Des cellules endothéliales Tube Formation test pour la<em&gt; In Vitro</em&gt; Etude de l&#39;angiogenèse

Résumé

L'essai de formation de tubes est une méthode rapide pour la mesure quantifiable de l'angiogenèse in vitro. Les cellules endothéliales sont combinés avec des milieux conditionnés et étalées sur un extrait de la membrane basale. formation de métro se produit dans les heures et les tubules nouvellement formés facilement quantifiable.

Résumé

L'angiogenèse est un processus essentiel pour le développement normal des tissus et la cicatrisation, mais est également associée à une variété de conditions pathologiques. En utilisant ce protocole, l'angiogenèse peut être mesurée in vitro d'une façon quantifiable rapide. Cellules endothéliales primaires ou immortalisées sont mélangés avec des milieux conditionnés et étalées sur la matrice de la membrane basale. Les cellules endotheliales capillaires forment des structures similaires en réponse à des signaux angiogéniques présents dans des milieux conditionnés. La formation du tube se produit rapidement avec les cellules endothéliales commencent à s'aligner dans 1 heure et tubules contenant lumen-commencent à apparaître dans les 2 heures. Les tubes peuvent être visualisées en utilisant un microscope à contraste de phase inversée, ou les cellules peuvent être traitées avec de la calcéine AM avant l'essai et des tubes visualisé à travers la fluorescence ou microscopie confocale. Le nombre de sites de succursale / nœuds, boucles / mailles, ou le nombre et la durée des tubes formés peuvent être facilement quantifiés comme une mesure de dans vitro angiogenèse. En résumé, ce test peut être utilisé pour identifier les gènes et les voies qui sont impliqués dans la promotion ou l'inhibition de l'angiogenèse d'une manière rapide, reproductible et quantitative.

Introduction

L'angiogenèse, le développement de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants, est vital pour une variété de procédés, y compris la croissance des organes, le développement embryonnaire et la cicatrisation ^1-3. Nouvellement développé des vaisseaux sanguins, bordées de cellules endothéliales, de l'oxygène de l'offre et de nutriments aux tissus, de promouvoir la surveillance immunitaire par des cellules hématopoïétiques et éliminer les déchets ^2,4. L'angiogenèse est d'une importance capitale au cours du développement embryonnaire et fœtal. Cependant, ce procédé reste en sommeil chez l'adulte, sauf pendant les périodes de cicatrisation des plaies, la croissance du squelette, la grossesse ou au cours du cycle menstruel ^1-3.

Au cours des deux dernières décennies, les mécanismes moléculaires clés qui régulent l'angiogenèse ont commencé à émerger. L'angiogenèse est un événement strictement réglementé, pondérées par les signaux pro et anti-angiogéniques dont les intégrines, chimiokines, angiopoïétines, des agents de détection de l'oxygène, des molécules de jonction et les inhibiteurs endogènes ^5. Une fois proangsignaux IOGenic tels que facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF), facteur de croissance vasculaire endothélial (VEGF), dérivé des plaquettes facteur de croissance (PDGF) et le facteur de croissance épidermique (EGF), activent des cellules endothéliales des récepteurs des cellules endotheliales libèrent des proteases à dégrader la membrane basale. Les cellules endothéliales prolifèrent et migrent ensuite, former les germes à une vitesse de quelques millimètres par jour ^6,7.

L'angiogenèse est associée à divers états pathologiques y compris le cancer, le psoriasis, la rétinopathie diabétique, l'arthrite, l'asthme, les maladies auto-immunes, les maladies infectieuses, l'athérosclérose et ^10.8. En raison de l'importance de l'angiogenèse dans diverses maladies, comprenant les gènes et les voies qui régulent ce processus est essentiel pour la conception de meilleurs traitements.

L'essai de formation de tubes est une méthode rapide et quantitative pour la détermination des gènes ou des voies impliquées dans l'angiogenèse. D'abord décrit en 1988,les principes sous-jacents de ce test sont des cellules endothéliales qui conservent la capacité de se diviser et de migrer rapidement en réponse à des signaux angiogéniques ^11-13. En outre, les cellules endothéliales sont induites à se différencier et à former des structures en forme de tube quand elle est cultivée sur un extrait de la matrice de la membrane basale (BME). Ces tubes contiennent une lumière entourée par les cellules endothéliales reliées entre elles par des complexes de jonction. Tube de formation se produit rapidement avec la plupart des tubes de formage dans cet essai à l'intérieur de 2 à 6 heures selon la quantité et le type de stimuli angiogéniques.

Plusieurs types de cellules endotheliales peuvent être utilisés pour ce dosage comprenant à la fois des cellules primaires et des lignées cellulaires immortalisées ^14,15. La lignée cellulaire utilisée pour cet article était souris 3B-11, mais la même méthode peut être appliquée à d'autres lignées de cellules endothéliales, tels que SVEC4-10 (souris) ou des cellules endotheliales primaires, telles que des cellules HUVEC (humaines). En fonction de la lignée cellulaire est utilisée et si le CE endothélialells sont transformés ou non transformés, l'optimisation devra être menée afin d'identifier le moment idéal nécessaire à la formation correcte de la sonde.

Protocole

1 Collection de milieux conditionnés pour tester angiogénique potentiel

1. Cultiver les cellules primaires ou immortalisées à être testé pour le potentiel angiogénique ou anti-angiogénique dans les médias sériques natives ou faibles et de recueillir le milieu conditionné.
   1. En variante, l'utilisation immédiatement milieu conditionné, ou de portions aliquotes et stocké à -80 ° C pendant plusieurs mois. Utiliser les médias de sérum natif ou faible nonconditioned comme contrôle négatif, et utiliser les médias non-conditionné complète la croissance (10% de FBS, ou concentration appropriée) comme contrôle positif. Sinon, pour tester stimulateurs potentiels de l'angiogenèse, le charbon de supplément médias dépouillé manque de facteurs de croissance avec des concentrations connues de protéines spécifiques d'intérêt et de comparer à facteur de croissance seuls médias libres.

2 Préparation des cellules endothéliales avant l'essai

1. Deux jours avant l'essai, le passage 3B-11 des cellules dans un nouveau flacon T-75. nombre de passage de cellules est important. Cet essai est plus efficace lorsque les cellules se trouvent entre les deuxième et sixième passages. Le test ne fonctionne pas bien si les cellules endothéliales sont utilisés avant la deuxième ou après le dixième passage.
2. Cultiver les cellules pendant 24 heures dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 2 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine.
3. Un jour avant l'essai, le sérum de faim 3B-11 des cellules comme suit:
   1. Aspirer le milieu des cellules 3B-11.
   2. Ajouter un média de sérum réduit de DMEM supplémenté avec 0,2% de FBS, 2 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine.
   3. Cultiver les cellules pour un 24 heures supplémentaires.

3 Préparation des réactifs avant l'essai

REMARQUE: Les concentrations sont très variables BME dépend beaucoup. BME ne fonctionne pas bien si la concentration est inférieure à 10 mg / ml, par conséquent, le fabricant BME doit être mis en contact avant l'achat pour s'assureracquisition d'un lot concentré de manière adéquate.

1. Dégivrage réduit le facteur de croissance BME dans le réfrigérateur. BME se solidifie à chaud, donc il doit être conservé au froid avant de l'utiliser. BME peut être stocké au réfrigérateur pendant quelques semaines, ou aliquote et congelé à -80 ° C.
2. Un facteur de croissance réduit BME est préféré au BME traditionnel. L'absence de facteurs angiogéniques dans le BME, il sera plus facile d'observer l'effet que les facteurs des milieux conditionnés ont sur la formation du tube.
3. Médias dégel à tester.

4 Préparation des cellules endothéliales Immédiatement avant l'essai

1. Laver 3B-11 cellules dans du DPBS.
   1. Si la visualisation de la fluorescence ou microscopie confocale est désirée, avant de laver les cellules 11-3B, la calcéine AM ajouter aux cellules endothéliales dans un milieu à une concentration finale de 2 ug / ml. Placer les cellules marquées calcéine dans l'obscurité à 37 ° C et 5% de CO ₂ avant le début de l'essai. Dissoudre actions calcéineAM dans du DMSO et une fois la calcéine est diluée dans des milieux concentration finale de DMSO ne doit pas dépasser 0,1%. Après 30-45 min lavage calcéine AM à partir des cellules (étape 4.1 ci-dessus) et poursuivre l'expérience suivante.
2. Trypsiniser les cellules en ajoutant 1 ml de trypsine-EDTA pour flacon T-75.
3. Après traitement à la trypsine est terminée, neutraliser la trypsine en remettant en suspension les cellules dans un volume final de 10 ml dans du DMEM, 10% de FBS, 2 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine.
4. cellules de filtre à travers 100 um cellule passoire pour éliminer les grumeaux.
5. Compter les cellules et remettre les cellules à une concentration finale de 7,5 x 10 ⁶ cellules / ml dans du DMEM, 10% de FBS, 2 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine.

