Endoteliali Tubo cellulare saggio Formazione per la<em&gt; In Vitro</em&gt; Studio di Angiogenesi

Riepilogo

Il saggio di formazione del tubo è un metodo veloce e quantificabili per misurare l'angiogenesi in vitro. Le cellule endoteliali sono combinati con i media condizionati e piastrate su estratto di membrana basale. Formazione del tubo avviene entro ore e tubuli appena formati facilmente quantificabile.

Abstract

L'angiogenesi è un processo fondamentale per lo sviluppo del tessuto normale e la guarigione della ferita, ma è anche associato con una varietà di condizioni patologiche. Usando questo protocollo, l'angiogenesi può essere misurata in vitro in un veloce, modo quantificabile. Cellule endoteliali primarie o immortalati sono mescolati con i media condizionati e placcato su matrice membrana basale. Le cellule endoteliali formano strutture simili a capillari in risposta ai segnali angiogenici trovati in mezzi condizionati. La formazione del tubo avviene rapidamente con le cellule endoteliali cominciando ad allinearsi entro 1 ora e tubuli-lume contenente cominciando ad apparire in 2 ore. I tubi possono essere visualizzati con un contrasto di fase invertito microscopio, o le cellule possono essere trattate con calceina AM prima del test e tubi visualizzati tramite fluorescenza o confocale. Il numero di siti di filiale / nodi, loop / mesh, o il numero o la lunghezza dei tubi formati può essere facilmente quantificato in una misura di in vitro angiogenesi. In sintesi, questo test può essere utilizzato per identificare i geni e vie che sono coinvolti nella promozione o inibizione dell'angiogenesi in modo rapido, riproducibile, e quantitativa.

Introduzione

L'angiogenesi, lo sviluppo di nuovi vasi sanguigni da vasi preesistenti, è di vitale importanza per una varietà di processi tra cui la crescita di organi, lo sviluppo embrionale, e la guarigione delle ferite ^1-3. Recentemente ha sviluppato i vasi sanguigni, rivestiti da cellule endoteliali, l'apporto di ossigeno e sostanze nutritive ai tessuti, promuovere la sorveglianza immunitaria da parte delle cellule ematopoietiche e rimuovere i prodotti di scarto ^2,4. L'angiogenesi è di fondamentale importanza durante lo sviluppo embrionale e fetale. Tuttavia, questo processo rimane latente negli adulti eccetto durante i periodi di guarigione delle ferite, la crescita scheletrica, la gravidanza o durante il ciclo mestruale ^1-3.

Negli ultimi due decenni, i meccanismi molecolari fondamentali che regolano l'angiogenesi hanno cominciato ad emergere. L'angiogenesi è un evento strettamente regolamentato, equilibrato per segnali pro e anti-angiogenici, tra cui integrine, chemochine, angiopoietine, agenti di rilevamento ossigeno, molecole giunzionali e inibitori endogeni ^5. Una volta proangsegnali iogenic come la base il fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF), fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF), fattore di crescita derivato piastrine (PDGF), e il fattore di crescita epidermico (EGF) attivano cellule endoteliali dei recettori delle cellule endoteliali rilasciano proteasi a degradare la membrana basale. Le cellule endoteliali poi proliferano e migrano, formando germogli a una velocità di alcuni millimetri al giorno ^6,7.

L'angiogenesi è associata a varie condizioni patologiche, tra cui il cancro, la psoriasi, la retinopatia diabetica, artrite, asma, malattie autoimmuni, malattie infettive, e l'aterosclerosi ^8-10. Data l'importanza dell'angiogenesi in varie malattie, la comprensione dei geni e vie che regolano questo processo è fondamentale per la progettazione di terapie migliori.

Il saggio di formazione del tubo è un metodo rapido e quantitativo per la determinazione geni o meccanismi coinvolti nell'angiogenesi. In primo luogo descritto nel 1988,i principi alla base di questa analisi sono che le cellule endoteliali mantengono la capacità di dividersi e migrare rapidamente in risposta ai segnali angiogenici ^11-13. Inoltre, le cellule endoteliali vengono indotte a differenziarsi e formare strutture tubo-come quando coltivate su una matrice di estratto di membrana basale (BME). Questi tubi contengono un lume circondato da cellule endoteliali collegate tra loro attraverso complessi giunzionali. Formazione del tubo avviene rapidamente con la maggior parte dei tubi che formano in questo test entro 2-6 ore a seconda della quantità e del tipo di stimoli angiogenici.

Diversi tipi di cellule endoteliali possono essere usati per questo dosaggio compreso sia cellule primarie e linee cellulari immortalizzate ^14,15. La linea cellulare utilizzata per questo articolo è stata del mouse 3B-11, ma la stessa metodologia può essere applicata con le altre linee di cellule endoteliali, come SVEC4-10 (topo) o cellule endoteliali primarie come le cellule umane (HUVEC). A seconda di quale linea cellulare è usato e se ce endotelialeLLS sono trasformati o non trasformati, l'ottimizzazione dovrà essere effettuata per identificare il momento ideale necessaria per la corretta formazione del tubo.

Protocollo

1 Raccolta di mezzi condizionati per testare Angiogenic Potenziale

1. Crescere cellule primarie o immortalizzate da testare per il potenziale angiogenico o anti-angiogenica nei media siero nativi o basse e raccogliere i media condizionata.
   1. In alternativa, l'uso condizionato mezzi immediatamente, o aliquotato e conservato a -80 ° C per diversi mesi. Utilizzare nonconditioned supporti siero nativo o partire da un controllo negativo, e usare i media non condizionata completa crescita (10% FBS, o la concentrazione del caso) come controllo positivo. In alternativa, per testare potenziali stimolatori dell'angiogenesi, somministrare carbone mezzi spogliato mancano fattori di crescita con concentrazioni note di specifiche proteine ​​di interesse e di confrontare i fattori di crescita media liberi da soli.

2 Preparazione di cellule endoteliali prima del dosaggio

1. Due giorni prima del dosaggio, il passaggio 3B-11 celle in un nuovo fiasco T-75. Passaggio numero di cellule è importante. Questo test funziona meglio quando le cellule sono tra il secondo e il sesto passaggi. Il test non funziona bene se si usano cellule endoteliali prima del secondo o dopo il decimo passaggio.
2. Crescere le cellule per 24 ore in DMEM supplementato con 10% FBS, 2 mM L-glutammina, 1 mM di piruvato di sodio, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina.
3. Un giorno prima del test, il siero di fame 3B-11 celle come segue:
   1. Aspirare il terreno dalle cellule 3B-11.
   2. Aggiungi mezzi siero ridotto di DMEM integrato con 0,2% FBS, 2 mM L-glutammina, piruvato di sodio 1mM, 100 U / ml di penicillina, e 100 mg / ml di streptomicina.
   3. Crescere le cellule per altre 24 ore.

3 Preparazione dei reagenti Prima di Assay

NOTA: le concentrazioni di BME sono altamente variabile dipendente su lotto. BME non funziona bene se la concentrazione è inferiore a 10 mg / ml, pertanto il costruttore BME deve essere contattato prima dell'acquisto per garantireacquisizione di un lotto adeguatamente concentrato.

1. Sbrinamento ridotto fattore di crescita BME in frigorifero. BME solidifica quando caldo, quindi deve essere mantenuto freddo prima dell'uso. BME può essere conservato in frigorifero per un paio di settimane, o aliquotato e congelato a -80 ° C.
2. Un fattore di crescita ridotta BME è preferibile rispetto tradizionale BME. La mancanza di fattori angiogenici nel BME sarà più facile osservare l'effetto che i fattori dai media condizionati hanno sulla formazione del tubo.
3. Scongelare supporti da testare.

4 Preparazione di cellule endoteliali immediatamente prima del saggio

1. Lavare 3B-11 cellule in DPBS.
   1. Se la visualizzazione con fluorescenza o confocale microscopia è desiderato, prima di lavare 3B-11 celle, aggiungere calceina AM alle cellule endoteliali nei media ad una concentrazione finale di 2 mg / ml. Inserire cellule marcate calceina al buio a 37 ° C e 5% di CO ₂ prima dell'inizio del test. Sciogliere magazzino calceinaAM in DMSO e una volta calceina è diluito nei media concentrazione finale di DMSO non deve superare lo 0,1%. Dopo 30-45 min lavaggio calceina AM dalle cellule (punto 4.1) e continuare con l'esperimento segue.
2. Trypsinize cellule con l'aggiunta di 1 ml di tripsina-EDTA per T-75 pallone.
3. Dopo tripsinizzazione è completa, neutralizzare tripsina da risospendere le cellule in un volume finale di 10 ml di DMEM, 10% FBS, 2 mM L-glutammina, piruvato di sodio 1 mM, 100 U / ml di penicillina, e 100 mg / ml di streptomicina.
4. Celle filtranti attraverso 100 micron filtro cella per rimuovere grumi.
5. Contare le cellule e risospendere le cellule ad una concentrazione finale di 7,5 x 10 ⁶ cellule / ml di DMEM, 10% FBS, 2 mM L-glutammina, 1 mM di piruvato di sodio, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina.

5 Tubo saggio Formazione

1. Mettere 24 pozzetti e 1 ml punte in frigorifero o su ghiaccio per 20-30 minuti prima di caricare la piastra in modo che la BME non PREMaturely solidificarsi.
2. Dispensare 250 ml di fattore di crescita ridotto BME in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Evitare di creare bolle non premendo la pipetta e arrivare al capolinea, mentre l'erogazione. Fare attenzione che sufficiente BME rimane al centro del pozzo quando le forme menisco; se la matrice è troppo sottile, le cellule si formano solo un monostrato.
3. Incubare la piastra a 24 pozzetti a 37 ° C e 5% di CO ₂ per 30 min a solidificare BME.
4. Una volta BME ha fissato, mescolare circa 300 ml di mezzi condizionati con 10 ml di risospese 3B-11 cellule (circa 75.000 celle).
   1. Regolare il volume dei media condizionati e il numero di cellule piastrate a seconda del tipo di cellule endoteliali utilizzato, e testare le diluizioni seriali dei media condizionati per dimostrare l'attività. Se le cellule confrontando coltivate in condizioni diverse, normalizzare il volume mezzi condizionati al numero di celle che sono stati utilizzati per condizionare i media.
5. Tubi will cominciano a formarsi entro 2-4 ore. A seconda della concentrazione di fattore angiogenico nei media condizionata, formazione del tubo picco potrebbe verificarsi tra 3 e 12 ore e la tempistica del test dovrà essere ottimizzato. Se si lavora con le cellule endoteliali primarie invece di cellule immortalizzate, formazione del tubo iniziale può essere ritardato di diverse ore.
   1. Tubi spesso iniziano a deteriorarsi entro 18 hr e cellule endoteliali saranno sottoposti apoptosi.
6. Al momento della formazione del tubo di picco, i media accuratamente aspirato dal pozzo per evitare di interrompere la rete tubo sul BME.
   1. Lavare ogni pozzetto con 1 ml DPBS, quindi aspirarla.
      1. Per la visualizzazione immediata, aggiungere 1 ml DPBS freschi a ciascuna rete bene e l'immagine del tubo utilizzando un microscopio invertito collegato a una macchina fotografica digitale, o fluorescenza / microscopio confocale se le cellule sono state colorate con calceina AM come in 4.1.1.
      2. Per fissare il tubo di rete per la visualizzazione successiva, e aggiungere 4% paraformaldeide per ogniaspirato pozzetto ed incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
         1. Rimuovere paraformaldeide, lavare due volte con DPBS, quindi aggiungere 1 ml DPBS fresche per ogni bene.
         2. Microscopicamente immagine prima della fissazione come alcuni tubi possono rompersi durante questa procedura.

6 Quantificazione del tubo Network

1. Quantificare la rete metropolitana in diversi modi a seconda delle preferenze del ricercatore, e diversi programmi di computer hanno capacità di misurare i seguenti parametri: numero di tubi; numero di cicli / maglie; numero di siti di filiale / nodi; lunghezza dei tubi.
2. Utilizzare il programma di computer rappresentativa come J Immagine con il plugin Angiogenesi Analyzer ¹⁶ per la quantificazione delle reti di tubi.

Risultati

Mouse 3B-11 cellule endoteliali sono state seminate su solidificato fattore di crescita ridotta BME - in questo saggio, il prodotto Matrigel è stato utilizzato - e seguito nel tempo. Come mostrato in Figura 1, fattori angiogenici secreti da entrambi cheratinociti o fibroblasti di topo sono capaci di indurre la formazione del tubo nel tempo. Le cellule endoteliali migrano e cominciano a formare piccoli rami in 1-2 ore di placcatura. Formazione massima è stato raggiunto 4-6 ore utilizzando mezzi condizi...

Discussione

L'angiogenesi è coinvolta nei processi sia fisiologici e patologici. Studiare i meccanismi coinvolti nell'angiogenesi richiede l'uso di saggi che ricapitolano le principali fasi di angiogenesi. Il tubo cellule saggio di formazione endoteliali offre diversi vantaggi rispetto ad altri saggi. E 'facile set-up, è relativamente poco costoso, produce tubuli in poche ore, ed è quantificabile. Inoltre, esso può essere completato in 24 o 96 pozzetti piastre, e quindi può essere utilizzato per lo screening ad...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Costar 24-well tissue culture-treated plate	Corning	3524
BD Matrigel basement membrane matrix, growth factor reduced	BD Biosciences	354230
Gibco 0.05% trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
Gibco L-glutamine 200 mM (100x)	Life Technologies	25030-081
Gibco pen strep	Life Technologies	15140-122
Gibco DMEM (1x)	Life Technologies	11965-092
Gibco DPBS (1x)	Life Technologies	14190-144
Fetal Bovine Serum	Atlas Biologicals	F-0500-A
Calcein AM	Life Technologies	C3100MP
DMSO	ATCC	4-X