Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter Düz Kas Hücre İzolasyonu

Özet

Biz, böylece yeni doğan düz kas hücresi kasılma ve gevşeme dahil sinyal yollarının daha iyi çalışma izin olarak, yeni ve P7 kadar küçük farelerden pulmoner arter düz kas hücrelerinin primer kültürleri (PASMC) izole etmek için kullanışlı bir teknik geliştirdik.

Özet

Pulmoner hipertansiyon morbidite ve bebeklerde mortalite önemli bir nedenidir. Tarihsel olarak, fetal koyun PASMC vasküler düz kas kasılması yer alan sinyal yollarının önemli bir çalışma olmuştur. Koyun vadeli pulmoner hipertansiyon mükemmel bir model yaparken, çok pahalı ve farelerde bulunan genetik manipülasyon avantajı eksikliği. Tersine, fareler PASMC izole etmek yetersizlik, bu sistemin önemli bir sınırlama oldu. Burada Marshall et al daha önce anlatılan tekniğin bir varyasyonu kullanılarak P7, P14 ve P21 farelerden fare PASMC birincil kültürleri izole edilmesi tarif. ²⁶ önceden sıçan PASMC izole etmek için kullanılır oldu. Bu fare PASMC yenidoğan döneminde sinyal yolları çalışmaları için yeni bir araç temsil eder. Kısaca,% 0.5 'lik bir çamur (ağ / hac) agaroz + M199 ortamı içinde% 0.5 demir partikülleri, sağ ventrikül (RV) ile pulmoner vasküler yatak içine aşılanmıştır.demir parçacıkları çapı 0.2 mcM ve pulmoner kapiller yatak geçemez. Böylece, küçük pulmoner arter (PA) demir zâviye. Akciğerler kaldırıldı ve ayrışmış agaroz, şişirilir. Demir içeren gemiler bir mıknatıs ile aşağı çekilir. Kolajenaz (80 U / ml) daha fazla işleme ve ayrışma sonra kaplar kültür kabı üzerine hücre göçü izin vermek için% 20 fetal sığır serumu (FBS) ve antibiyotikler (M199 tam kültür ortamı) ihtiva eden M199 ortamı içinde, bir doku kültürü kabı içine konur . Bu hücre ilk plaka fibroblastlar ve PASMC bir 50-50 karışımıdır. Bu nedenle, prosedür aşağı çekme bir daha saf PASMC nüfus elde etmek ve herhangi bir kalıntı demir kaldırmak için birden çok kez tekrarlanır. Düz kas hücre kimlik düz kas miyozin ve desmin için immün ile teyit edilir.

Giriş

Plasenta gaz değişimi en önemli organı olarak hizmet verir ve kalp debisi sadece% 10 pulmoner vasküler yatak dolaşıyor yana Pulmoner hipertansiyon intrauterin ömrü boyunca normaldir. Utero olarak, akciğer basıncı yüksek pulmoner vasküler direnç nedeniyle sistemik basınçları benzer . Gebelik ilerledikçe, akciğer içindeki küçük PA hızlı büyüme doğum ¹ gerçekleşir pulmoner kan akımında dramatik artış için fetus hazırlanıyor vardır. Normal perinatal geçiş kısa vadeli ve tam süreli bebeklerde başarısız olduğunda, sonuç (PPHN) yenidoğanın persistan pulmoner hipertansiyon. PPHN çok farklı altta yatan patolojiler neden olduğu bir klinik sendromdur. Ancak, bu bebeklerin tüm bu duktus arteriozus veya için kalıcı fetal bağlantıları arasındaki bu yüksek pulmoner vasküler direnç, hipoksemi ve kan akımının sağdan sola şant gibi ortak patofizyolojik özellikleri paylaşmakovale amin. PPHN 1000 canlı doğumda 2-6 etkiler ve ölüm gibi önemli kısa vadeli ve uzun vadeli morbidite ² bir% 8-10 risk taşır. Ayrıca, çok düşük doğum ağırlıklı prematüre bebeklerde altta yatan akciğer hastalığı sonucu pulmoner hipertansiyon gelişebilir. Prematüre bebeklerde en sık altta yatan akciğer hastalığı bronkopulmoner displazi (BPD) 'dir. BPD genel risk gebelik yaşı ve doğum ağırlığı ile ilişkilidir ise bu bebeklerin bir alt kümesi önemli pulmoner hipertansiyon ve nasıl uygun bu bebeklerin tedavisinde geliştirir neden, belirsizliğini koruyor. Uzun süreli hastanede kalış ve artan ölüm de dahil olmak üzere kötü sonuçlar, ^3-6 yaygındır.

Tarihsel olarak, sağlıklı hayvanlardan alınan koyun veya domuz fetal PASMC fetal PASMC doğumdan sonra normal pulmoner vasküler geçiş dahil sinyal yollarının incelemek için kullanılmıştır. Bunlar, tipik olarak, bir beşinci nesli direnç PA izole edilirn koyun ya da herhangi bir spontan solunum ^7-9 önce teslim ve ötenazi domuz fetus. Ayrıca, bazı araştırmacılar izole ve biraz büyük gelen PASMC kullanılan ve kendiliğinden 3 gün, 2 hafta ve 4 hafta ^10-12 kuzu ve domuz nefes var. Daha yakın zamanda, bazı grupları başarıyla izole edilmiş ve hastalık durumunun ^13-17 yolaklarının sinyalizasyon bozuklukların incelemek PPHN Kuzuların izole PASMC faydalanmaktadır. Bu hücreler sinyal yolları normal ve hastalıklı kısa vadeli ve dönem pulmoner vasküler hem de çok önemli olan incelemek için değerli bir araç olduğu görüldü. Ancak, pulmoner hipertansiyon ile prematüre bebeklerde etkiledi sinyal yolları hakkında fikir vermeyin. Ne de hastalığın fare modellerinde görülen genetik manipülasyon olanakları izin veriyoruz.

Sıçan ve fare modelleri uzun modeli BPB için kullanılmıştır ve daha yakın zamanlarda modeli pulmoner hy için kullanılmaktadırBPD ^18-22 kaynaklanan pertension. Yenidoğan sıçan onların büyük boyutu nedeniyle çalışmak için cazip, ama onlar da genetik modifikasyon için potansiyel eksikliği muzdarip. Genetiği değiştirilmiş hayvanlar kapsamlı yenidoğan farelerde bütün hayvan fizyolojisi ile ilgili özel gen hedefleri etkilerini araştırmak için, ama kimse daha önce başarılı bir şekilde bu küçük fareler PASMC izole bugüne kadar kullanılmıştır. PASMC izole ederek, daha fazla bilgi yolları çevresel uyaranlara ve / veya pulmoner arter düz kas özellikle genetik modifikasyon yanıt olarak nasıl değiştiğini hakkında elde edilebilir. Ayrıca, canlı PASMC kalsiyum ve reaktif oksijen türleri ^23-25 ​​gibi önemli sinyal molekülleri hızlı değişiklikleri incelemek için gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir. Son zamanlarda Marshall et al, tekniğin bir varyasyonu kullanılarak erişkin farelerden elde edilen PASMC başarılı bir şekilde izole edilmesi tarif. ²⁶ sıçan PASMC ^23,25,26 izole etmek için kullanılabilir. Şimdi bir adapte olmasınd 7-21 gün yaş küçük fareler (P7, P14, ve P21) için bu tekniği uzatıldı. Bu yeni PASMC izolasyon tekniği için birincil sınırlama bu deneyler için yeterli hücre elde etmek için birden fazla farenin gerektirir ve hücrelerin, birincil düz kas hücrelerinin karakteristik olan, çok yavaş bir şekilde bu olmasıdır. Bu kısıtlamalara rağmen, biz yenidoğan fare PASMC izole etmek için bu tekniği pulmoner hipertansiyon gelişiminde rol oynadığı ve bu alanda önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir önemli sinyal yollarının gelişmiş soruşturma için izin inanıyoruz.

Protokol

Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu bu protokolü onayladı.

1. Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter İzolasyon - Day One

1. 100 ml (nihai konsantrasyon =% 20) ısı ile deaktive edilmiş FBS ve 5 ml (nihai konsantrasyon =% 1) Penisilin / Streptomisin ile karıştırın 400 ml M199 - Komple M199 ortamı hazırlayın.
2. 5 ml (nihai konsantrasyon =% 1) Penisilin / Streptomisin ile karıştırın 500 ml M199 - serum serbest M199 ortamı hazırlayın.
3. Mix 0.05 g agaroz artı 10 ml steril, serum serbest M199 medya 0.05 g demir parçacıkları - PA Agaroz hazırlayın.
4. 10 ml steril, serumsuz M199 ortamı içinde karıştırın, 0.1 g agarozun - Akciğer agaroz hazırlayın.
5. Steril filtre Bu karışım daha sonra 80 U / ml 'lik bir nihai konsantrasyonda, steril, serum içermeyen ortam ile karışır M199 kolajenaz ve - kollajenaz hazırlayın.
6. Fare ötenazi önce vaktinden tüm donanımları kurmak.
7. Fare ötenazi hemen önce kaynamaya PA agaroz ve akciğer agaroz ayarlayın.
8. Izofluran doz aşımı ile anestezi kavanoza fare Euthanize ve izofluran ile temas için fare yavru izin vermemek için dikkatli olun. En iyi hücre verimi hücrelerin ölümünden sonra dolaşımda oluşturan mikro pıhtılar önlemek için ölümden hemen sonra hasat zaman elde edilir.
9. Anestezi kavanoz fareyi çıkarın, işletim kartına fare güvenli ve fare, aletler ve alkol ile eldiven sterilize edin.
10. Bıçak ile neşter yükleyin ve boyun alt karın için fareyi insizyon.
11. Farenizin sol tarafta karın açın, böbrek maruz ve fare böylece akciğerlerin küçük damarlarda pıhtı kaçınarak, asıl bulbus olfaktoryusları alındı ​​sağlamak için renal arter kesti.
12. En farenin sol tarafında kesmek için makas kullanınsternum toraks açmak için.
13. Dikkatle her iki tarafta da diyafram kesilmiş ve tam göğüs boşluğu açmak için neşter kullanmak. Göğüs boşluğuna açık tutmak için forseps veya işaretçilerine kullanın.
14. PA yönelik bir 27 G ½ inç iğne ile RV sopa ve akciğer (tüm kan pulmoner dolaşım dışına kızarmış) beyaz görünmesini kadar steril PBS ile RV / PA / akciğer serpmek. Bu fare büyüklüğüne bağlı olarak PBS içinde yaklaşık 3-5 ml alacaktır. Bu, küçük bir akciğer damarlarında pıhtı oluşumunu önlemek için ilk fışkırma için önemlidir.
15. Dikkatlice trakea ve iplik bir dikiş altında ortaya çıkarmak için künt diseksiyon kullanın.
16. Destek için trakea altındaki küçük forseps koyun ve trakea içine 24 G angiocatheter yerleştirin. IV yerleştirme gibi angiocatheter yerleştirin.
17. Adım 1.16 olarak dişli dikiş ile trakea içine angiocatheter sabitleyin.
18. Kaynar su dışında kaynar Pensilvanya agaroz alın ve iyice karıştırın için ters. Agaro soğutunSE buz üzerinde dönen yaklaşık vücut sıcaklığına getirilir. Agaroz çözeltide kalır ama bu PA hücrelere zarar verir, böylece sıcak olmayacak gerekmektedir.
19. Bir 27 G ½ inç iğne ile RV sopa ve akciğer gri görünür kadar PA agaroz ile RV / PA / akciğer serpmek. Agaroz karışımı demir parçacıklar akciğer gri renkli görünür hale getirecek. Bu fare büyüklüğüne bağlı olarak, PA agaroz yaklaşık 3-5 ml alacaktır. Bu demir solunum yollarına akmasına neden olabilir çok hızlı enjekte yavaş yavaş gitmek için de önemlidir.
20. Kaynar su akciğer agaroz çıkarın ve iyice karıştırın için ters. Daha sonra buz üzerinde dönen yaklaşık vücut sıcaklığına soğumaya agaroz. Agaroz çözeltide kalır ama bu da, akciğer hücrelerine zarar böylece sıcak olmayacak gerekmektedir.
21. Akciğer agaroz hazırlamak ve trakea içinde 24 G angiocatheter için şırınga takın. Tam olarak akciğer şişirmek için trakea yoluyla agaroz demlenmeye. Akciğerler easie olacakr akciğer uygun şişirilmiş ise (daha sonra adımlara bakın) kıyma için.
22. Kalp-akciğer blok çıkarın ve batığın bu agaroz (~ 5 dk) katılaşmaya buz PBS 25 ml içine. Cerrahi alan temizlemek için bu kez kullanın.
23. Yenidoğan fareler için (P7-P21), en iyi PASMC verim hücrelerin tek bir grupta 2-3 yavrular bir araya geliyor. PASMC optimum hücre sağlık ve büyümesi için diğer hücreler ile temas halinde olması tercih ederler. Bir fare izolasyon başına kullanılırsa, o zaman hücreler, seyrek ve iyi büyümez. Birlikte hayvanlar, hasat ve soğuk kalp-akciğer blokları birleştirerek ve tüm kalp-akciğer blok hayvanlardan kaldırıldı kez daha sonra kıyma için taşıdığınızda.
24. Bu noktadan itibaren kısırlık için hücre kültürü kaputu taşı.
25. 10 cm doku kültürü çanak kapağı içine soğutulmuş akciğer yerleştirin ve dikkatli bir şekilde kalp, timus, trakea ve akciğer herhangi bir bağ dokusu çıkarın.
26. 10 cm doku kültürü çanak alt karşı akciğerlerde hareketve yaklaşık 1 ml buz gibi soğuk steril PBS ilave edin.
27. 2 neşter ile çok küçük parçalar (1-2 mm) içine akciğer kıyma.
28. Steril bir 5 ml serolojik pipet kapalı ucu kırın. Pipet steril 50 ml konik tüp içine akciğer bulamaç kıyılmış. Akciğer dokusunun tüm 50 ml konik tüp içine alır sigortalamak için plaka yıkamak için ek steril buz gibi soğuk PBS kullanın.
29. Mıknatıs üzerine 50 ml konik tüp yerleştirin. Demir içeren doku mıknatıs yanında borunun yan taşımak için bekleyin. Akciğer dokusuna demir içeren geminin oranına bağlı olarak, gemilerin bazıları hala bu noktada yüzen olabilir. Bu gemilerin içeriyorsa belli olduğu için PBS yavaş ve dikkatli bir şekilde yüzen akciğer dokusu aspire etmemeye çalışıyor kapalı aspire.
30. Tekrar aspire edilir akciğer dokusunun miktarını en aza indirmek için çalışıyor, 5 ml steril PBS ile akciğer pelet 3x yıkayın.
31. 3 ml kollajenaz içinde akciğer pelet tekrar süspansiyon ve 60 mm doku kültürü çanak içine dökün. YapmaBu pipetle için çalışalım, akciğer parçaları da pipet iç sadık olacaktır.
32. Boşaltma işleminin hemen sonrasında boru durulama ve hem de 60 mm doku kültürü çanağı içine dökmek için bu, fazladan bir 3 ml kullanın.
33. 1 saat boyunca 37 ° C doku kültürü inkübatör içine yerleştirin.
34. Pipet doku + 5 ml şırınga bir 15 G künt iğne ile kollajenaz bulamaç yukarı ve aşağı tüm büyük akciğer parçaları bozulur kadar. Doku + kollajenaz çamur görünür doku parçaları ile bu noktada bulutlu olacak.
35. Yeni bir steril 50 ml konik tüp içine dökün ve mıknatıs eklemek.
36. Dokunun tüm toplanan edilmiş olmasını sağlamak için tam M199 ortamın yaklaşık 5 ml doku kültürü bulaşık yıkama, ve konik bir tüp içine bu dökün.
37. Kollajenaz + medya süpernatant kapalı aspire. Bu süre çok az yüzen cisimlerin olacak ve kompakt bir demir-içeren pelet mıknatıs yanındaki konik tüp tarafında olacaktır.
38. 5 ml tam Med ile yıkayınız3x ia. Bu kollajenaz inaktive etmek için gereklidir.
39. Eksiksiz bir medya 3 ml ekleyin ve demir içeren pelet tekrar süspansiyon birkaç kez aşağı karıştırmak ve.
40. 35 mm doku kültürü çanak içine süspanse pelet dökün. Bir mikroskop kullanılarak, damar lümen bulunan demir parçacıkları etrafında yüzen küçük kap parçaları olacaktır.
41. Gecede doku kültürü inkübatör doku kültürü çanak (plaka sıfır etiketli) yerleştirin. Plaka sıfır üzerine kapalı geçirmek için ilk hücreleri düz kas işaretleri için boyama dayalı yaklaşık% 50 fibroblast ve% 50 PASMC vardır. Bu plaka kaplama sıfır denir ve sonuçta sonraki zenginleştirme basamakları sonra atılır.

2. Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter İzolasyon - İkinci Gün

1. Temiz bir 50 ml konik tüp içine plaka sıfırdan süpernatant medya dökün.
2. Medya süpernatant aspire. Bu zaman hemen hemen hiç uçuşan cisimler olabilir ve kompakt bir demir-conta olacakadencilik pelet mıknatıs yanındaki konik tüp tarafında oluşturacaktır.
3. 5 ml tam ortam 3x ile yıkayın.
4. Eksiksiz bir medya 3 ml ekleyin ve demir içeren pelet tekrar süspansiyon birkaç kez aşağı karıştırmak ve.
5. 35 mm doku kültürü çanak içine dökün. Bir mikroskop kullanılarak, damar lümen bulunan demir parçacıkları etrafında yüzen küçük kap parçaları görülür. Bu (Şekil 1A) plaka biri olacaktır.
6. Doku kültürü inkübatöründe doku kültür tabağına yerleştirin.

3. Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter İzolasyon - Gün Altı

1. Temiz bir 50 ml konik tüp içine plaka birinden süpernatant medya dökün. Bu adımı birden çok kez tekrar damar duvarında ikamet düz kas hücrelerinin her bir hücre kültürü plaka üzerine kapalı geçirmek için bir fırsat olduğunu sigortalanır. Her plaka yani her adımda bir azalan dönüş daha az ve daha az hücre bağlı olacaktır vardır.
tekrar çember yükleme özelliği plaka bir.
2. Medya süpernatant aspire. Bu zaman neredeyse hiçbir yüzen cisimlerin olacak ve kompakt bir demir-içeren pelet mıknatıs yanındaki konik tüp tarafında oluşturacaktır.
3. 5 ml tam ortam 3x ile yıkayın.
4. Eksiksiz bir medya 3 ml ekleyin ve demir içeren pelet tekrar süspansiyon birkaç kez aşağı karıştırmak ve.
5. 35 mm doku kültürü çanak içine dökün. Bir mikroskop kullanılarak, damar lümen bulunan demir parçacıkları etrafında yüzen küçük kap parçaları görülür. Bu plaka iki olacaktır.
6. Doku kültürü inkübatöründe doku kültür tabağına yerleştirin.

4. Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter İzolasyon - Gün Dokuz

1. Doku kültürü çanak plaka iki temiz bir 50 ml konik bir tüp içine medya süpernatant dökün.
2. Tekrar çember yükleme özelliği tam M199 medya ile plaka iki ve yerine geri doku kültürü içineinkübatör.
3. Medya süpernatant aspire. Bu zaman neredeyse hiçbir yüzen cisimlerin olacak ve kompakt bir demir-içeren pelet mıknatıs yanındaki konik tüp tarafında oluşturacaktır.
4. 5 ml tam ortam 3x ile yıkayın.
5. Eksiksiz bir medya 3 ml ekleyin ve demir içeren pelet tekrar süspansiyon birkaç kez aşağı karıştırmak ve.
6. 35 mm doku kültürü çanak içine dökün. Bir mikroskop kullanılarak, damar lümen bulunan demir parçacıkları etrafında yüzen küçük kap parçaları görülür. Bu plaka üç olacak.
7. Doku kültürü inkübatöründe doku kültür tabağına yerleştirin.

5. Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter İzolasyon - Gün Thirteen

1. 1-3 plakaların medya kapalı aspire.
2. Yavaşça sıcak, steril PBS ile hücreleri yıkayın.
3. Hücrelerini trypsinize için her plakaya tripsin (~ 0.25-0.5 ml) tripsin ince bir tabaka ekleyin. Hücreler çok yapışık ve doku cultu içinde tripsin olması gerekirplaka çıkarmak için yaklaşık 10 dakika inkübatör yeniden.
4. Herhangi bir kalıntı demir partikülleri çekmek için mıknatıs bağlı bir 50 ml konik tüp içinde 5 ml tam ortama plakalar Hasat hücreleri.
5. Tam ortam ilave 0.5 mL 'si ile plakaların her yıkayın ve 50 ml konik tüp, medya ekleyin.
6. Bu kez, medya süpernatant (aspire yok) almak ve demir parçacık pelet atın.
7. Plaka 60 mm tabak içinde 5 ml tam M199 medya hücreleri birkaç gün içinde konfluent hücreler olması. Alternatif olarak, plaka 10 ml tam M199 10 cm plaka medya ve PASMC hücrelerin izdiham ulaşmak için yaklaşık bir 1-2 hafta sürer.

6. Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter İzolasyon - Gün Ondört

1. Herhangi bir kalıntı tripsin kaldırmak için taze tam M199 medya için ortam değiştirin. Doku kültürü çanak (Şekil 1B) üzerinde PASMC ince bir nüfus olacak.

7. Rutin Bakım

1. Taze tam M199 medya için ortam değiştirin yaklaşık haftada 2x.
2. Bu hücreler, tripsin bir film inkübatör yaklaşık 10 dakika (0.25-0.5 ml) bir plaka çıkarmak için hücrelerin bölünme gerekli olduğunda. Tripsin filmi kullanarak hücrelerin aşağı sıkma yapmadan PASMC bir replating sağlar. Çok fazla tripsin kullanılırsa, o zaman PASMC tripsin üzerinden dönmeye santrifüj gerekir, veya hücre plakasına readhere olmayacaktır. Bazen, hücreleri aşağı iplik sonra, tam M199 medya içine yeniden süspanse PASMC almak zordur.
3. Gözlemler, izole edilmiş PASMC 4-5 geçişleri için güvenilir düz kas hücreleri gibi davranırlar, ama düz kas hücre geçişi 7 kadar işaretleme kalemler için izole hücreleri leke olacaktır. Geçit 2 (tripsin ilk maruz kaldıktan sonra kaplama) olarak günde on üç ilk toplanmış 60 mm ya da 10 cm plaka sayın.

Sonuçlar

Izolasyon sırasında ve sonrasında, PASMC ışık mikroskobunda ve düz kas hücre belirteçleri için immün her iki incelenir. Erken protokolde ışık mikroskobu ile, PASMC gemiler (Şekil 1A) içeren küçük demir doku kültürü çanak üzerine göç görülür. Gün on üç on plakalar üç ile bir havuzu sonra, daha sonra demir parçacıkları bu son havuzu adımda çıkardı edilmiş olarak artık değerlendirildiğini biliyoruz. Bunun yerine, PASMC nüfusu doku kültürü çanak (Şe...

Tartışmalar

Bu yazıda, ilk kez P7, P14, ve P21 de farelerden alınan PASMC en izolasyonu için tarif. Bunu gerçekleştirmek için, agaroz ve 0.2 uM demir zerrelerin bir bulamacı PA içine RV ile infüze edilir. Demir parçacıkları küçük boyutu nedeniyle, pulmoner kapiller yatak geçemez ve böylece küçük PA yatırılır. Akciğerler, şişirilmiş kaldırılır ve ayrışmış vardır. Demir içeren gemilerin bir mıknatıs kullanarak çözüm çıkardı vardır. Sonuçta, gemilerin bir doku kültürü çanak içine kapl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bard Parker surgical blade handle	BD	371030
Stainless steel surgical blades #10 (sterile)	Miltex	4-310
Syringes (3 ml and 5 ml, sterile)	BD	309657 and 306646
Needles (27 G, sterile)	BD	305109
Angiocatheter (24 G, sterile)	BD	381412
Monoject blunt cannula (15 G)	Kendall	SWD202314Z
Sutures	Fisher Scientific	NC9782896
Dynal magnet particle collector	Invitrogen	120-01D	This is a critical tool for the protocol.
Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile)	BD	353001, 353004, and 353003	Any brand of tissue culture plates will be fine.
Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel)	American Diagnostic Corporation	3424
Forceps (4 inch stainless steel)	Quick Medical	L5-5004
D-PBS	Mediatech	21-031-CV
M199 media	Mediatech	10-060-CV
Penicillin/streptomycin	VWR	TX16777-164NWU
Fetal bovine serum	Hyclone/Thermo Scientific	SH3091003	Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor.
Iron particles (iron (II, III) oxide powder)	Aldrich Chemical Company	#31,006-9
Agarose	Sigma	A9539
Collagenase (made to 80 U/ml)	Sigma	C5138
Isoflurane	Butlet Schein	NDC 11695-6776-1
Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera	Nikon	TE2000-U	Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture.
Anti-desmin antibody	Sigma	D-8281	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Anti-smooth muscle myosin	Biomedical Technologies	BT-562	Use at 1:2,000 dilution for immunostaining.
Rhodamine-red anti-rabbit secondary	Molecular Probes/Invitrogen	R-6394	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera	Nikon	TE300	Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining.
Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit	Enzo Life Sciences	BML-AK800-0001	This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available.
Sildenafil	Sigma	PZ-0003	A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis.