿。利用显微镜，左右浮动血管腔中包含的铁颗粒的小血管片段能够被看见。这将是第三板。
7. 将组织培养孵化器的组织培养皿中。

5。从新生小鼠肺动脉隔离 - 第十三天

1. 吸板1-3媒体。
2. 轻轻用温水，无菌PBS洗细胞。
3. 加入胰蛋白酶（0.25-0.5毫升）胰蛋白酶，胰蛋白酶消化细胞，每块板的薄膜。细胞粘附和将需要在组织中的胰蛋白酶丘尔重约10分钟的孵化器抬离板。
4. 收获细胞脱落板分为5毫升的完整的​​媒体在50毫升锥形管连接到磁铁拉出任何残留的铁粒子。
5. 清洗每个板具有一个额外的0.5毫升的完整的​​媒体，该媒体，并添加50毫升锥形管。
6. 这个时候，采取媒体上清（不要吸），并丢弃的铁粒子颗粒。
7. 盘细胞在5毫升完整的M199培养基在60毫米的菜有融合细胞在几天之内。另外，板材10毫升完全M199媒体在一个10厘米的板，和肺动脉平滑肌细胞中的细胞将采取另外约1-2周达到汇合。

6。从新生小鼠肺动脉隔离 - 第十四天

1. 减小介质的新鲜的完全培养基媒体，以除去残留的胰蛋白酶。会有肺动脉平滑肌细胞的组织培养皿中（ 图1B）上的薄人口。

7。日常护理

1. 更改媒体新鲜完整的M199媒体，每周约2倍。
2. 当这些细胞分裂，约10分钟，在孵化器，在一部电影中的胰蛋白酶（0.25-0.5毫升）的细胞需要抬离板。使用胰蛋白酶膜允许的PASMC replating的无纺纱细胞。如果使用太多的胰蛋白酶，肺动脉平滑肌细胞必须被离心旋出的胰蛋白酶，或在的细胞不会readhere板。有时，在纺丝后的细胞时，它是很难得到的肺动脉平滑肌细胞再悬浮成完整的M199媒体。
3. 在实际观测中，孤立的肺动脉平滑肌细胞像平滑肌细胞4-5代可靠，但，隔离细胞染色平滑肌细胞标记通过7。十三天数首次汇集了60毫米或10厘米板作为第2代（电镀后，第一次接触到胰蛋白酶）。

结果

隔离期间和之后，肺动脉平滑肌细胞的光镜和平滑肌细胞标志物免疫组化检查。通过光镜，早在该协议中，PASMC看到小铁容器（ 图1A）迁移到组织培养皿。池板后一通三13天，然后不再被看作是那些已经在最后的池步拉出铁颗粒。相反，人口肺动脉平滑肌细胞在组织培养皿（ 图1B）。

基于免疫染色，最初的细胞迁移含铁船舶约50％的成纤维细胞和50％?...

讨论

在这个手稿中，我们描述了在第一次的PASMC在P7，P14，和P21小鼠的隔离。为了做到这一点，通过琼脂糖凝胶和0.2μM铁颗粒的浆料注入到PA的RV。由于小尺寸的铁粒子，它们无法通过肺毛细血管床，因此沉积在小PA。肺部膨胀，除去游离。含铁的容器内被拉出使用磁铁的溶液。最终，该船舶被镀成的组织培养皿中，细胞迁移的船只，到培养板。的初始板的细胞是成纤维细胞和肺动脉平滑肌细胞的混合物...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bard Parker surgical blade handle	BD	371030
Stainless steel surgical blades #10 (sterile)	Miltex	4-310
Syringes (3 ml and 5 ml, sterile)	BD	309657 and 306646
Needles (27 G, sterile)	BD	305109
Angiocatheter (24 G, sterile)	BD	381412
Monoject blunt cannula (15 G)	Kendall	SWD202314Z
Sutures	Fisher Scientific	NC9782896
Dynal magnet particle collector	Invitrogen	120-01D	This is a critical tool for the protocol.
Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile)	BD	353001, 353004, and 353003	Any brand of tissue culture plates will be fine.
Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel)	American Diagnostic Corporation	3424
Forceps (4 inch stainless steel)	Quick Medical	L5-5004
D-PBS	Mediatech	21-031-CV
M199 media	Mediatech	10-060-CV
Penicillin/streptomycin	VWR	TX16777-164NWU
Fetal bovine serum	Hyclone/Thermo Scientific	SH3091003	Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor.
Iron particles (iron (II, III) oxide powder)	Aldrich Chemical Company	#31,006-9
Agarose	Sigma	A9539
Collagenase (made to 80 U/ml)	Sigma	C5138
Isoflurane	Butlet Schein	NDC 11695-6776-1
Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera	Nikon	TE2000-U	Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture.
Anti-desmin antibody	Sigma	D-8281	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Anti-smooth muscle myosin	Biomedical Technologies	BT-562	Use at 1:2,000 dilution for immunostaining.
Rhodamine-red anti-rabbit secondary	Molecular Probes/Invitrogen	R-6394	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera	Nikon	TE300	Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining.
Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit	Enzo Life Sciences	BML-AK800-0001	This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available.
Sildenafil	Sigma	PZ-0003	A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis.