Assay היווצרות צינור תא האנדותל ל<em&gt; במבחנה</em&gt; חקר אנגיוגנזה

Summary

Assay היווצרות הצינור הוא שיטה מהירה, לכימות למדידת אנגיוגנזה במבחנה. תאי האנדותל הם בשילוב עם אמצעי תקשורת מותנה ומצופים על תמצית קרום במרתף. היווצרות צינור מתרחשת בתוך שעות וצינוריות שהוקמו זה עתה לכמת בקלות.

Abstract

אנגיוגנזה היא תהליך חיוני להתפתחות רקמות נורמלית וריפוי פצעים, אלא גם קשורה עם מגוון רחב של מצבים פתולוגיים. שימוש בפרוטוקול זה, אנגיוגנזה ניתן למדוד במבחנה באופן מהיר, לכימות. תאי האנדותל ראשוניים או הונצחו מעורבבים עם תקשורת מותנית ומצופים על מטריצת קרום במרתף. תאי האנדותל יוצרים נימים כמו מבנים בתגובה לאנגיוגנזה אותות מצאו בתקשורת מותנית. היווצרות הצינור מתרחשת במהירות עם תאי האנדותל מתחילים ליישר את עצמם בתוך שעה 1 וצינוריות המכיל לומן מתחילים להופיע בתוך 2 שעות. יכולים להיות דמיינו צינורות באמצעות מיקרוסקופ ניגוד הפוך שלב, או ניתן לטפל בתאים עם AM calcein לפני assay והצינורות דמיינו באמצעות הקרינה או confocal. מספר אתרי סניף / צמתים, לולאות / רשתות, או מספר או אורך של צינורות שנוצרו ניתן לכמת בקלות כמדד בvitrאנגיוגנזה o. לסיכום, assay זה יכול לשמש כדי לזהות גנים ומסלולים המעורבים בקידום או העיכוב של אנגיוגנזה בצורה מהירה, לשחזור, וכמותי.

Introduction

אנגיוגנזה, הפיתוח של כלי דם חדשים מכלי preexisting, הוא חיונית עבור מגוון רחב של תהליכים לרבות גידול איברים, התפתחות עוברית, וריפוי פצע ^1-3. חדש שפותח כלי דם, בשורה של תאי האנדותל, חמצן אספקה ​​וחומרים מזינים לרקמות, לקדם מעקב חיסוני על ידי תאי hematopoietic ולהסיר חומרי פסולת ^2,4. אנגיוגנזה היא בעל חשיבות מרכזית בהתפתחות עוברית ועוברית. עם זאת, תהליך זה נשאר רדום במבוגרים, למעט בתקופות של ריפוי פצעים, צמיחת שלד, הריון או במהלך המחזור החודשי ^1-3.

במהלך שני העשורים האחרונים, מנגנונים מולקולריים מרכזיים המסדירים אנגיוגנזה החלו לצוץ. אנגיוגנזה היא אירוע בחוזקה מוסדר, מאוזנת אותות פרו וantiangiogenic כוללים integrins, כמוקינים, angiopoietins, סוכני חישת חמצן, מולקולות junctional ומעכבי אנדוגני ^5. ברגע שproangאותות iogenic כגון גורם בסיסי גידול פיברובלסטים (bFGF), גורם גדילה של אנדותל כלי דם (VEGF), גורם גדילה המופק טסיות דם (PDGF), וגורם הגדילה באפידרמיס (EGF) להפעיל תא האנדותל קולטניים תאי האנדותל לשחרר פרוטאזות להשפיל קרום במרתף. תאי האנדותל אז להתרבות ולהעביר, ויצרו נבטים בשיעור של כמה מילימטרים ליום ^6,7.

אנגיוגנזה קשורה למצבים פתולוגיים שונים, כוללים סרטן, פסוריאזיס, רטינופתיה סוכרתית, דלקת מפרקים, אסטמה, הפרעות אוטואימוניות, מחלות זיהומיות, וטרשת עורקת ^8-10. בשל החשיבות של אנגיוגנזה במחלות שונות, הבנת גנים ומסלולים המווסתים את התהליך הזה הוא קריטי לעיצוב של תרופות טובות יותר.

Assay היווצרות הצינור הוא שיטה מהירה וכמותיים לקביעת גנים או מסלולים מעורבים באנגיוגנזה. תואר לראשונה בשנת 1988,העקרונות שבבסיס assay זה הם שתאי האנדותל שומרים על היכולת להתחלק ולהעביר במהירות בתגובה לאותות angiogenic ^11-13. יתר על כן, בתאי האנדותל הנגרמים לבדל וליצור מבנים דמויי צינור כאשר בתרבית על מטריצה ​​של תמצית קרום במרתף (BME). צינורות אלה מכילים לומן מוקף בתאי האנדותל המקושרים ביניהם באמצעות מתחמי junctional. היווצרות צינור מתרחשת במהירות עם רוב הצינורות ויוצרים בassay זה בתוך 2-6 שעות בהתאם לכמות וסוג של גירויי אנגיוגנזה.

מספר סוגים של תאי האנדותל יכולים לשמש עבור assay זה כולל שני תאים ראשוניים ושורות תאים הונצחו ^14,15. שורת התא המשמשת למאמר זה הייתה עכבר 3B-11, אך אותן השיטות יכולות להיות מיושמת עם קווים אחרים אנדותל תא כגון SVEC4-10 (עכבר) או תאי האנדותל עיקריים כגון HUVEC תאים (אדם). תלוי באיזה קו סלולארי משמש והאם ce אנדותלLLS הופכים או לא הופך, אופטימיזציה תצטרך להתנהל כדי לזהות את הזמן האידיאלי נחוץ להיווצרות צינור נכונה.

Protocol

1 האוסף של מדיה אוויר לבדיקת פוטנציאל angiogenic

1. לגדל תאים ראשוניים או הונצחו להיבדק לפוטנציאל angiogenic או אנטי אנגיוגנזה בתקשורת בסרום ילידים נמוכה או לאסוף את התקשורת ממוזגת.
   1. לחלופין, שימוש מותנה בתקשורת באופן מיידי, או aliquoted ומאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים. השתמש בתקשורת בסרום ילידים נמוכה או nonconditioned כביקורת שלילית, ולהשתמש במדיה מיזוג אינם מלאים צמיחה (10% FBS, או ריכוז מתאים) כביקורת חיובית. לחלופין, כדי לבדוק את גירוי פוטנציאל של אנגיוגנזה, תקשורת הפשיטה פחם תוספת חסרת גורמי גדילה עם ריכוזים ידועים של חלבונים ספציפיים של עניין ולהשוות לתקשורת חופשית גורם גדילה לבד.

.2 הכנת תאי האנדותל לפני Assay

1. יומיים לפני assay, מעבר 3B-11 תאים לתוך T-75 בקבוק חדש. מספר מעבר של תאים חשוב. assay זה עובד הכי טוב כאשר תאים הם בין הקטעים השניה והשישי. Assay לא יעבוד גם אם תאי האנדותל משמשים לפני השני או לאחר המעבר עשירית.
2. לגדל תאים ל24 שעות DMEM בתוספת 10% FBS, L-גלוטמין 2 מ"מ, פירובט נתרן 1 מ"מ, 100 U / ml פניצילין, ו100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין.
3. יום אחד לפני assay, סרום להרעיב 3B-11 תאים כדלקמן:
   1. תקשורת לשאוב מתאי 3B-11.
   2. הוסף מדיה סרום מופחתת של DMEM בתוספת FBS 0.2%, L-גלוטמין 2 מ"מ, פירובט נתרן 1 מ"מ, 100 U / ml פניצילין, ו100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין.
   3. לגדל תאים ל24 שעות נוספות.

.3 הכנת ריאגנטים לפני Assay

הערה: ריכוזי BME הם משתנים מאוד תלויים בהרבה. BME לא עובד טוב אם הריכוז הוא פחות מ -10 מ"ג / מ"ל, ולכן יצרן BME יש לפנות לפני רכישה על מנת להבטיחרכישה של הרבה מרוכז כראוי.

1. הפשרה מופחתת גורם גדילת BME במקרר. BME מתמצק כאשר חם, ולכן הוא חייב להיות כל הזמן קר לפני השימוש. ניתן לאחסן BME תחת קירור במשך כמה שבועות, או aliquoted וקפוא ב -80 מעלות צלזיוס.
2. גורם גדילה מופחת BME עדיף על פני BME המסורתי. חוסר גורמי angiogenic בBME יעשה את זה קל יותר להבחין בהשפעה שיש לי גורמים מהתקשורת המותנה בהיווצרות צינור.
3. תקשורת הפשרה להיבדק.

.4 הכנת תאי האנדותל מייד לפני Assay

1. לשטוף 3B-11 תאים בDPBS.
   1. אם הדמיה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal היא רצויה, לפני הכביסה 3B-11 תאים, להוסיף AM calcein לתאי האנדותל בכלי תקשורת בריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל. הנח תאי שכותרתו calcein בחושך ב37 ° C ו 5% CO ₂ לפני תחילת assay. לפזר calcein המניהAM בDMSO ופעם calcein מדולל בריכוז סופי תקשורת של DMSO לא יעלה על 0.1%. אחרי 30-45 בבוקר calcein לשטוף דקות מהתאים (שלב 4.1 לעיל) ולהמשיך בניסוי הבא.
2. Trypsinize תאים על ידי הוספת 1 מ"ל טריפסין-EDTA לT-75 בקבוק.
3. לאחר trypsinization הוא מלא, לנטרל טריפסין על ידי resuspending תאים לנפח סופי של 10ml בDMEM, 10% FBS, L-גלוטמין 2 מ"מ, פירובט נתרן 1 מ"מ, 100 U / ml פניצילין, ו100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין.
4. תאי סינון דרך מסננת תא 100 מיקרומטר כדי להסיר גושים.
5. ספירת תאים ותאי resuspend לריכוז סופי של 7.5 x 10 ⁶ תאים / מ"ל בDMEM, 10% FBS, L-גלוטמין 2 מ"מ, פירובט נתרן 1 מ"מ, 100 U / ml פניצילין, ו100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין.

Assay גיבוש .5 Tube

1. הנח טיפים 24 גם צלחת ו1 מ"ל במקרר או על קרח למשך 20-30 דקות לפני טעינת הצלחת כך שBME לא Prematurely לחזק.
2. Pipet 250 μl של גורם גדילה המופחת BME לבאר כל צלחת 24 גם. הימנע מיצירת בועות על ידי לא מדכא פיפטה לתחנתה הסופית בעת הניפוק. תשמור על עצמך שBME מספיק נשאר במרכז גם כאשר צורות המניסקוס; אם המטריצה ​​היא רזה מדי, התאים רק יוצרים שכבה.
3. דגירה צלחת 24 גם על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 30 דקות כדי לגבש את BME.
4. ברגע שBME קבע, לערבב כ 300 μl של תקשורת ממוזגת עם 10 μl של 3B-11 תאי resuspended (כ 75,000 תאים).
   1. כוון את עוצמת הקול של מדיה ומספר התאים מצופים בהתאם לסוג תא האנדותל בשימוש מותנים, ולבדוק את דילולים סדרתי של התקשורת המותנה להפגין פעילות. אם תאי השוואה גדלו בתנאים שונים, לנרמל התנה תקשורת נפח למספר התאים ששימשו להתנות את התקשורת.
5. wil צינורותl מתחיל להיווצר בתוך 2-4 שעות. בהתאם לריכוז גורם angiogenic בתקשורת המותנה, היווצרות צינור שיא עלולה להתרחש בין 3 ל 12 שעה והעיתוי של assay יצטרך להיות מותאם. אם עובד עם תאי האנדותל עיקריים במקום תאים הונצחו, היווצרות צינור ראשונית עשויה להתעכב בכמה שעות.
   1. צינורות לעתים קרובות יתחילו להתדרדר בתוך 18 תאי שעה ואנדותל יעבור אפופטוזיס.
6. בעת היווצרות צינור שיא, תקשורת לשאוב בזהירות מהבאר כדי למנוע שיבוש רשת הצינור על BME.
   1. לשטוף היטב עם כל 1 DPBS מ"ל, ואז לשאוב.
      1. להדמיה מיידית, להוסיף 1 מ"ל DPBS הטרי לכל רשת צינור היטב ותמונה באמצעות מיקרוסקופ הפוך מצורף למצלמה דיגיטלית, או הקרינה / מיקרוסקופ confocal אם התאים היו מוכתמים בבוקר calcein כמו ב4.1.1.
      2. כדי לתקן את רשת הצינור להדמיה מאוחר יותר, ולהוסיף paraformaldehyde 4% לכל אחדלהישאף היטב דגירה ל15 דקות בטמפרטורת חדר.
         1. הסר paraformaldehyde, לשטוף פעמיים עם DPBS, ולאחר מכן להוסיף 1mL DPBS הטרי היטב כל אחד.
         2. תמונה מיקרוסקופית לפני הקיבוע ככמה צינורות עשויים לשבור במהלך הליך זה.

.6 כימות רשת Tube

1. לכמת את רשת הצינור במספר דרכים שונות בהתאם להעדפותיו של החוקר, ויש לי כמה תוכנות מחשב יכולת למדוד את הפרמטרים הבאים: מספר הצינורות; מספר לולאות / רשתות; מספר אתרי סניף / צמתים; אורך של צינורות.
2. השתמש בתוכנת מחשב נציג כגון J תמונה עם תוסף אנגיוגנזה Analyzer ¹⁶ לכימות של רשתות צינור.

תוצאות

עכבר 3B-11 תאי האנדותל היו זורעים על גורם גדילה מופחתת הקרושה BME - בassay זה, מוצר Matrigel שימש - ואחריו לאורך זמן. כפי שניתן לראות באיור 1, גורמי angiogenic מופרשים על ידי שני הקרטינוציטים עכבר או פיברובלסטים הם מסוגלים גרימת היווצרות צינור לאורך זמן. תאי האנדותל להגר ולהת?...

Discussion

אנגיוגנזה היא מעורבת בשני תהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים. חקר מנגנונים המעורבים באנגיוגנזה דורש השימוש במבחנים שיסכמו את השלבים העיקריים באנגיוגנזה. Assay היווצרות צינור תא האנדותל מציע מספר יתרונות על פני מבחני אחרים. זה קל להגדרה, הוא זול יחסית, מייצר tubules בתוך שעות...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Costar 24-well tissue culture-treated plate	Corning	3524
BD Matrigel basement membrane matrix, growth factor reduced	BD Biosciences	354230
Gibco 0.05% trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
Gibco L-glutamine 200 mM (100x)	Life Technologies	25030-081
Gibco pen strep	Life Technologies	15140-122
Gibco DMEM (1x)	Life Technologies	11965-092
Gibco DPBS (1x)	Life Technologies	14190-144
Fetal Bovine Serum	Atlas Biologicals	F-0500-A
Calcein AM	Life Technologies	C3100MP
DMSO	ATCC	4-X