Endothelzellen Schlauchbildung Assay für die<em&gt; In-vitro-</em&gt; Studium der Angiogenese

Zusammenfassung

Das Rohr-Assay ist eine schnelle, quantifizierbare Verfahren zum Messen in vitro Angiogenese. Endothelzellen werden mit konditioniertem Medium kombiniert und Basalmembran-Extrakt ausgestrichen. Schlauchbildung erfolgt innerhalb von Stunden und neu gebildeten Tubuli leicht quantifizieren.

Zusammenfassung

Angiogenese ist ein wichtiger Prozess für normale Gewebeentwicklung und der Wundheilung, aber auch mit einer Vielzahl von pathologischen Zuständen verbunden sind. Über dieses Protokoll kann die Angiogenese in vitro in einem schnellen, messbaren Weise gemessen werden. Primäre oder immortalisierte Endothelzellen mit konditioniertem Medium vermischt und auf Basalmembranmatrix plattiert. Die Endothelzellen bilden Kapillare artigen Strukturen in Abhängigkeit von angiogenen Signale in konditioniertem Medium gefunden. Das Rohr Bildung erfolgt schnell mit Endothelzellen beginnen, sich innerhalb von 1 Stunde und Lumen-haltigen Tubuli beginnen, innerhalb von 2 h erscheinen auszurichten. Rohre können mit einem Phasenkontrastmikroskop sichtbar invertiert werden, oder die Zellen können mit Calcein AM vor dem Assay und Rohre, durch Fluoreszenz oder konfokale Mikroskopie sichtbar behandelt werden. Die Anzahl der Verzweigungsstellen / Knoten, Schlaufen / Maschen, oder die Anzahl oder Länge der Rohre gebildet wird, leicht als ein Maß der in vitr quantifiziert werdeno Angiogenese. Zusammenfassend kann dieser Assay verwendet werden, um Gene und Signalwege, die für die Förderung oder Hemmung von Angiogenese in einem schnelle, reproduzierbare und quantitative Weise beteiligt sind, zu identifizieren.

Einleitung

Angiogenese, die Bildung neuer Blutgefäße aus bereits existierenden Schiffen, ist von entscheidender Bedeutung für eine Vielzahl von Verfahren, einschließlich Organwachstum, Embryonalentwicklung, Wundheilung und ^1-3. Neu entwickelten Blutgefäße, durch Endothelzellen, Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen zu den Geweben ausgekleidet, die Förderung der Immunüberwachung von hämatopoetischen Zellen und entfernen Abfallprodukte ^2,4. Angiogenese ist von zentraler Bedeutung während der embryonalen und fetalen Entwicklung. Allerdings ist dieses Verfahren ruhend im erwachsenen außer während Zeiten der Wundheilung, Knochenwachstums, Schwangerschaft oder während des Menstruationszyklus ^1-3.

In den letzten zwei Jahrzehnten, Schlüssel molekularen Mechanismen, die Angiogenese zu regulieren haben begonnen, zu entstehen. Die Angiogenese ist ein streng regulierter Veranstaltung, die von pro und anti-angiogenen Signale einschließlich Integrine, Chemokine, Angiopoietine, Sauerstofferfassungsmittel, Junction-Moleküle und endogenen Inhibitoren ⁵ ausgeglichen. Sobald proangiogenic Signale, wie basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), Blutplättchen-Wachstumsfaktor (PDGF) und epidermalen Wachstumsfaktor (EGF)-Rezeptoren aktivieren die Endothelzellen Endothelzellen frei Proteasen an der Basalmembran abzubauen. Die Endothelzellen proliferieren und wandern dann bilden Sprossen mit einer Geschwindigkeit von einigen Millimetern pro Tag ^6,7.

Angiogenese ist mit verschiedenen Krankheitszuständen, einschließlich Krebs, Psoriasis, diabetische Retinopathie, Arthritis, Asthma, Autoimmunerkrankungen, Infektionskrankheiten und Atherosklerose ^8-10 zugeordnet. Wegen der Bedeutung der Angiogenese bei verschiedenen Krankheiten, Analyse von Genen und Signalwege, die zu regulieren Dieses Verfahren ist für die Entwicklung besserer Therapeutika.

