Isolamento de artéria pulmonar células musculares lisas de camundongos recém-nascidos

Resumo

Desenvolvemos um novo e reprodutível técnica para isolar culturas primárias de células do músculo liso da artéria pulmonar (PASMC), a partir de ratinhos jovens como P7, permitindo assim um melhor estudo das vias de sinalização celular envolvidas na contracção do músculo liso neonatal e relaxamento.

Resumo

A hipertensão pulmonar é uma importante causa de morbidade e mortalidade em recém-nascidos. Historicamente, tem sido importante estudo das vias de sinalização envolvidas na contracção do músculo liso vascular em PASMC de feto de ovelha. Enquanto ovelhas fazer um excelente modelo de hipertensão pulmonar prazo, eles são muito caros e não têm a vantagem de manipulação genética encontrada em ratinhos. Por outro lado, a incapacidade de isolar PASMC de ratinhos era uma limitação significativa do referido sistema. Aqui descrevemos o isolamento de culturas primárias de rato PASMC de P7, P14, e P21 ratinhos usando uma variação da técnica descrita anteriormente de Marshall et al. ²⁶ que foi previamente utilizado para isolar PASMC rato. Estes PASMC murino representam uma nova ferramenta para o estudo das vias de sinalização no período neonatal. Resumidamente, uma suspensão de 0,5% (w / v) de agarose + 0,5% de partículas de ferro em meio M199 é infundida no leito vascular pulmonar através do ventrículo direito (VD). Opartículas de ferro são 0,2 m de diâmetro e não pode passar através do leito capilar pulmonar. Assim, as lojas de ferro nas pequenas artérias pulmonares (PA). Os pulmões são inflados com agarose, removido e dissociado. Os vasos que contêm ferro são puxados para baixo com um ímã. Depois de colagenase (80 U / ml) e após dissociação do tratamento, os vasos são colocados numa placa de cultura de tecidos em meio M199 contendo 20% de soro fetal bovino (FBS), e antibióticos (meio completo M199) para permitir a migração de células para o prato de cultura . Esta placa inicial de células é uma mistura de 50-50 de fibroblastos e PASMC. Assim, o puxar para baixo procedimento é repetido várias vezes, para obter uma população mais puro e PASMC remover qualquer ferro residual. Identidade da célula do músculo liso é confirmado por imunocoloração para o bom miosina muscular e desmina.

Introdução

A hipertensão pulmonar é normal, durante a vida intra-uterina desde a placenta serve como o principal órgão de troca gasosa e apenas 10% do débito cardíaco é circulado através do leito vascular pulmonar. No útero, as pressões pulmonares são semelhantes às pressões sistémicas devido à resistência vascular pulmonar elevada . A progressão da gestação, há um rápido crescimento da pequena PA dentro do pulmão, preparação do feto para o aumento dramático no fluxo sanguíneo pulmonar que ocorre no momento do nascimento ^1. Quando a transição perinatal normal falhar em crianças de curto prazo ea termo, o resultado é a hipertensão pulmonar persistente do recém-nascido (HPP). HPP é uma síndrome clínica causada por diversas patologias subjacentes diferentes. No entanto, todas essas crianças compartilham aspectos fisiopatológicos comuns, tais como elevada resistência vascular pulmonar, hipoxemia e manobras da direita para a esquerda do fluxo de sangue através de conexões fetais persistentes, como a persistência do canal arterial ou paraamen ovale. HPP afeta 2-6 por 1.000 nascidos vivos e transmite um risco de 8-10% de mortalidade, bem como significativa a curto prazo e de longo prazo morbidade ^2. Além disso, os nascidos de muito baixo peso ao nascer prematuros podem desenvolver hipertensão pulmonar como conseqüência de sua doença pulmonar subjacente. A doença pulmonar subjacente mais comum dos prematuros é a displasia broncopulmonar (DBP). Não obstante o risco de DBP se correlaciona com a idade gestacional e peso ao nascer, ainda não está claro por que um subconjunto dessas crianças se desenvolve hipertensão pulmonar significativa e como tratar adequadamente essas crianças. Maus resultados, incluindo a internação prolongada e aumento da mortalidade, são comuns ^3-6.

Historicamente, PASMC fetais ovinos ou PASMC fetal de suíno de animais saudáveis ​​têm sido usados ​​para estudar as vias de sinalização envolvidos na transição vascular pulmonar normal após o nascimento. Estes são tipicamente isoladas a partir de resistência à quinta geração de um PAn ovina e suína feto que é entregue e sacrificados antes de qualquer respiração espontânea ^7-9. Além disso, alguns pesquisadores têm isolado e utilizado PASMC de um pouco mais velha e com respiração espontânea cordeiros e leitões em 3 dias, 2 semanas e 4 semanas ^10-12. Mais recentemente, alguns grupos isolados e utilizados PASMC isolado cordeiros com HPP para examinar os distúrbios em vias de sinalização no estado de doença ^13-17 com sucesso. Estas células têm provado ser uma ferramenta valiosa para examinar as vias de sinalização que são cruciais tanto na vasculatura pulmonar normal e doente a curto prazo e longo prazo. No entanto, eles não dar dicas sobre as vias de sinalização afetadas em prematuros com hipertensão pulmonar. Além disso, não permitir que as possibilidades de manipulação genética observada em modelos do rato da doença.

Modelos de ratos e camundongos têm sido muito utilizados para modelar BPD e, mais recentemente, estão sendo usados ​​para hy pulmonar modeloarterial sistêmica resultante do DBP ^18-22. Ratos recém-nascidos são atraentes para trabalhar devido ao seu tamanho maior, mas eles também sofrem com a falta de potencial de modificação genética. Animais geneticamente modificados têm sido amplamente utilizados para investigar os efeitos de genes alvos específicos sobre a fisiologia animal inteiro em camundongos recém-nascidos, mas até agora ninguém foi previamente isolada com sucesso PASMC destes pequenos ratos. Ao isolar PASMC, maior informação pode ser obtida sobre como alterar as vias em resposta a estímulos ambientais e / ou a modificação genética específica no músculo liso da artéria pulmonar. Além disso, ao vivo PASMC podem ser visualizados em tempo real para examinar as mudanças rápidas nas principais moléculas sinalizadoras, como cálcio e espécies reativas de oxigênio ^23-25. Recentemente, descreveram o isolamento de PASMC de ratinhos adultos utilizando uma variação da técnica de Marshall et al. ²⁶ utilizada para isolar rato PASMC ^23,25,26. Temos, agora, adaptado aª estendeu esta técnica para pequenos ratos 7-21 dias de idade (P7, P14 e P21). A principal limitação a esta nova técnica de isolamento PASMC é que requer múltiplos ratinhos para gerar suficientes células para as experiências e as células que crescem muito lentamente, o que é característico de células primárias de músculo liso. Apesar destas limitações, acreditamos que esta técnica para isolar PASMC neonatal mouse irá permitir a maior investigação das vias de sinalização importantes envolvidos no desenvolvimento da hipertensão pulmonar, e representa um avanço significativo nesta matéria.

Protocolo

O Animal Care Institucional e Comitê de uso da Northwestern University aprovou este protocolo.

1. Isolamento da artéria pulmonar de ratos neonatos - Day One

1. Prepare os completos M199 mídia - Misturar 400 ml M199 com 100 ml (concentração final = 20%) de calor FBS inativado e 5 ml (concentração final = 1%) penicilina / estreptomicina.
2. Preparar o soro grátis M199 Media - Misture 500 ml M199 com 5 ml (concentração final = 1%) penicilina / estreptomicina.
3. Prepare o PA Agarose - Mix 0,05 g de agarose mais 0,05 g de partículas de ferro em 10 mL estéreis, sem soro M199 mídia.
4. Prepare o Lung Agarose - Misturar 0,1 g de agarose em 10 ml estéreis, sem soro M199 mídia.
5. Preparar a colagenase - colagenase mistura em estéreis, isentos de soro no meio M199 a uma concentração final de 80 U / ml e, em seguida, esta mistura de filtro estéril.
6. Configure todos os equipamentos antes do tempo antes de eutanásia do mouse.
7. Definir PA agarose e pulmão agarose a ferver logo antes de eutanásia do mouse.
8. Sacrificá o mouse na jarra com overdose de anestésico isoflurano e ter cuidado para não permitir que o mouse cachorro para entrar em contato com o isoflurano. O melhor rendimento de células é obtido quando as células são colhidas imediatamente após a morte, a fim de evitar os micro-coágulos que se formam na circulação após a morte.
9. Remova o mouse do frasco do anestésico, garantir o mouse para o conselho operacional e esterilizar o mouse, instrumentos e luvas com álcool.
10. Coloque o bisturi com a lâmina e inciso o mouse desde o pescoço até o abdômen inferior.
11. Abra o abdómen do lado esquerdo do rato, expor o rim, e corte da artéria renal, para permitir que o rato para desangrar, evitando assim a formação de coágulos nos pequenos vasos dos pulmões.
12. Use a tesoura para cortar ao longo do lado esquerdo do rato deesterno para abrir o tórax.
13. Cuidadosamente use bisturi para cortar o diafragma em ambos os lados e abrir completamente a cavidade torácica. Use uma pinça ou pinos para segurar a cavidade torácica aberta.
14. Cole a RV com uma agulha 27 G ½ polegada direcionada para o PA e perfundir o RV / PA / pulmões com PBS estéril até os pulmões aparecem em branco (todo o sangue liberado para fora da circulação pulmonar). Isto levará aproximadamente 3-5 ml de PBS, dependendo do tamanho do animal. É importante lavar primeiro a prevenir a formação de coágulos nos vasos pulmonares pequenas.
15. Cuidadosamente use dissecção romba para expor a traquéia e um fio por baixo da sutura.
16. Coloque os menores fórceps debaixo da traquéia para suporte e coloque o angiocateter G 24 na traquéia. Colocar o angiocateter como se colocando uma IV.
17. Fixe o angiocateter na traquéia com sutura enfiada no passo 1.16.
18. Leve a ferver PA agarose de água fervente, e inverter para misturar bem. Resfriar o agarosi, a aproximadamente a temperatura do corpo por agitação em gelo. A agarose tem de permanecer em solução, mas não estar tão quente que vai danificar as células do PA.
19. Cole a RV com uma agulha 27 G ½ polegada e perfundir o RV / PA / PA pulmões com agarose até os pulmões aparecem na cor cinza. As partículas de ferro na mistura de agarose fará com que os pulmões aparecem na cor cinza. Isto levará aproximadamente 3-5 ml de PA de agarose, dependendo do tamanho do animal. É também importante para ir lentamente como injecção muito rápido pode fazer com que o ferro de vazamento para as vias respiratórias.
20. Pegue o pulmão agarose de água fervente e inverta para misturar bem. Em seguida, arrefecer a agarose a aproximadamente a temperatura do corpo por agitação em gelo. A agarose tem de permanecer em solução, mas não estar tão quente que danificam as células do pulmão.
21. Elaborar a agarose pulmão e anexar a seringa ao angiocateter G 24 na traquéia. Infundir a agarose através da traquéia para inflar completamente os pulmões. Os pulmões será easier para picar (veja as etapas posteriores) se os pulmões estão adequadamente inflado.
22. Remover o bloco de coração-pulmão, e mergulhado em 25 ml de PBS gelado para solidificar a agarose (~ 5 minutos). Use esse tempo para limpar a área cirúrgica.
23. Para camundongos recém-nascidos (P7-P21), o melhor rendimento PASMC vem da combinação 2-3 filhotes em um lote de células. PASMC preferem estar em contato com outras células para a saúde celular ideal e crescimento. Se um rato é usado por isolamento, em seguida, as células são muito escasso e não se desenvolvem bem. Ao combinar os animais, colheita e frio os blocos coração-pulmão em conjunto e, em seguida, passar para picar uma vez que todos os blocos coração-pulmão foram retirados dos animais.
24. Mover-se para a capa de cultura de células para a esterilidade deste ponto em diante.
25. Colocar os pulmões refrigerados na tampa do 10 centímetros prato de cultura de tecidos e remover cuidadosamente o coração, timo, traqueia, e de qualquer tecido conjuntivo a partir dos pulmões.
26. Mover os pulmões para a parte inferior do prato de 10 centímetros de tecido de culturae adicionar cerca de 1 ml gelada estéril PBS.
27. Picar os pulmões em pedaços muito pequenos (1-2 mm) com dois bisturis.
28. Quebrar a ponta fora de uma pipeta de 5 ml sorológica estéril. Pipeta picados lama pulmão em tubo de 50 ml estéril. Utilização adicional estéril PBS gelado para lavar a placa para assegurar que todo o tecido pulmonar entra no tubo de 50 mL cónico.
29. Coloque o tubo de 50 ml cônico sobre o ímã. Aguardar o tecido contendo ferro para mover para o lado do tubo ao lado do íman. Dependendo da proporção do navio contendo ferro para tecido pulmonar, alguns dos recipientes pode ainda ser flutuante neste ponto. Aspirar fora da PBS devagar e com cuidado tentando não aspirar o tecido pulmonar flutuante, uma vez que não está claro se ele contém vasos.
30. Lava-se a pelete 3x pulmão com 5 ml de PBS estéril, novamente para tentar minimizar a quantidade de tecido do pulmão que é aspirado.
31. Ressuspender o sedimento de pulmão em 3 ml de colagenase e despeje em 60 milímetros de tecido prato de cultura. Nãotentar pipeta isso, os pedaços do pulmão vai ficar com o interior de sua pipeta.
32. Use um adicional de 3 ml para enxaguar o tubo após o vazamento, e não derramar sobre isso em 60 milímetros de tecido prato de cultura também.
33. Colocar em 37 ° C incubadora de cultura de tecido durante 1 hora.
34. Pipeta tecido + pasta colagenase cima e para baixo com uma agulha 15 G contundente em uma seringa de 5 ml até que todos os grandes pedaços de pulmão são interrompidas. O tecido + pasta de colagenase será nublado neste momento, sem pedaços de tecido visíveis.
35. Despeje em um novo tubo de 50 ml estéril e anexar ao ímã.
36. Lava-se a placa de cultura de tecido com cerca de 5 ml de meio M199 completo para assegurar que todo o tecido tenha sido recolhido, e despeje este para dentro do tubo cónico.
37. Aspirar fora da colagenase + media sobrenadante. Desta vez, não será muito poucos flutuadores, e um sedimento contendo ferro compacto estará no lado do tubo cónico lado do íman.
38. Lava-se com 5 ml de completa media de 3x. Isto é necessário para inactivar a colagenase.
39. Adicionar 3 ml de meio completo e misture cima e para baixo algumas vezes para ressuspender o sedimento contendo ferro.
40. Deite o sedimento ressuspenso em tecido de 35 mm prato de cultura. Utilizando um microscópio, haverá fragmentos pequenos vasos flutuando com partículas de ferro contidos no lúmen do vaso.
41. Colocar a placa de cultura de tecido (denominado placa zero) na incubadora de cultura de tecido durante a noite. As primeiras células que migram para fora da placa de zero a cerca de 50% são fibroblastos e PASMC 50%, com base na coloração para marcadores de músculo liso. Esta placa é chamado de zero chapeado e finalmente descartado após os passos subsequentes de enriquecimento.

2. Isolamento da artéria pulmonar de ratos neonatos - Day Two

1. Despeje a mídia sobrenadante de placa de zero em um tubo de 50 ml limpo.
2. Aspirar o sobrenadante fora da mídia. Desta vez não haverá quase nenhum floaters, e um compacto de ferro-Containing pelete vai formar no lado do tubo cónico lado do íman.
3. Lava-se com 5 ml de meio completo de 3x.
4. Adicionar 3 ml de meio completo e misture cima e para baixo algumas vezes para ressuspender o sedimento contendo ferro.
5. Despeje em um prato de 35 milímetros de tecido cultura. Usando um microscópio, os fragmentos de pequenos vasos por aí com partículas de ferro contidas no lúmen dos vasos são vistos. Esta será uma placa (Figura 1A).
6. Colocar a placa de cultura de tecido no incubador de cultura de tecido.

3. Isolamento da artéria pulmonar de ratos neonatos - Seis Dias

1. Despeje a mídia sobrenadante de uma placa em um tubo de 50 ml limpo. Repetindo várias vezes este passo assegura que todas as células do músculo liso residentes na parede do recipiente ter uma oportunidade de migrar para fora de uma placa de cultura celular. Não é um retorno diminuindo com cada etapa ou seja, cada placa irá ter menos e menos células aderir.
2. Refeed uma placa com completos M199 mídia, e coloque de volta na cultura de tecidos incubadora.
3. Aspirar o sobrenadante fora da mídia. Desta vez, não será quase não flutuantes, e um sedimento contendo ferro compacto irá formar no lado do tubo cónico lado do íman.
4. Lava-se com 5 ml de meio completo de 3x.
5. Adicionar 3 ml de meio completo e misture cima e para baixo algumas vezes para ressuspender o sedimento contendo ferro.
6. Despeje em um prato de 35 milímetros de tecido cultura. Usando um microscópio, os fragmentos de pequenos vasos por aí com partículas de ferro contidas no lúmen dos vasos são vistos. Este será duas placas.
7. Colocar a placa de cultura de tecido no incubador de cultura de tecido.

4. Isolamento da artéria pulmonar de ratos neonatos - Dia Nove

1. Despeje o sobrenadante mídia da cultura de tecidos prato dois em um tubo de 50 ml limpo.
2. Placa refeed dois com completos M199 mídia, e coloque de volta na cultura de tecidosincubadora.
3. Aspirar o sobrenadante fora da mídia. Desta vez, não será quase não flutuantes, e um sedimento contendo ferro compacto irá formar no lado do tubo cónico lado do íman.
4. Lava-se com 5 ml de meio completo de 3x.
5. Adicionar 3 ml de meio completo e misture cima e para baixo algumas vezes para ressuspender o sedimento contendo ferro.
6. Despeje em um prato de 35 milímetros de tecido cultura. Usando um microscópio, os fragmentos de pequenos vasos por aí com partículas de ferro contidas no lúmen dos vasos são vistos. Este será o prato três.
7. Colocar a placa de cultura de tecido no incubador de cultura de tecido.

5. Isolamento da artéria pulmonar de ratos neonatos - Dia Treze

1. Aspirar a mídia fora de placas de 1-3.
2. Delicadamente, lave as células com água morna, PBS estéril.
3. Adicionar uma película fina de tripsina (~ 0,25-0,5 ml) de tripsina a cada placa trypsinize para fora das células. As células são muito aderente e terão de ser em tripsina no tecido blore incubadora por aproximadamente 10 minutos para retirar a placa.
4. Células colheita fora das placas em 5 ml de meio completo em um tubo de 50 ml anexado ao ímã para retirar as partículas de ferro residuais.
5. Lava-se cada uma das placas com um adicional de 0,5 ml de meio completo e adicione que os meios para o tubo de 50 ml.
6. Desta vez, tomar a mídia sobrenadante (não aspirado), e descartar a partícula pelota de ferro.
7. Placa as células em 5 ml de meio M199 completo em um prato de 60 milímetros para ter células confluentes em poucos dias. Alternativamente, placa de células em 10 ml completos M199 mídia em uma placa de 10 cm, e PASMC levará cerca de mais 1-2 semanas para chegar a confluência.