5 Tube Formation Assay

1. Placez plaque à 24 puits et 1 ml conseils au réfrigérateur ou sur de la glace pendant 20-30 minutes avant de charger la plaque afin que le BME ne Prem pasaturely solidifier.
2. Pipeter 250 ul de facteur de croissance réduit BME dans chaque puits d'une plaque à 24 puits. Éviter de créer des bulles par pas appuyer sur la pipette pour son dernier arrêt lors de la distribution. Veillez à ce que suffisamment de BME reste au centre du puits lorsque les formes de ménisque; si la matrice est trop mince, les cellules ne forment une monocouche.
3. Incuber la plaque à 24 puits à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 30 minutes pour solidifier BME.
4. Une fois BME a mis, mélanger environ 300 pi de milieu conditionné avec 10 pi de remises en suspension 3B-11 cellules (environ 75 000 cellules).
   1. Ajuster le volume de milieu conditionné et le nombre de cellules ensemencées en fonction du type de cellule endothéliale utilisé, et tester les dilutions en série du milieu conditionné pour démontrer l'activité. Si on compare les cellules cultivées dans des conditions différentes, normaliser conditionné volume de support pour le nombre de cellules qui ont été utilisées pour conditionner le support.
5. Tubes will commencent à se former dans les 2-4 heures. En fonction de la concentration en facteur angiogénique dans le milieu conditionné, la formation de tubes de crête peut se produire entre 3 et 12 heures et le temps de l'essai devra être optimisé. Si vous travaillez avec des cellules endothéliales primaires au lieu de cellules immortalisées, la formation du tube initial peut être retardée de plusieurs heures.
   1. Tubes commencent souvent à se détériorer dans les 18 cellules endothéliales h et fera l'objet d'apoptose.
6. Au moment de la formation du tube de pointe, les médias soigneusement aspirer du puits pour éviter de perturber le réseau de métro sur le BME.
   1. Laver chaque puits avec 1 ml DPBS, puis aspirer.
      1. Pour une visualisation immédiate, ajouter 1 ml de DPBS frais à chaque réseau de tubes et ainsi l'image en utilisant un microscope inversé fixé à un appareil photo numérique, ou fluorescence / microscope confocal si les cellules ont été colorées avec la calcéine AM comme au point 4.1.1.
      2. Pour fixer le réseau de métro pour la visualisation plus tard, et ajouter 4% de paraformaldéhyde à chaqueainsi aspiré et incuber pendant 15 min à température ambiante.
         1. Retirer paraformaldéhyde, laver deux fois avec DPBS, puis ajouter 1 ml DPBS frais à chaque puits.
         2. Microscope l'image avant la fixation de quelques tubes peuvent se briser au cours de cette procédure.

6 Quantification de réseau de métro

1. Quantifier le réseau de tubes de différentes manières en fonction des préférences de l'enquêteur, et plusieurs programmes informatiques ont la capacité de mesurer les paramètres suivants: nombre de tubes; nombre de boucles / mailles; nombre de sites de succursale / nœuds; longueur de tubes.
2. Utilisez programme informatique représentant tels que Image J avec le plugin Analyzer angiogenèse ¹⁶ pour la quantification des réseaux de tubes.

Résultats

3B-11 de souris les cellules endothéliales sont ensemencées sur solidifié facteur de croissance réduit BME - dans cet essai, le produit de Matrigel a été utilisé - et suivie au cours du temps. Comme le montre la Figure 1, des facteurs angiogéniques sécrétés par soit des kératinocytes ou des fibroblastes de souris sont capables d'induire la formation de tubes dans le temps. Les cellules endothéliales migrent et commencent à former de petites branches dans 1-2 heures de placage. La forma...

Discussion

L'angiogenèse est impliquée dans les processus physiologiques et pathologiques. Les mécanismes impliqués dans l'angiogenèse étude nécessite l'utilisation de dosages qui récapitulent les principales étapes de l'angiogenèse. L'essai de formation de tubes de cellules endotheliales offre plusieurs avantages par rapport à d'autres essais. Il est facile à mettre en place, est relativement peu coûteux, produit tubules en quelques heures, et est quantifiable. En outre, il peut être complét...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Costar 24-well tissue culture-treated plate	Corning	3524
BD Matrigel basement membrane matrix, growth factor reduced	BD Biosciences	354230
Gibco 0.05% trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
Gibco L-glutamine 200 mM (100x)	Life Technologies	25030-081
Gibco pen strep	Life Technologies	15140-122
Gibco DMEM (1x)	Life Technologies	11965-092
Gibco DPBS (1x)	Life Technologies	14190-144
Fetal Bovine Serum	Atlas Biologicals	F-0500-A
Calcein AM	Life Technologies	C3100MP
DMSO	ATCC	4-X