에 대한 내피 세포의 관 형성의 분석<em&gt; 체외</em&gt; 혈관 신생 연구

요약

관 형성 분석법은 시험관 내 혈관 신생을 측정하기위한 신속하고 정량적 방법이다. 내피 세포는 조절 된 미디어와 결합 기저막 추출물에 도금된다. 튜브 형성은 시간 이내에 발생하고 새로 형성된 세관은 쉽게 정량화.

초록

혈관 신생은 정상 조직의 발달과 상처 치료를위한 중요한 과정이지만 또한 병적 다양한 조건과 연관된다. 이 프로토콜을 이용하여, 혈관 신생은 신속하게 정량 시험 관내에서 측정 할 수있다. 차 또는 불멸화 된 내피 세포는 조절 된 매체와 혼합 기저막 매트릭스 상에 플레이 팅된다. 내피 세포는 조절 된 배지에서 발견 된 혈관 형성 신호에 반응하여 추천 모세관 구조를 형성한다. 관 형성은 혈관 내피 세포는 1 시간 및 루멘 함유 세관은 2 시간 내에 표시하기 시작하고 내 자신을 정렬하기 시작 신속하게 발생합니다. 튜브를 위상차 도립 현미경을 이용하여 가시화 될 수 있거나, 또는 세포를 형광 공 촛점 현미경 분석을 통해 시각화 및 튜브에 대한 종래의 칼 세인 AM으로 처리 될 수있다. 분기 사이트 / 노드의 수는 루프 / 메쉬, 또는 번호 또는 형성된 튜브의 길이를 쉽게 vitr에서의 측정 값으로서 정량화 될 수있다오 혈관 신생. 요약하면,이 분석은 유전자와, 빠른 재생 가능한 한 정량적 방식으로 추진 또는 혈관 신생의 억제에 관여하는 경로를 식별하기 위해 사용될 수있다.

서문

혈관 신생, 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관의 발달은 ^{1-3 치유} 장기의 성장, 배아 발생 및 상처 등의 다양한 공정에 매우 중요하다. 새로 조직으로 내피 세포, 공급 산소와 영양분 줄 지어 혈관을 개발, 조혈 세포에 의한 면역 감시를 촉진하고 노폐물 ^2,4를 제거합니다. 혈관 신생은 배아와 태아의 개발 과정에서 핵심 중요하다. 그러나,이 과정은 상처 치유, 골격 성장, 임신의 시간 동안을 제외하고 또는 월경주기 ^{1 ~ 3시} 성인 휴면 남아있다.

지난 20 년 동안, 혈관 신생을 조절하는 핵심 분자 메커니즘이 등장하기 시작했다. 혈관 신생은 인테그린, 케모카인, 앤지 오포 이에 틴, 산소 감지 에이전트, 접합부 분자와 내인성 억제제 ^(5)을 포함하여 프로와 항 혈관 신생 신호로 균형 엄격하게 규제 된 이벤트입니다. proang 번이러한 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 및 표피 성장 인자 (EGF)와 같은 iogenic 신호는 내피 세포가 혈관 내피 세포가 기저막을 분해하는 프로테아제를 방출 수용체 활성화. 내피 세포는 하루 당 ^6.7 밀리미터의 속도로 콩나물을 형성, 증식 및 이주.

혈관 신생은 암, 건선, 당뇨병 성 망막 병증, 관절염, 천식,자가 면역 질환, 감염성 질환, 및 죽상 동맥 경화증을 포함한 다양한 ^8-10 병적 상태와 관련된다. 인해 다양한 질병에서 혈관 신생의 중요성이 프로세스는 더 나은 치료제의 설계에 중요한 조절 유전자 및 경로를 이해한다.

관 형성 어 세이는 혈관 신생에 관여하는 유전자 또는 경로를 결정하기위한 신속하고 정량적 인 방법이다. 우선 1988에서 설명한이 분석의 기초 원리는 내피 세포가 혈관 신생 나누고 ^11-13 신호에 응답하여 급속하게 이주 할 수있는 능력을 유지하는 것이있다. 또한, 내피 세포는 분화 및 기저막 추출물 (BME)의 매트릭스에서 배양 관 형상 구조를 형성하도록 유도된다. 이 튜브는 접합부 단지를 통해 서로 연결 내피 세포에 둘러싸인 내강이 포함되어 있습니다. 관 형성은 대부분의 튜브 수량 및 혈관 신생 자극의 유형에 따라 2-6 시간 동안이 형성 분석에서 신속하게 발생한다.

내피 세포는 여러 종류의 일차 전지 및 불멸화 세포주 ^14,15 모두 포함이 분석을 위해 사용될 수있다. 본 문서에 사용되는 세포주는 마우스 3B-11 이었지만, 동일한 방법론은 이러한 HUVEC (인간)와 같은 세포 SVEC4-10 (마우스)와 같은 다른 내피 세포주 또는 일차 내피 세포에 적용 할 수있다. 에 따라 세포주가 사용된다 내피 CE 여부LLS가 변형 또는 비 변형되어, 최적화는 적절한 관 형성에 필요한 이상적인 시간을 식별하기 위해 수행 될 필요가있을 것이다.

프로토콜

에어컨 미디어의 1 컬렉션은 혈관 신생 가능성을 테스트

1. 기본 또는 저 혈청 배지에서 혈관 신생 또는 항 혈관 가능성을 테스트 할 기본 또는 불후의 세포 성장 및 조절 미디어를 수집합니다.
   1. 또한, 사용 즉시 미디어를 조절하거나 분주하고 몇 달 동안 -80 ° C에 저장됩니다. 음성 대조군으로 nonconditioned 네이티브 또는 낮은 혈청 미디어를 사용하고, 양성 대조군으로 비 조절 완전한 성장 배지 (10 % FBS, 또는 적절한 농도)를 사용합니다. 또한, 혈관 신생의 잠재적 인 자극을 테스트하기 위해, 관심의 특정 단백질의 알려진 농도의 성장 인자가없는 보충 숯 제거 매체는 혼자 성장 인자 언론의 자유에 비교합니다.

분석에 앞서 내피 세포의 2 준비

1. 분석하기 이틀 전에, 새로운 T-75 플라스크에 통과 3B-11 세포. 세포의 통로 수는 중요하다. 세포는 두 번째와 여섯 번째 통로 사이 경우이 분석은 가장 적합한. 분석은 내피 세포는 초 전이나 열째 통과 한 후에 사용하는 경우에 잘 작동하지 않습니다.
2. DMEM에서 24 시간 동안 세포 성장은 10 % FBS, 2 mM의의 L-글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg / ml의 스트렙토 마이신이 보충.
3. 다음과 같이 하나 일 이전에 분석에, 혈청 3B-11 세포를 굶어 :
   1. 3B-11 세포에서 대기음 미디어.
   2. DMEM의 추가 감소 된 혈청 매체는 0.2 % FBS, 2 mM의 L-글루타민을, 1mM의 피루브산 나트륨, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg / ml의 스트렙토 마이신이 보충.
   3. 추가로 24 시간 동안 세포를 성장.

분석에 앞서 시약의 3 준비

참고 : BME 농도가 많은에 따라 매우 다양하다. 농도가 ㎖ / 따라서 BME 제조업체 보장하기 위해 제품을 구매하기 전에 문의해야 미만 10 mg의 경우 BME는 잘 작동하지 않습니다적절하게 집중을 많이 취득.

1. 해동은 냉장고에 성장 인자 BME를 감소시켰다. 때 따뜻한 BME는 굳은, 그래서 그것을 사용하기 전에 차가운 유지해야합니다. BME는 몇 주 동안 냉장, 저장, 분주 및 -80 ° C에서 동결 할 수 있습니다.
2. 감소 된 성장 인자 BME 전통 BME를 통해 바람직하다. BME에 혈관 신생 인자의 부족은 쉽게 조절 매체 관 형성에 미치는 인자들로부터 효과를 관찰 할 것이다.
3. 해동 미디어 테스트 할 수 있습니다.

분석 직전에 내피 세포의 4 준비

1. 워시 3B-11 DPBS 세포.
   1. 또는 형광 공 촛점 현미경으로 시각화가 요구되는 경우,도 3b-11 세포를 세척하기 전에, 2 μg / ML의 최종 농도로 매질에서 내피 세포의 칼 세인 AM을 추가한다. 분석을 시작하기 전에 37 ° C와 5 % CO _2의 어둠 속에서 칼 세인 표지 세포를 놓습니다. 스톡 칼 세인을 녹여칼 세인 DMSO에 한 번 오전 0.1 %를 초과하지 않아야 DMSO의 미디어 최종 농도로 희석한다. 세포에서 30 ~ 45 분 세척 칼 세인의 AM 후 (위의 4.1 단계) 및 실험은 다음 계속합니다.
2. T-75 플라스크에 1 ml의 트립신-EDTA를 첨가하여 세포를 Trypsinize.
3. 트립신 처리가 완료된 후, 100 μg이 / ㎖ 스트렙토 마이신을 최종 DMEM에서 10ML의 부피, 10 % FBS, 2 mM의의 L-글루타민, 1mM의 피루브산 나트륨, 100 U / ㎖의 페니실린으로 세포를 재현 탁하여 트립신을 중화하고.
4. 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터 세포 덩어리를 제거합니다.
5. 7.5 × ¹⁰⁶ DMEM에서 세포 / ㎖, 10 % FBS, 2 mM의의 L-글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨, 100 U / ㎖ 페니실린의 최종 농도로 세포에 resuspend 셀 카운트 및 100 μg / ml의 스트렙토 마이신.

5 관 형성의 분석

1. 이전 BME는 프렘하지 않도록 접시를로드에 20 ~ 30 분 동안 냉장고에 또는 얼음에 24 웰 플레이트와 1 ㎖의 팁을 놓고aturely 강화.
2. 피펫 24 웰 플레이트의 각 웰에 감소 된 성장 인자 BME 250 μL. 분배하는 동안 최종 정지 피펫을 우울하지 않음으로써 거품을 만들지 마십시오. 충분한 BME가 잘의 중심 메 니스 커스 형태로 유지주의; 매트릭스가 너무 얇 으면, 셀은 단지 단일 층을 형성 할 것이다.
3. CO BME을 강화하기 _위해이 30 분 37 ° C에서 24 웰 플레이트를 품어 5 %.
4. BME가 설정되면, 재현 탁 3B-11 세포 (약 75,000 세포)의 10 μL로 에어컨 미디어의 약 300 μl를 섞는다.
   1. 에어컨 미디어와 사용 내피 세포 유형에 따라 도금 셀의 수의 양을 조절하고, 활성을 보여주기 위해 조절 매체의 계열 희석을 테스트. 비교 세포가 서로 다른 조건 하에서 성장 된 경우, 매체를 컨디셔닝하는데 사용 된 세포의 수를 조절 매체 볼륨을 정상화.
5. 튜브 줘야리터는 2-4 시간 내에 형성하기 시작한다. 조절 된 배지에서 혈관 신생 인자의 농도에 따라 피크 관 형성은 시간 및 타이밍 분석의 3 내지 12을 최적화 할 필요가 발생할 수있다. 대신 불후의 세포의 기본 내피 세포로 작업하는 경우, 초기 관 형성은 몇 시간에 의해 지연 될 수 있습니다.
   1. 튜브는 종종 세포 사멸을 받게 될 것이다 18 시간 및 내피 세포 내에서 악화하기 시작합니다.
6. 피크 관 형성 당시부터 잘 신중 흡 매체 BME에 튜브 네트워크를 방해하지 않도록한다.
   1. 1 ML의 DPBS 후 흡인 잘 각을 씻으십시오.
      1. 직접적인 시각화를 들어, 세포는 4.1.1로의 칼 세인 AM으로 염색 한 경우, 디지털 카메라, 또는 형광 / 공 초점 현미경에 부착 된 도립 현미경을 사용하여 각 웰 화상 튜브 네트워크에 1 ml의 신선한보기 DPBS를 추가한다.
      2. 나중에 시각화를위한 관 네트워크를 해결하고, 각 4 % 파라 포름 알데히드를 추가하려면잘 흡입하고, 실온에서 15 분 동안 배양한다.
         1. , 파라 포름 알데히드를 제거 DPBS로 두 번 세척 후, 각 웰에 1 ㎖에게 신선한 DPBS를 추가합니다.
         2. 몇 튜브이 절차를 수행하는 동안 파손될 우려가 전에 고정에 현미경 이미지.

튜브 네트워크의 6 정량화

1. 조사자의 선호도에 따라 여러 가지 방법으로 튜브 네트워크를 정량화하고, 여러 컴퓨터 프로그램은 다음의 파라미터를 측정하는 능력을 가지고 튜브의 수; 루프 / 메쉬의 수; 분기 사이트 / 노드의 수; 튜브의 길이.
2. 이러한 튜브 네트워크의 정량 혈관 분석기 플러그인 ¹⁶ 이미지 J로 대표 컴퓨터 프로그램을 사용합니다.

결과

마우스 3B-11은 내피 세포 성장 감소 응고 인자 BME에 시딩 하였다 -이 분석에서, 생성물은 사용 된 마트 리겔 - 시간이 지남에 따라. 도 1에 도시 된 바와 같이, 하나의 마우스 케 라티노 사이트 또는 섬유 아세포에서 분비되는 혈관 신생 인자는 시간에 관 형성을 유도 할 수있다. 내피 세포 마이그레이션 및 도금의 1 ~ 2 시간 내 작은 나뭇 가지를 형성하기 시작한다. 최대 관 형성 이전에 ?...

토론

혈관 신생은 생리 학적 및 병리학 적 과정에 모두 참여하고있다. 혈관 신생에 관여하는 메커니즘을 공부하는 것은 혈관 신생의 주요 단계를 요점을 되풀이 분석의 사용이 필요합니다. 내피 세포의 관 형성 어 세이 다른 분석법에 비해 여러 장점을 제공한다. 그것은, 설치하기 쉽고 상대적으로 저렴하고, 시간 내에 세관을 생산하고 정량화 할 수있다. 또한, 24 또는 96 웰 플레이트에 완료 할 수있어,...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Costar 24-well tissue culture-treated plate	Corning	3524
BD Matrigel basement membrane matrix, growth factor reduced	BD Biosciences	354230
Gibco 0.05% trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
Gibco L-glutamine 200 mM (100x)	Life Technologies	25030-081
Gibco pen strep	Life Technologies	15140-122
Gibco DMEM (1x)	Life Technologies	11965-092
Gibco DPBS (1x)	Life Technologies	14190-144
Fetal Bovine Serum	Atlas Biologicals	F-0500-A
Calcein AM	Life Technologies	C3100MP
DMSO	ATCC	4-X