6. Isolamento da artéria pulmonar de ratos neonatos - Dia Quatorze

1. Troque a mídia para novos completos M199 mídia para remover qualquer tripsina residual. Haverá uma população de PASMC fina em placa de cultura de tecido (figura 1B).

7. Cuidados de Rotina

1. Troque a mídia para novos completos M199 media cerca de 2x por semana.
2. Ao dividir estas células, cerca de 10 min no incubador por uma película de tripsina (0,25-0,5 ml) é necessária para as células para retirar a placa. Usando o filme tripsina permite repique da PASMC sem girar as células. Se demasiado tripsina é usado, então a PASMC deve ser centrifugado para girar a tripsina, ou as células não readhere à placa. Às vezes, depois de girar as células, é difícil conseguir a PASMC ressuspenso em completa M199 mídia.
3. Em observações, o PASMC isolado se comportar como células musculares lisas de forma confiável por 4-5 passagens, mas as células isoladas vai manchar para células musculares lisas marcadores até passagem 7. Contar o primeiro pool 60 milímetros ou 10 centímetros prato no dia treze como passagem 2 (revestimento após a primeira exposição a tripsina).

Resultados

Durante e após o isolamento, PASMC sejam apreciados por microscopia óptica e por imunocoloração para os marcadores de células musculares lisas. Por microscopia de luz no início do protocolo, PASMC são vistas migrar para o prato de cultura de tecido a partir do pequeno contendo ferro vasos (Figura 1A). Depois partilha placas de um a três no dia treze, então partículas de ferro não são mais vistos como aqueles têm sido puxado para fora na etapa final pooling. Em vez disso, uma população de ...

Discussão

Neste artigo, descreve pela primeira vez o isolamento de PASMC de ratinhos em P7, P14 e P21. A fim de realizar isto, uma suspensão de agarose e 0,2 uM partículas de ferro são infundidas através de RV no PA. Devido ao pequeno tamanho das partículas de ferro, que não podem passar através do leito capilar pulmonar e assim, são depositados na pequena PA. Os pulmões são inflados, removido e dissociado. Os vasos que contêm ferro são puxados para fora da solução usando um imã. Finalmente, os vasos foram plaquead...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bard Parker surgical blade handle	BD	371030
Stainless steel surgical blades #10 (sterile)	Miltex	4-310
Syringes (3 ml and 5 ml, sterile)	BD	309657 and 306646
Needles (27 G, sterile)	BD	305109
Angiocatheter (24 G, sterile)	BD	381412
Monoject blunt cannula (15 G)	Kendall	SWD202314Z
Sutures	Fisher Scientific	NC9782896
Dynal magnet particle collector	Invitrogen	120-01D	This is a critical tool for the protocol.
Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile)	BD	353001, 353004, and 353003	Any brand of tissue culture plates will be fine.
Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel)	American Diagnostic Corporation	3424
Forceps (4 inch stainless steel)	Quick Medical	L5-5004
D-PBS	Mediatech	21-031-CV
M199 media	Mediatech	10-060-CV
Penicillin/streptomycin	VWR	TX16777-164NWU
Fetal bovine serum	Hyclone/Thermo Scientific	SH3091003	Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor.
Iron particles (iron (II, III) oxide powder)	Aldrich Chemical Company	#31,006-9
Agarose	Sigma	A9539
Collagenase (made to 80 U/ml)	Sigma	C5138
Isoflurane	Butlet Schein	NDC 11695-6776-1
Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera	Nikon	TE2000-U	Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture.
Anti-desmin antibody	Sigma	D-8281	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Anti-smooth muscle myosin	Biomedical Technologies	BT-562	Use at 1:2,000 dilution for immunostaining.
Rhodamine-red anti-rabbit secondary	Molecular Probes/Invitrogen	R-6394	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera	Nikon	TE300	Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining.
Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit	Enzo Life Sciences	BML-AK800-0001	This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available.
Sildenafil	Sigma	PZ-0003	A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis.