Эндотелия Формирование Анализ сотового трубка для<em&gt; In Vitro</em&gt; Изучение ангиогенеза

Резюме

Анализ формирования трубка быстро, количественно метод измерения ангиогенеза в пробирке. Эндотелиальные клетки в сочетании с кондиционированной среды и высевали на чашки с экстрактом базальной мембраны. Формирование Tube происходит в течение нескольких часов и вновь образованные трубочки легко количественно.

Аннотация

Ангиогенез является важным процессом для нормального развития тканей и заживления ран, но также связано с различными патологическими состояниями. Использование этого протокола, ангиогенез может быть измерена в пробирке в быстрой, количественно образом. Первичные или иммортализованных эндотелиальные клетки смешивают с кондиционированной среды и высевали на базальной мембраны матрицы. Эндотелиальные клетки образуют капиллярные структуры в ответ на ангиогенных сигналов, обнаруженных в кондиционированной среды. Формирование трубки быстро происходит с эндотелиальные клетки начинают присоединяются в 1 час и люмен содержащих трубочки начинают появляться в пределах 2 часов. Трубы могут быть визуализированы с помощью фазово-контрастного инвертированный микроскоп, или клетки могут быть обработаны кальцеина AM До анализа и труб визуализируется с помощью флуоресценции или конфокальной микроскопии. Ряд отраслевых сайтов / узлами, петли / сетки, или число или длина трубок, образованных можно легко количественно в качестве меры в ВИТРо ангиогенез. Таким образом, этот анализ может быть использован для идентификации генов и путей, которые участвуют в развитии или ингибирования ангиогенеза в быстром, воспроизводимым и количественном выражении.

Введение

Ангиогенеза, развитие новых кровеносных сосудов из существующих ранее сосудов, имеет жизненно важное значение для различных процессов, включая рост органов, эмбриональное развитие и ранозаживляющее ^1-3. Недавно разработанный кровеносные сосуды, выстлана эндотелиальные клетки, подача кислорода и питательных веществ к тканям, повышает иммунный контроль по гемопоэтических клеток и удаления отходов продуктов ^2,4. Ангиогенез имеет ключевое значение во время развития эмбриона и плода. Тем не менее, этот процесс остается в состоянии покоя у взрослых, кроме во время заживления ран, рост скелета, беременности или во время менструального цикла ^1-3.

За последние два десятилетия, ключевые молекулярные механизмы, которые регулируют ангиогенез начали появляться. Ангиогенеза является жестко регулируется событие, уравновешивается за и антиангиогенных сигналов, включая интегринов, хемокинов, ангиопоэтинам, агентов зондирования кислорода, соединительных молекул и эндогенных ингибиторов ^5. После proangiogenic сигналы, такие как основной фактор роста фибробластов (bFGF), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), и эпидермального фактора роста (EGF) активировать рецепторы эндотелиальных клеток эндотелиальные клетки высвобождают протеазы, чтобы ухудшить базальную мембрану. Эндотелиальные клетки затем пролиферируют и мигрируют, образуя побеги со скоростью несколько миллиметров в день ^6,7.

Ангиогенез связан с различными патологическими состояниями, включая рак, псориаз, диабетической ретинопатии, артрит, астма, аутоиммунные заболевания, инфекционные заболевания, атеросклероза и ^8-10. В связи с важностью ангиогенеза при различных заболеваниях, понимая гены и пути, которые регулируют этот процесс решающее значение для разработки более совершенных терапии.

Анализ формирования трубки является быстрым и количественный метод определения генов или путей, вовлеченных в ангиогенез. Впервые описан в 1988 году,принципы, лежащие в основе этого анализа, что эндотелиальные клетки сохраняют способность к делению и быстро мигрировать в ответ на ангиогенных сигналов ^11-13. Кроме того, эндотелиальные клетки индуцированы к дифференцировке и образуют трубки, как структуры, при культивировании на матрице экстракта базальной мембраны (BME). Эти трубки содержат просвет, окруженный эндотелиальных клеток, связанных между собой через соединительных комплексов. Формирование трубы быстро происходит с большинством трубок, образующих в этом анализе в течение 2-6 ч в зависимости от количества и типа ангиогенных стимулов.

Несколько типов эндотелиальных клеток могут быть использованы для этого анализа, включая как первичные клетки и иммортализованных клеточных линий ^14,15. Клеточная линия используется для этой статьи была мышь 3B-11, но та же самая методика может применяться с другими эндотелиальных клеточных линий, таких как SVEC4-10 (мыши) или первичных эндотелиальных клеток, таких как HUVEC клеток (человека). В зависимости от клеточной линии используется ли и эндотелиальной CEзаполняет преобразуются или нетрансформированных, оптимизации должны быть проведены, чтобы определить идеальное время, необходимое для правильного формирования трубки.

протокол

1 Коллекция кондиционированной среды для тестирования для Ангиогенная Потенциал

1. Вырастить первичные или иммортализованные ячейки, которые будут проверены на ангиогенной или антиангиогенного потенциала в родных или низких сывороточных СМИ и собирать кондиционированной среды.
   1. С другой стороны, использование сразу кондиционированной среды или на аликвоты и хранили при -80 ° С в течение нескольких месяцев. Использование безусловных нативного или с низким содержанием сыворотки носитель в качестве отрицательного контроля, и использовать некондиционных полной среде роста (10% FBS, или соответствующую концентрацию) в качестве положительного контроля. Кроме того, для проверки потенциальных стимуляторов ангиогенеза, добавка уголь раздели СМИ не хватает факторы роста с известными концентрациями специфических белков, представляющих интерес и по сравнению с только фактора роста свободных СМИ.

2 Получение эндотелиальных клеток до анализа

1. Через два дня до анализа проход 3B-11 клеток в новой Т-75 колбу. Прохождение количество клеток важно. Этот анализ работает лучше всего, когда клетки между вторым и шестым проходов. Данный тест не будет работать хорошо, если эндотелиальные клетки используются до того, как второй или после десятого прохода.
2. Рост клеток в течение 24 часов в среде DMEM с добавлением 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.
3. За день до анализа, сыворотка голодать 3B-11 клеток следующим образом:
   1. Аспирируйте СМИ от 3B-11 клеток.
   2. Добавить уменьшается в сыворотке носитель из DMEM, дополненной 0,2% FBS, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.
   3. Рост клеток в течение дополнительных 24 часов.

3 Подготовка реагентов до анализа

ПРИМЕЧАНИЕ: концентрации BME сильно варьируют в зависимости от партии. ВМЕ не работает хорошо, если концентрация составляет менее 10 мг / мл, поэтому изготовитель ВМЕ следует обращаться до покупки, чтобы обеспечитьприобретение адекватно сосредоточено много.

1. Размораживание снижается фактор роста BME в холодильнике. BME затвердевает при теплой, поэтому он должен быть холодным до использования. ВМЕ можно хранить в холодильнике в течение нескольких недель или на аликвоты и замораживали при -80 ° С.
2. Уменьшается фактор роста ВМЕ является предпочтительным по сравнению с традиционными BME. Отсутствие факторов ангиогенеза в BME облегчит наблюдать эффект, что факторы от условные СМИ имеют на формирование трубки.
3. Оттепель СМИ для тестирования.

4 Получение эндотелиальных клеток непосредственно перед Пробирной

1. Вымойте 3B-11 клеток в DPBS.
   1. Если визуализации флуоресценции или конфокальной микроскопии желательно, перед стиркой 3B-11 клетки, добавить кальцеина AM, чтобы эндотелиальных клеток в среде при конечной концентрации 2 мкг / мл. Поместите помеченный кальцеином клетки в темноте при 37 ° С и 5% СО ₂ перед началом анализа. Растворите фондовый кальцеинаМ. в ДМСО и один раз кальцеина разводят в медиа-конечная концентрация ДМСО не должна превышать 0,1%. После 30-45 мин стирки кальцеин AM из клеток (шаг 4,1 выше) и продолжить эксперимент следующим образом.
2. Trypsinize клеток путем добавления 1 мл трипсина-ЭДТА в Т-75 колбу.
3. После трипсинизации завершена, нейтрализации трипсина путем ресуспендирования клеток в конечном объеме 10 мл в DMEM, 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.
4. Фильтрующие ячейки через сито 100 мкм клеток, чтобы удалить сгустки.
5. Количество клеток и ресуспендирования клеток в конечной концентрации 7,5 × 10 ⁶ клеток / мл в DMEM, 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.

Формирование Анализ 5 Tube

1. Поместите 24-луночного планшета и 1 мл советы в холодильнике или на льду в течение 20-30 мин до загрузки пластину так, чтобы BME не Премaturely затвердеть.
2. Пипеткой 250 мкл восстановленного фактора роста BME в каждую лунку 24-луночного планшета. Избегайте образования пузырьков, не нажимая на пипетку, чтобы его конечной остановки в то время дозирования. Следите за тем, достаточно BME остается в центре хорошо, когда мениск форм; если матрица является слишком тонким, клетки будут только образуют монослой.
3. Выдержите 24-луночного планшета при 37 ° С и 5% CO ₂ в течение 30 мин, чтобы укрепить BME.
4. После BME установил, смешать примерно 300 мкл кондиционированной среды с 10 мкл ресуспендированных 3B-11 клеток (примерно 75 000 клеток).
   1. Регулировка громкости кондиционированных сред и количество посеянных клеток в зависимости от эндотелия типа клеток, и проверить серийные разведения кондиционированной среды, чтобы продемонстрировать активность. Если сравнение клетки, выращенные в разных условиях, нормализуют условный объем средств информации к числу клеток, которые были использованы для кондиционирования СМИ.
5. Трубы Вильл начинают формироваться в течение 2-4 часов. В зависимости от ангиогенной концентрации фактора в кондиционированной среде, формирование пика трубка может происходить между 3 и 12 ч и сроки проведения анализа необходимо будет оптимизирован. Если работа с первичных эндотелиальных клеток, а не иммортализованных клеток, образование начальное трубка может быть отложено на несколько часов.
   1. Трубы часто начинают ухудшаться в течение 18 ч и эндотелиальных клеток будет подвергаться апоптозу.
6. На момент формирования пика трубки, тщательно аспирата средств массовой информации из колодца, чтобы избежать нарушения работы сети труб на BME.
   1. Вымойте каждую лунку по 1 мл DPBS, то аспирации.
      1. Для немедленного визуализации, добавить 1 мл свежей DPBS в каждую лунку и изображения в сети труб с помощью инвертированного микроскопа, прикрепленный к цифровой камере, или флуоресценции / конфокальной микроскопии, если клетки окрашивали кальцеин AM как в 4.1.1.
      2. Чтобы исправить сеть труб для последующей визуализации, и добавить 4% параформальдегида другатмосферный и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
         1. Удалить параформальдегид, дважды промывали DPBS, затем добавить 1 мл свежих DPBS в каждую лунку.
         2. Микроскопически изображение до фиксации, как несколько трубок может сломаться во время этой процедуры.

6 Количественная оценка метро Сети

1. Количественная сеть трубки несколькими различными способами в зависимости от предпочтений исследователя, и несколько компьютерных программ имеют возможность измерить следующие параметры: количество трубок; Количество петель / сеток; ряд отраслевых сайтов / узлами; Длина труб.
2. Используйте представительный компьютерную программу, например, Image J с плагином ангиогенез анализатора ¹⁶ для количественного определения трубопроводных сетях.

Результаты

Мышь 3B-11 эндотелиальные клетки высевали на затвердевший фактора роста снижается BME - в данном анализе, продукт Матригель был использован - и последующим течением времени. Как показано на рисунке 1, ангиогенные факторы, секретируемые либо кератиноцитов мыши или фибробластов спо...

Обсуждение

Ангиогенез вовлечен в обоих физиологических и патологических процессов. Изучение механизмов, участвующих в ангиогенезе требуется использование анализов, которые воспроизводят основные этапы ангиогенеза. Эндотелия формирование анализ клеток трубка имеет ряд преимуществ перед друг?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Costar 24-well tissue culture-treated plate	Corning	3524
BD Matrigel basement membrane matrix, growth factor reduced	BD Biosciences	354230
Gibco 0.05% trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
Gibco L-glutamine 200 mM (100x)	Life Technologies	25030-081
Gibco pen strep	Life Technologies	15140-122
Gibco DMEM (1x)	Life Technologies	11965-092
Gibco DPBS (1x)	Life Technologies	14190-144
Fetal Bovine Serum	Atlas Biologicals	F-0500-A
Calcein AM	Life Technologies	C3100MP
DMSO	ATCC	4-X