新生児マウスから肺動脈平滑筋細胞の単離

要約

我々は、それによって新生児の平滑筋細胞の収縮と弛緩に関与するシグナル伝達経路のより良好な研究を可能にする、新規かつP7の幼いマウスからの肺動脈平滑筋細胞の初代培養物（PASMC）を単離するための再現可能な技術を開発した。

要約

肺高血圧症は、罹患率と乳児死亡の重要な原因である。歴史的には、胎児の羊からPASMCにおける血管平滑筋の収縮に関わるシグナル伝達経路の重要な研究があった。羊用語肺高血圧症の優れたモデルを作るが、それらは非常に高価であり、マウスに見られる遺伝子操作の利点を欠いている。逆に、マウスからPASMCを分離することができないことは、そのシステムの重要な制限だった。ここでは、マーシャルらの前述の手法のバリエーションを用いP7、P14、P21及びマウスからマウスPASMCの初代培養物の単離を記載している^。26は、予めラットPASMCを単離するために使用された。これらのネズミPASMCは新生児期にシグナル伝達経路の研究のための新規ツールを表しています。簡潔には、0.5％（w / v）のアガロース+ 0.5％鉄粒子M199培地中のスラリーは、右心室（RV）を介して、肺血管床に注入される。ザ鉄粒子は、直径が0.2μMであり、肺毛細血管床を通過することができない。したがって、小肺動脈（PA）の鉄のロッジ。肺は削除され、解離アガロースで膨張している。鉄含有容器は磁石でプルダウンされています。コラゲナーゼ（80 U / ml）で処理し、さらに解離した後、容器は、培養皿の上に細胞移動を可能にするために、20％ウシ胎児血清（FBS）および抗生物質（M199完全培地）を含むM199培地中で組織培養皿に入れられ。細胞のこの最初のプレートは、線維芽細胞およびPASMCの50-50混合物である。したがって、手順​​プルダウンはより純粋PASMC集団を実現し、任意の残留鉄を除去するために複数回繰り返される。平滑筋細胞のアイデンティティは、平滑筋ミオシンとデスミンの免疫染色によって確認された。

概要

胎盤は、ガス交換の主要な器官として機能し、心拍出量の10％だけが、肺血管床を通って循環されるため、肺高血圧症は、子宮内の生命の間に正常な動作です。 子宮内では 、肺の圧力が上昇し、肺血管抵抗が原因で全身の圧力に類似しています。妊娠が進行するにつれて、肺内の小さなPAの急速な成長は、出生¹で生じる肺血流量の劇的な増加のために胎児の調製がある。通常の周産期の移行は短期的とフル期産児に失敗した場合、結果は（PPHN）新生児遷延性肺高血圧症である。 PPHNは、さまざまな基本的な病態に起因する臨床的な症候群である。しかし、これらの乳児のすべてがこのような高められた肺血管抵抗、低酸素血症、動脈管開存症などのような永続的な接続の間または胎児のために血流の右から左への短絡などの一般的な病態生理学的特徴を共有卵円アーメン。 PPHNは出生1,000人あたり2-6に影響を与え、死亡率と同様に重要な短期および長期罹患²の8〜10％のリスクを伝える。さらに、超低出生体重未熟児は、その基礎となる肺疾患の結果として肺高血圧を開発することがあります。未熟児の最も一般的な基本的な肺疾患は、気管支肺異形成症（BPD）です。 BPDの全体的なリスクは、在胎週数と出生体重と相関しながら、これらの乳幼児のサブセットが著しい肺高血圧症を開発し、どのように適切にこれらの乳児を治療する理由、それは不明である。長引く入院や死亡率の増加など、悪い結果は^、3-6一般的です。

歴史的には、健康な動物からヒツジ胎児PASMC又はブタ胎児PASMCは出産後に正常肺血管転移に関与するシグナル伝達経路を研究するために使用されている。これらは、典型的には、第五世代の抵抗PAから分離されnのヒツジまたは任意の自発呼吸^7-9前に配信され、安楽死させているブタ胎児。さらに、いくつかの研究者が単離され、少し古いからPASMC利用と自発的に3日間、2週間と4週間^10-12で子羊や子豚を呼吸している。最近では、いくつかのグループが成功した疾患状態^13-17でシグナル伝達経路で撹乱を検討するPPHNと子羊から分離PASMCを分離し、利用してきた。これらの細胞は、シグナル伝達経路は正常と病気の短期的および長期的肺血管系の両方で非常に重要である検討する貴重なツールであることが証明されている。しかし、彼らは、肺高血圧症の未熟児に影響するシグナル伝達経路への洞察を与えることはありません。また彼らは、疾患のマウスモデルに見られる遺伝子操作の可能性を可能にするない。

ラットおよびマウスモデル長いモデルBPDに使用されており、さらに最近で肺HYをモデル化するために使用されているBPD ^18-22起因pertension。新生児ラットは彼らの大きなサイズに起因すると動作するように誘導されているが、彼らはまた、遺伝子組み換えの可能性の欠如に苦しんでいます。遺伝的に改変された動物は、広く新生児マウスにおける全体の動物生理学上の特定の遺伝子標的の効果を調査するために、誰が以前に正常にこれらの小さなマウスから単離されていないPASMC今日まで用いられてきた。 PASMCを単離することにより、より大きな情報が経路が環境刺激および/または肺動脈平滑筋特異的遺伝子改変に応じてどのように変化するかについて得ることができる。さらに、ライブPASMCは、カルシウムと活性酸素種^23-25 ​​などの主要シグナル伝達分子の急速な変化を調べるために、リアルタイムで画像化することができる。我々は、最近、マーシャルらの手法のバリエーションを用いて成体マウスからPASMCの正常な単離を記載している^。26は、ラットPASMC ^23,25,26を単離するために用いられる。我々は今、適応しているndは7-21日齢の小さなマウス（P7、P14、およびP21）にこの手法を拡張した。この新しいPASMC分離技術の主な制約は、それが実験のために十分な細胞を作製するために複数のマウスを必要とする細胞は、一次平滑筋細胞の特徴である、非常にゆっくりと成長することである。これらの制限にもかかわらず、我々は新生児マウスPASMCを分離するために、この手法は肺高血圧症の発症に関与する重要なシグナル伝達経路の強化された調査を可能にし、この分野で飛躍的な進歩を表していると考えています。

プロトコル

ノースウェスタン大学の制度動物実験委員会は、このプロトコルを承認した。

1。新生児マウスから肺動脈の分離 - 一日目

1. 100ミリリットル（最終濃度= 20％）、熱不活性化FBS、5ミリリットル（最終濃度= 1％）ペニシリン/ストレプトマイシンをミックス400ミリリットルM199 - 完全M199メディアを準備します。
2. 5ミリリットル（最終濃度= 1％）ペニシリン/ストレプトマイシンをミックス500ミリリットルM199 -無血清M199メディアを準備します。
3. ミックス0.05グラムアガロースプラス10 mlの滅菌、無血清培地M199 0.05グラム鉄粒子- PAアガロースを準備します。
4. 10ミリリットル滅菌、無血清培地中でミックスM199 0.1グラムアガロース- 肺アガロースを準備します。
5. 無菌フィルターこの混合物を80 U / mlの最終濃度で無菌、無血清M199メディアにミックスコラゲナーゼと- コラゲナーゼを準備します。
6. マウスを安楽死前に前もって機器のすべてを設定します。
7. PAアガロースと肺アガロースマウスを安楽死直前に沸騰するように設定します。
8. イソフルラン過剰摂取と麻酔薬瓶でマウスを安楽死させるとイソフルランと接触するマウスが子犬許可しないように注意してください。最高の細胞収率は、細胞が死亡した後に、循環中に形成マイクロ凝血塊を避けるために死亡した直後に収穫される場合に得られる。
9. 麻酔薬の瓶からマウスを外し、操作ボードにマウスを固定し、マウス、楽器、アルコールで手袋を殺菌。
10. ブレードとメスをロードし、首から劣っ腹部にマウスを切開。
11. マウスの左側腹部を開き、腎臓を露出させて、マウスは、それによって肺の小血管に血栓を避け、血を抜くことができるように腎動脈を切った。
12. のマウスの左サイドに沿ってカットするはさみを使用して、胸骨は、胸郭を開きます。
13. 慎重に両側横隔膜をカットし、完全に胸腔を開くためにメスを使用しています。胸腔を開いたままに鉗子やピンを使用してください。
14. PAに向け27 G½インチの針でRVを固執し、肺が（すべての血液が肺循環からフラッシュ）白表示されるまで、滅菌PBSでRV / PA /肺灌流。これは、マウスの大きさに応じてPBSの約3〜5ミリリットル取る。小さな肺血管の血栓形成を防止するために最初にフラッシュすることが重要である。
15. 慎重に気管とスレッド1縫合下を露出するために鈍的切開を使用しています。
16. サポートのための気管の下に最小鉗子を入れて、気管に24 Gの血管カテーテルを配置。 IVを置いているかのように血管カテーテルを置きます。
17. ステップ1.16のネジ縫合と気管に血管カテーテルを固定します。
18. 沸騰したお湯のうち沸騰PAアガロースを取り、よく混ぜて反転。アガロオリゴを冷却氷の上で渦巻くで約体温にSE。アガロース溶液中に残存する必要があるが、それはPAの細胞を損傷するように熱くならない。
19. 27 G½インチ針でRVを固執し、肺がグレー表示されるまでPAアガロースでRV / PA /肺灌流。アガロース混合物中の鉄粒子は、肺の色がグレー表示になります。これは、マウスの大きさに応じてアガロースPAの約3〜5ミリリットル取る。それはあまりにも速く鉄が気道に漏れることがあり注入としてゆっくり行くことも重要です。
20. 沸騰したお湯の肺アガロース外を取るとよく混ぜて反転。その後、氷の上で渦巻くによっておよそ体温にアガロースを冷却する。アガロース溶液中に残存する必要があるが、それが肺の細胞を損傷するように熱くならない。
21. 肺アガロースを策定し、気管に24 Gの血管カテーテルにシリンジを取り付けます。完全に肺を膨らませるために気管を通してアガロースを注入。肺はeasieなるR肺が適切に膨張している場合（後述の手順を参照してください）​​ミンチする。
22. 心肺ブロックを取り外し、アガロース（〜5分）を固めるための氷冷PBS 25mlの中に沈めること。手術領域をクリーンアップするために、この時間を使用しています。
23. 新生児マウス（P7-P21）のために、最善PASMC収量は細胞の1バッチに2-3子犬を組み合わせることから来ている。 PASMCは、最適な細胞の健康や成長のための他の細胞と接触させることを好む。マウスを一回の単離ごとに使用される場合、その細胞は非常にまばらであり、十分に成長しない。一緒に動物、収穫とチル心肺圏を組み合わせ、すべての心肺圏が動物から削除された後、その後ミンチに移動する。
24. この時点以降の不妊のための細胞培養フードに移動します。
25. 10センチ組織培養皿の蓋にチルド肺を置き、慎重に心臓、胸腺、気管、肺からの結合組織を除去します。
26. 10センチ組織培養皿の底に肺を移動するそして約1ミリリットルの氷冷滅菌PBSを追加します。
27. 2メスと非常に小さな部分（1-2㎜）に肺をミンチ。
28. 滅菌5ミリリットル血清ピペットの先端を絶つ。ピペットは無菌で50ミリリットルコニカルチューブに肺スラリーをみじん切り。肺組織のすべてが50 mlコニカルチューブに入ったことを保証するためにプレートを洗浄するために追加の無菌氷冷PBSを使用してください。
29. 磁石の上に50ミリリットルコニカルチューブを置きます。鉄含有組織が磁石の隣にチューブの側に移動するまで待ちます。肺組織の鉄含有容器の割合に応じて、血管の一部も、この時点で浮かぶことができる。それは血管が含まれている場合、それは不明であるため、フローティング肺組織を吸引しないことをしようとしてゆっくりと慎重にPBSをオフに吸引。
30. 再び吸引される肺組織の量を最小限にしようと5mlの滅菌PBSで3回肺ペレットを洗浄する。
31. 3ミリリットルのコラゲナーゼで肺ペレットを再懸濁し、60ミリメートル組織培養皿に注ぐ。しないでくださいこれをピペットしよう、肺の塊は、ピペットの内部に固執する。
32. 注入後、チューブをすすぎ、同様に60ミリメートルの組織培養皿にこれを注ぐために追加の3ミリリットルを使用してください。
33. 1時間37℃の組織培養インキュベーターに場所。
34. ピペットは、組織+コラゲナーゼスラリー上下5ミリリットルの注射器で15 G鈍針ですべての大規模な肺の部分が破壊されるまで。組織+コラゲナーゼスラリーは目に見える組織の塊で、この時点では曇りとなります。
35. 新しい滅菌50ミリリットルコニカルチューブに注ぎ、磁石に付着する。
36. 組織の全てが収集されていることを保証するための完全なM199培地の約5mlの組織培養皿を洗浄し、コニカルチューブにこれを注ぐ。
37. コラゲナーゼ+メディア上清を吸引除去する。今回は非常に少数のフローターがあるでしょう、そしてコンパクトな鉄含有ペレットは磁石の隣にコニカルチューブの側になります。
38. 5ミリリットル完全MEDで洗う3Xイア。これは、コラゲナーゼを不活性化する必要がある。
39. 完全培地3mlのを追加し、鉄含有ペレットを再懸濁するために数回上下に混ぜて。
40. 35ミリの組織培養皿に再懸濁したペレットを注ぐ。顕微鏡を用いて、血管の内腔に含まれる鉄粒子と漂っ小血管の断片が存在する。
41. 一夜組織培養インキュベーターで組織培養皿（プレートゼロラベル）に置きます。プレートの上にゼロから移行するための最初の細胞は、約50％の線維芽細胞および平滑筋マーカーについて染色に基づく50％のPASMC、です。このプレートはメッキゼロと呼ばれ、最終的には、その後の濃縮工程の後破棄されます。

2。新生児マウスから肺動脈の分離 - 二日目

1. プレート、ゼロから新しい50 mlコニカルチューブにメディア上清を注ぐ。
2. メディア上清を吸引除去する。今回はそこにほとんどないフローターならない、とコンパクトな鉄コンタますiningペレットは磁石の隣にコニカルチューブの側面に形成することになる。
3. 3倍の5ミリリットル完全なメディアで洗う。
4. 完全培地3mlのを追加し、鉄含有ペレットを再懸濁するために数回上下に混ぜて。
5. 35ミリの組織培養皿に注ぐ。顕微鏡を使用して、血管内腔に含まれる鉄粒子と漂っ小血管の破片が見られます。これは、プレート1（ 図1A）となります。
6. 組織培養インキュベーター中で組織培養皿を置きます。

3。新生児マウスから肺動脈の分離 - 6日目

1. プレート1から新しい50 mlコニカルチューブにメディア上清を注ぐ。この工程を複数回繰り返すことにより、容器の壁に常駐して平滑筋細胞の全てが、細胞培養プレートにオフに移行する機会を持つことを保証する。各プレートすなわち各ステップで減少リターンが少なく、細胞が接着する必要がありますがあります。
2. 再給紙プレート完全M199メディアとの一つであり、組織培養インキュベーターに戻し入れます。
3. メディア上清を吸引除去する。今回は殆どフローターは存在しません、そしてコンパクトな鉄含有ペレットは磁石の隣にコニカルチューブの側面に形成することになる。
4. 3倍の5ミリリットル完全なメディアで洗う。
5. 完全培地3mlのを追加し、鉄含有ペレットを再懸濁するために数回上下に混ぜて。
6. 35ミリの組織培養皿に注ぐ。顕微鏡を使用して、血管内腔に含まれる鉄粒子と漂っ小血管の破片が見られます。これは、プレート2になります。
7. 組織培養インキュベーター中で組織培養皿を置きます。

4。新生児マウスから肺動脈の分離 - デイナイン

1. 組織培養皿プレート2から新しい50 mlコニカルチューブにメディア上清を注ぐ。
2. 再給紙プレート完全M199メディアと2、および組織文化に戻って配置インキュベーター。
3. メディア上清を吸引除去する。今回は殆どフローターは存在しません、そしてコンパクトな鉄含有ペレットは磁石の隣にコニカルチューブの側面に形成することになる。
4. 3倍の5ミリリットル完全なメディアで洗う。
5. 完全培地3 mlを加え、鉄含有ペレットを再懸濁するために数回上下に混ぜて。
6. 35ミリの組織培養皿に注ぐ。顕微鏡を使用して、血管内腔に含まれる鉄粒子と漂っ小血管の破片が見られます。これは、プレート3になります。
7. 組織培養インキュベーター中で組織培養皿を置きます。

5。新生児マウスから肺動脈の分離 - デイサーティーン

1. 1-3プレートのメディアオフを吸引。
2. 優しく暖かい、滅菌PBSで細胞を洗浄する。
3. セルをオフトリプシン処理するために、各プレートにトリプシン（〜0.25〜0.5ミリリットル）トリプシンの薄膜を追加します。細胞は非常に粘着性であり、組織cultuでトリプシンにする必要がありますプレートを持ち上げに約10分間再インキュベーター。
4. 残留鉄粒子を引き出し磁石に装着50ミリリットルコニカルチューブに5ミリリットル完全なメディアにプレートから細胞を回収。
5. 完全なメディアの追加の0.5mlの各プレートを洗浄し、50 mlコニカルチューブにそのメディアを追加します。
6. 今回は、メディア上清を（吸引していない）を取ると、鉄粒子ペレットを捨てる。
7. プレート60ミリメートル皿に5ミリリットル完全M199培地中の細胞は数日でコンフルエントの細胞を持っている。また、プレート10ミリリットル完全M199 10センチプレートのメディア、およびPASMCで細胞がコンフルエントに達するために約別の1〜2週間かかります。

6。新生児マウスから肺動脈の分離 - 14日目

1. 残留トリプシンを除去するために新鮮な完全M199メディアにメディアを変更してください。組織培養皿（ 図1B）にPASMCの薄い人口があります。

7。日常診療

1. 週に約2倍の新鮮な完全M199メディアにメディアを変更してください。
2. これらの細胞は、トリプシンの映画の中でインキュベーター内で約10分は（0.25〜0.5ミリリットル）プレートを持ち上げ、細胞分裂のために必要とされる場合。トリプシンのフィルムを使用すると、細胞をスピンダウンせずにPASMCの再播種ができます。あまりに多くトリプシンを使用している場合は、その後PASMCはトリプシンをスピンアウトするように遠心分離しなければならない、または細胞がプレートにreadhereません。ときには、細胞をスピンダウンした後に、それは完全なM199培地中に再懸濁しPASMCを得ることは困難である。
3. 観察では、単離されたPASMCは4-5継代確実に平滑筋細胞のように動作しますが、単離された細胞は、上昇通路7に平滑筋細胞マーカーのために染色されます。通路2（トリプシンへの最初の曝露後メッキ）などの日13の最初のプールされた60ミリメートル、10センチプレートをカウントします。

結果

分離中および後の、PASMCを光学顕微鏡によりおよび平滑筋細胞マーカーの免疫染色の両方によって調べられます。初期のプロトコルにおける光学顕微鏡により、PASMCは血管を（ 図1A）を含む小鉄からの組織培養皿上に移行が見られる。それらは、最終プーリング段階で引き出されているように日に13上の3つを通じてプレートを1つをプールした後、その後、鉄粒子はもはや見られな...

ディスカッション

本稿では、我々は初めてP7、P14、およびP21でマウスからPASMCの単離のため説明しています。これを達成するために、アガロースおよび0.2μMの鉄粒子のスラリーをPAにRVを介して注入される。鉄粒子のサイズが小さいので、彼らは、肺毛細血管床を通過することができず、従って、小さなPAに堆積される。肺は、膨張削除と解離している。鉄含有容器は、磁石を用いて溶液から引き出されている。...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bard Parker surgical blade handle	BD	371030
Stainless steel surgical blades #10 (sterile)	Miltex	4-310
Syringes (3 ml and 5 ml, sterile)	BD	309657 and 306646
Needles (27 G, sterile)	BD	305109
Angiocatheter (24 G, sterile)	BD	381412
Monoject blunt cannula (15 G)	Kendall	SWD202314Z
Sutures	Fisher Scientific	NC9782896
Dynal magnet particle collector	Invitrogen	120-01D	This is a critical tool for the protocol.
Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile)	BD	353001, 353004, and 353003	Any brand of tissue culture plates will be fine.
Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel)	American Diagnostic Corporation	3424
Forceps (4 inch stainless steel)	Quick Medical	L5-5004
D-PBS	Mediatech	21-031-CV
M199 media	Mediatech	10-060-CV
Penicillin/streptomycin	VWR	TX16777-164NWU
Fetal bovine serum	Hyclone/Thermo Scientific	SH3091003	Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor.
Iron particles (iron (II, III) oxide powder)	Aldrich Chemical Company	#31,006-9
Agarose	Sigma	A9539
Collagenase (made to 80 U/ml)	Sigma	C5138
Isoflurane	Butlet Schein	NDC 11695-6776-1
Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera	Nikon	TE2000-U	Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture.
Anti-desmin antibody	Sigma	D-8281	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Anti-smooth muscle myosin	Biomedical Technologies	BT-562	Use at 1:2,000 dilution for immunostaining.
Rhodamine-red anti-rabbit secondary	Molecular Probes/Invitrogen	R-6394	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera	Nikon	TE300	Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining.
Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit	Enzo Life Sciences	BML-AK800-0001	This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available.
Sildenafil	Sigma	PZ-0003	A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis.