البطانية أنبوب تشكيل خلية الفحص ل<em&gt; في المختبر</em&gt; دراسة الأوعية الدموية

Summary

مقايسة تشكيل أنبوب هو، طريقة للقياس لقياس سريع في المختبر الأوعية الدموية. يتم الجمع بين الخلايا البطانية مع وسائل الإعلام مشروطة ومطلي على استخراج الغشاء القاعدي. يحدث تشكيل أنبوب خلال ساعات والأنابيب التي شكلت حديثا كميا بسهولة.

Abstract

الأوعية الدموية هي عملية حيوية للتنمية الأنسجة الطبيعية والتئام الجروح، ولكن يرتبط أيضا مع مجموعة متنوعة من الحالات المرضية. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن قياس الأوعية الدموية في المختبر بطريقة سليمة وقابلة للقياس الكمي سريعة. يتم خلط الخلايا البطانية الأولية أو خلدت مع وسائل الإعلام مشروطة ومطلي على مصفوفة الغشاء القاعدي. وتشكل الخلايا البطانية الشعرية مثل الهياكل استجابة لإشارات عائية وجدت في وسائل الإعلام مشروطة. يحدث تشكيل أنبوب بسرعة مع الخلايا البطانية التي تبدأ لمواءمة أنفسهم في حدود 1 ساعة والأنابيب التي تحتوي على التجويف تبدأ في الظهور في غضون 2 ساعة. أنابيب يمكن تصور باستخدام المجهر المقلوب على النقيض المرحلة، أو الخلايا يمكن علاجها calcein AM مسبق للفحص والأنابيب من خلال تصور أو مضان المجهري متحد البؤر. عدد المواقع فرع / العقد، وأعمدة / تنسجم، أو عدد أو طول أنابيب شكلت يمكن قياسها كميا بسهولة كمقياس للفي vitrس الأوعية الدموية. وباختصار، يمكن استخدام هذا الاختبار لتحديد الجينات والمسالك التي تشارك في تعزيز أو تثبيط الأوعية الدموية بطريقة سريعة واستنساخه، والكمية.

Introduction

الأوعية الدموية، وتطوير أوعية دموية جديدة من السفن الموجودة مسبقا، أمر حيوي لمجموعة متنوعة من العمليات بما في ذلك نمو الجهاز، التطور الجنيني، والتئام الجروح ^1-3. وضعت حديثا الأوعية الدموية، واصطف بواسطة الخلايا البطانية، والأكسجين العرض والمواد المغذية إلى الأنسجة، وتعزيز المراقبة المناعة من الخلايا المكونة للدم وإزالة النفايات ^2،4. الأوعية الدموية هي ذات أهمية رئيسية أثناء التطور الجنيني والجنين. ومع ذلك، لا تزال هذه العملية نائمة في البالغين إلا في أوقات التئام الجروح ونمو الهيكل العظمي، والحمل أو أثناء الدورة الشهرية ^1-3.

على مدى العقدين الماضيين، بدأت الآليات الجزيئية الرئيسية التي تنظم الأوعية الدموية في الظهور. الأوعية الدموية هو حدث ينظم بإحكام، متوازنة من إشارات المؤيد والأوعية بما integrins، كيموكينات، angiopoietins، وكلاء الاستشعار الأوكسجين، جزيئات صلي ومثبطات الذاتية ^5. مرة واحدة proangإشارات iogenic مثل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF)، عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF)، الصفائح الدموية المستمدة عامل النمو (PDGF)، وعامل نمو البشرة (EGF) تنشيط الخلايا البطانية مستقبلات الخلايا البطانية تطلق البروتياز للحط من الغشاء القاعدي. الخلايا البطانية ثم تتكاثر وتهاجر، وتشكيل براعم بمعدل عدة مليمترات في اليوم الواحد ^6،7.

ويرتبط الأوعية الدموية مع مختلف الحالات المرضية بما فيها السرطان، والصدفية، واعتلال الشبكية السكري، والتهاب المفاصل، والربو، واضطرابات المناعة الذاتية والأمراض المعدية، وتصلب الشرايين ^8-10. نظرا لأهمية الأوعية الدموية في أمراض مختلفة، فهم الجينات والمسارات التي تنظم هذه العملية أمر بالغ الأهمية لتصميم علاجات أفضل.

مقايسة تشكيل أنبوب هو طريقة سريعة والكمي لتحديد الجينات أو مسارات المشاركة في الأوعية الدموية. وصف لأول مرة في عام 1988،المبادئ التي تقوم عليها هذا الاختبار هي أن الخلايا البطانية تحتفظ القدرة على الانقسام وتهاجر بسرعة استجابة لإشارات عائية ^11-13. علاوة على ذلك، وبفعل الخلايا البطانية للتمييز وتشكيل الهياكل أنبوب يشبه عندما مثقف على مصفوفة من استخراج الغشاء القاعدي (BME). هذه الأنابيب تحتوي على تجويف تحيط بها الخلايا البطانية ترتبط معا من خلال المجمعات صلي. يحدث تشكيل أنبوب بسرعة مع معظم أنابيب تشكيل في هذا الاختبار في غضون 2-6 ساعة تبعا لكمية ونوع المثيرات عائية.

عدة أنواع من الخلايا البطانية يمكن استخدامها لهذا الاختبار بما في ذلك الخلايا الأولية وخطوط الخلايا خلد ^14،15. كان خط الخلية المستخدمة لهذا المقال الماوس 3B-11، ولكن نفس منهجية يمكن تطبيقها مع خطوط أخرى مثل الخلايا البطانية SVEC4-10 (الماوس) أو الخلايا البطانية الأولية مثل HUVEC (الإنسان) الخلايا. تبعا الذي يستخدم خط الخلية وما إذا كانت البطانية متتحول LLS أو غير تحولت، سوف تحتاج الأمثل التي ستجرى لتحديد الوقت المثالي اللازمة لتشكيل أنبوب المناسب.

Protocol

1. مجموعة من وسائل الإعلام مكيفة لاختبار إمكانات عائية

1. تنمو الخلايا الأولية أو خلد لفحصها لاحتمال عائية أو مكافحة عائية في وسائل الإعلام مصل الأم أو منخفضة وجمع وسائل الإعلام مكيفة.
   1. بدلا من ذلك، استخدام وسائل الإعلام مشروطة فورا أو aliquoted وتخزينها في -80 درجة مئوية لعدة أشهر. استخدام nonconditioned الأصلي أو انخفاض مصل سائل الإعلام كعنصر تحكم السلبية، واستخدام وسائل الإعلام غير مكيفة كاملة النمو (10٪ FBS، أو التركيز المناسب) كعنصر تحكم إيجابية. بدلا من ذلك، لاختبار التحفيز والتشجيع المحتملة لتكوين الأوعية الدموية، ملحق الفحم جردت وسائل الإعلام التي تفتقر إلى عوامل النمو مع تركيزات معروفة من بروتينات معينة من الفائدة ومقارنة لوسائل الإعلام الحرة وحدها عامل النمو.

2. إعداد الخلايا البطانية قبل الفحص

1. يومين قبل الفحص، مرور 3B-11 الخلايا في جديدة T-75 قارورة. عدد مرور خلايا ومهم. هذا الاختبار يعمل بشكل أفضل عندما الخلايا بين الممرات الثانية والسادسة. سوف الفحص لا تعمل بشكل جيد إذا تم استخدام الخلايا البطانية قبل الثانية أو بعد مرور العاشر.
2. تنمو الخلايا لمدة 24 ساعة في DMEM تستكمل مع 10٪ FBS، 2 مم L-الجلوتامين، 1 ملي البيروفات الصوديوم، و 100 U / البنسلين مل، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين.
3. يوم واحد قبل الفحص، مصل تجويع خلايا 3B-11 على النحو التالي:
   1. وسائل الإعلام نضح من الخلايا 3B-11.
   2. إضافة خفضت وسائل الاعلام المصل DMEM تستكمل مع 0.2٪ FBS، 2 مم L-الجلوتامين، البيروفات 1MM الصوديوم، و 100 U / البنسلين مل، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين.
   3. تنمو الخلايا لمدة 24 ساعة إضافية.

3. إعداد الكواشف لفحص مسبق

ملاحظة: تركيزات BME تختلف اختلافا كبيرا تعتمد على الكثير. BME لا يعمل بشكل جيد إذا كان تركيز أقل من 10 ملغ / مل، لذلك يجب الاتصال بالشركة المصنعة BME قبل الشراء للتأكد مناقتناء الكثير تتركز بشكل كاف.

1. انخفاض تذويب عامل النمو BME في الثلاجة. BME يتصلب عندما الحارة، لذلك يجب أن تبقى البارد قبل استخدامها. BME يمكن تخزينها تحت التبريد لبضعة أسابيع، أو aliquoted وتجميد في -80 درجة مئوية.
2. ويفضل تقليل عامل نمو BME على BME التقليدي. وعدم وجود العوامل عائية في BME يسهل مراقبة تأثير العوامل التي من وسائل الإعلام مكيفة تحتوي على تشكيل الأنبوب.
3. وسائل الإعلام ذوبان الجليد لفحصها.

4. إعداد الخلايا البطانية مباشرة قبل الفحص

1. غسل 3B-11 الخلايا في DPBS.
   1. إذا كان المطلوب التصور مع مضان المجهري متحد البؤر أو قبل غسل 3B-11 الخلايا، إضافة calcein صباحا إلى الخلايا البطانية في وسائل الإعلام بتركيز نهائي من 2 ميكروغرام / مل. وضع calcein الخلايا المسمى في الظلام عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ قبل بدء الفحص. حل الأسهم calceinيتم تخفيف AM في DMSO وcalcein مرة واحدة في وسائل الإعلام تركيز النهائي من DMSO يجب أن لا تتجاوز 0.1٪. بعد 30-45 دقيقة يغسل calcein صباحا من الخلايا (الخطوة 4.1 أعلاه) ومواصلة التجربة يتبع.
2. يعرض للتريبسين الخلايا بإضافة 1 مل التربسين-EDTA إلى T-75 قارورة.
3. بعد trypsinization كاملة، تحييد التربسين عن طريق إعادة التعليق الخلايا إلى الحجم النهائي من 10ML في DMEM، و 10٪ FBS، 2 مم L-الجلوتامين، البيروفات 1MM الصوديوم، و 100 U / البنسلين مل، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين.
4. تصفية الخلايا من خلال 100 ميكرون خلية مصفاة لإزالة كتل.
5. عد الخلايا وResuspend الخلايا إلى تركيز النهائي من 7.5 × 10 ⁶ خلية / مل في DMEM، و 10٪ FBS، 2 مم L-الجلوتامين، 1 ملي البيروفات الصوديوم، و 100 U / البنسلين مل، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين.

5. أنبوب تشكيل الفحص

1. وضع 24 لوحة جيدا و 1 مل النصائح في الثلاجة أو على الجليد لمدة 20-30 دقيقة قبل تحميل لوحة بحيث BME لا بريمترسيخ aturely.
2. الماصة 250 ميكرولتر من تقليل عامل نمو BME في كل بئر من 24 لوحة جيدا. تجنب خلق فقاعات من خلال عدم الاكتئاب ماصة إلى المحطة الأخيرة في حين الاستغناء. الحرص على أن يبقى ما يكفي BME في مركز البئر عندما أشكال الغضروف المفصلي. إذا كانت مصفوفة رقيقة جدا، وسوف تشكل الخلايا فقط أحادي الطبقة.
3. احتضان 24 لوحة جيدا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ لمدة 30 دقيقة لترسيخ BME.
4. مرة واحدة وقد وضعت BME، مزيج حوالي 300 ميكرولتر من وسائل الإعلام مكيفة مع 10 ميكرولتر من معلق 3B-11 الخلايا (حوالي 75،000 الخلايا).
   1. ضبط مستوى الصوت وسائل الإعلام مكيفة وعدد الخلايا البطانية مطلي اعتمادا على نوع من الخلايا المستخدمة، واختبار التخفيفات المسلسل من وسائل الإعلام مكيفة لإثبات النشاط. إذا الخلايا مقارنة نمت في ظل ظروف مختلفة، وتطبيع حجم وسائل الإعلام مكيفة لعدد الخلايا التي استخدمت لشرط وسائل الإعلام.
5. أنابيب فيلل يبدأ بتشكيل خلال 2-4 ساعة. اعتمادا على تركيز عامل عائية في وسائل الإعلام مكيفة، قد تحدث تشكيل أنبوب الذروة بين 3 و 12 ساعة وتوقيت الفحص سوف تحتاج إلى أن يكون الأمثل. إذا كان يعمل مع الخلايا البطانية الأولية بدلا من خلايا خلدت، تشكيل أنبوب الأولي قد يتأخر لعدة ساعات.
   1. وغالبا ما تبدأ أنابيب في التدهور خلال 18 ساعة وخلايا البطانية سيخضع لموت الخلايا المبرمج.
6. في وقت الذروة تشكيل الأنبوب، وسائل الإعلام نضح بعناية من البئر لتجنب تعطيل شبكة أنبوب على BME.
   1. غسل كل بئر مع 1 مل DPBS، ثم نضح.
      1. لتصور فوري، إضافة 1 مل DPBS الطازجة إلى كل شبكة أنبوب جيدا والصورة باستخدام مجهر مقلوب تعلق على كاميرا رقمية، أو مضان / مجهر متحد البؤر إذا تم صبغ الخلايا مع calcein AM كما في 4.1.1.
      2. لإصلاح شبكة أنابيب لتصور لاحق، وإضافة 4٪ بارافورمالدهيد على كليستنشق جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
         1. إزالة امتصاص العرق، ويغسل مرتين مع DPBS، ثم يضاف من 1mL DPBS الطازجة إلى كل بئر.
         2. مجهريا صورة قبل التثبيت كما القليلة أنابيب قد كسر خلال هذا الإجراء.

6. الكمي لشبكة أنابيب

1. تحديد شبكة أنبوب في عدة طرق مختلفة اعتمادا على تفضيل المحقق، والعديد من برامج الكمبيوتر لديها القدرة على قياس المعلمات التالية: عدد الأنابيب. عدد الحلقات / تنسجم؛ عدد من المواقع فرع / العقد. طول الأنابيب.
2. استخدام برنامج كمبيوتر تمثيلي مثل صورة J مع المساعد الأوعية الدموية محلل ⁽¹⁶⁾ لتقدير حجم شبكات الأنبوب.

النتائج

تم المصنفة الماوس 3B-11 الخلايا البطانية على طدت عامل انخفاض النمو BME - في هذا الاختبار، تم استخدام المنتج Matrigel - ويتبع مع مرور الوقت. كما هو مبين في الشكل 1، والعوامل المولدة للأوعية التي يفرزها إما الماوس أو الكيراتينية الليفية قادرة على إحداث تشكيل أنبوب مع م?...

Discussion

تشارك الأوعية الدموية في كل من العمليات الفسيولوجية والمرضية. دراسة الآليات التي تشارك في تكوين الأوعية الدموية يتطلب استخدام المقايسات أن ألخص أهم الخطوات في الأوعية الدموية. والبطانية أنبوب تشكيل خلية الفحص ويقدم العديد من المزايا أكثر من فحوصات أخرى. فمن السهل أ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Costar 24-well tissue culture-treated plate	Corning	3524
BD Matrigel basement membrane matrix, growth factor reduced	BD Biosciences	354230
Gibco 0.05% trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
Gibco L-glutamine 200 mM (100x)	Life Technologies	25030-081
Gibco pen strep	Life Technologies	15140-122
Gibco DMEM (1x)	Life Technologies	11965-092
Gibco DPBS (1x)	Life Technologies	14190-144
Fetal Bovine Serum	Atlas Biologicals	F-0500-A
Calcein AM	Life Technologies	C3100MP
DMSO	ATCC	4-X