Das Rohr-Assay ist eine schnelle und quantitative Verfahren zur Bestimmung von Genen oder Wege in der Angiogenese beteiligt. 1988 erstmals beschrieben,die Grundsätze dieses Tests zugrunde liegen, dass Endothelzellen die Fähigkeit sich zu teilen und zu migrieren rasch in Reaktion auf angiogenen Signale ^11-13 behalten. Ferner sind Endothelzellen induziert, um zu differenzieren, und bilden röhrenförmige Strukturen, wenn sie auf einer Matrix von Basalmembran-Extrakt (BME) kultiviert. Diese Röhrchen enthalten ein Lumen von Endothelzellen zusammen durch junktionale Komplexe verknüpft umgeben. Schlauchbildung erfolgt schnell mit den meisten Röhren bilden in diesem Test innerhalb von 2-6 Stunden, je nach Menge und Art der angiogenen Stimuli.

Mehrere Arten von Endothelzellen kann für diesen Assay sowohl primäre Zellen und immortalisierten Zelllinien ^14,15 verwendet werden. Die Zelllinie für diesen Artikel war Maus 3B-11, aber die gleiche Methodik kann mit anderen Endothel-Zelllinien, wie SVEC4-10 (Maus) oder primären Endothelzellen wie HUVEC (menschliche) Zellen angewandt werden. Je nachdem, welcher Zelllinie verwendet wird, und ob der endothelialen cells umgewandelt oder nicht transformierten, wird Optimierung müssen durchgeführt, um den idealen Zeitpunkt für die richtige Schlauchbildung erforderlich zu identifizieren.

Protokoll

1. Erhebung von konditionierten Medien für Angiogenic Mögliche Testen

1. Wachsen primäre oder immortalisierte Zellen für angiogene oder anti-angiogene Potential in nativer oder niedrigen Serum-Medien getestet und sammeln die konditionierten Medien.
   1. Alternativ Verwendung konditionierten Medien unmittelbar oder aliquotiert und bei -80 ° C für mehrere Monate gelagert. Verwenden nonconditioned native oder niedrige Serum Medien als Negativkontrolle, und verwenden Sie nicht-konditionierten komplette Wachstumsmedien (10% FBS oder entsprechende Konzentration) als positive Kontrolle. Alternativ, um mögliche Stimulatoren der Angiogenese zu testen, zu ergänzen, Aktivkohle gereinigt Medium ohne Wachstumsfaktoren mit bekannten Konzentrationen bestimmter Proteine ​​von Interesse und zu vergleichen, um Wachstumsfaktor freien Medien allein.

2. Herstellung von Endothelzellen vor dem Test

1. Zwei Tage vor dem Test, Durchgang 3B-11-Zellen in einen neuen T-75-Kolben. Passage Anzahl von Zellen ist wichtig,. Dieser Test funktioniert am besten, wenn die Zellen zwischen den zweiten und sechsten Passagen. Der Test wird nicht funktionieren gut, wenn Endothelzellen vor der zweiten oder nach dem zehnten Durchgang verwendet.
2. Wachsen Zellen für 24 h in DMEM, ergänzt mit 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin.
3. Ein Tag vor dem Test, Serum verhungern 3B-11-Zellen wie folgt:
   1. Absaugen Medien aus den 3B-11-Zellen.
   2. Reduziert Serummedien DMEM, ergänzt mit 0,2% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin.
   3. Wachsen Zellen für weitere 24 Stunden.

3. Vorbereitung der Reagenzien vor dem Test

HINWEIS: BME-Konzentrationen sehr variabel abhängig von Menge sind. BME funktioniert nicht gut, wenn die Konzentration von weniger als 10 mg / ml, daher sollte der BME-Hersteller vor dem Kauf, um sicherzustellen, kontaktiert werdenErwerb einer ausreichend konzentriert Grundstück.

1. Abtauen reduziert Wachstumsfaktor BME in den Kühlschrank stellen. BME erstarrt, wenn warm, so muss es vor der Verwendung kalt gehalten werden. BME kann unter Kühlung für einige Wochen gelagert werden oder aliquotiert und bei -80 ° C eingefroren.
2. Eine reduzierte Wachstumsfaktor BME über traditionelle BME bevorzugt. Das Fehlen von angiogenen Faktoren im BME wird es einfacher, den Effekt, der aus dem konditionierten Medium auf der Schlauchbildung haben Faktoren zu beobachten.
3. Tau-Medien getestet werden.

4. Herstellung von Endothelzellen Unmittelbar vor dem Assay

1. Wasch 3B-11-Zellen in DPBS.
   1. Wenn Visualisierung mit Fluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie gewünscht, vor dem Waschen 3B-11-Zellen, fügen Calcein AM an die Endothelzellen in Medium mit einer Endkonzentration von 2 ug / ml. Platzieren Calcein markierter Zellen in der Dunkelheit bei 37 ° C und 5% CO ₂ vor Beginn des Assays. Auflösen Lager CalceinUhr in DMSO und einmal Calcein in Medien Endkonzentration von DMSO sollte 0,1% nicht überschreiten. Nach 30-45 min Wasch Calcein AM aus den Zellen (Schritt 4.1 oben) und weiter mit dem Experiment folgt.
2. Trypsinize Zellen durch Zugabe von 1 ml Trypsin-EDTA-T-75-Kolben.
3. Nach vollständiger Trypsinierung ist, neutralisieren Trypsin durch Resuspendieren Zellen auf ein Endvolumen von 10 ml in DMEM, 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin.
4. Filterzellen durch 100 um Zellsieb um Klumpen zu entfernen.
5. Zählen von Zellen und Resuspension Zellen zu einer Endkonzentration von 7,5 x 10 ⁶ Zellen / ml in DMEM, 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin.

5. Schlauchbildung Assay

1. Platz 24-Well-Platte und 1 ml-Tipps im Kühlschrank oder auf Eis für 20-30 min vor dem Laden der Platte, so dass die BME nicht prematurely verfestigen.
2. Pipette 250 ul reduziert Wachstumsfaktor BME in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte. Vermeiden Sie Blasen durch Drücken der Pipette nicht bis zur Endhaltestelle unter Verzicht. Darauf achten, dass genügend BME bleibt in der Mitte des Brunnens, wenn der Meniskus Formen; wenn die Matrix zu dünn ist, werden die Zellen, die nur eine Monoschicht bilden.
3. Inkubiere 24-Well-Platte bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 30 min auf BME verfestigen.
4. Sobald BME eingestellt hat, mischen Sie ca. 300 ul konditionierten Medien mit 10 ul resuspendiert 3B-11-Zellen (ca. 75.000 Zellen).
   1. Stellen Sie die Lautstärke der konditionierten Medien und die Anzahl der Zellen überzogen, je nach endothelialen Zelltyp verwendet wird, und testen Sie die serielle Verdünnungen der konditionierten Medien, um die Aktivität zu demonstrieren. Vergleicht man Zellen unter verschiedenen Bedingungen gezüchtet, normalisieren konditionierten Medien Volumen auf die Zahl der Zellen, die verwendet wurden, um das Medium zu konditionieren.
5. Rohre will beginnen, innerhalb von 2-4 Stunden zu bilden. Je nach Konzentration angiogenen Faktor in den konditionierten Medien können Spitzenröhrenbildung auftreten, zwischen 3 und 12 Stunden und der Zeitpunkt des Assays optimiert werden müssen. Bei der Arbeit mit primären Endothelzellen statt immortalisierten Zellen kann die anfängliche Schlauchbildung um mehrere Stunden verzögert werden.
   1. Röhren beginnen oft innerhalb von 18 Stunden und Endothelzellen verschlechtern wird Apoptose.
6. Zum Zeitpunkt der Spitzenröhrenbildung zu vermeiden sorgfältig absaugen Medien aus dem Bohrloch Unterbrechung des Rohrnetzes auf der BME.
   1. Waschen Sie jede Vertiefung mit 1 ml DPBS, dann absaugen.
      1. Für die sofortige Visualisierung, 1 ml frischem DPBS in jede Vertiefung und Bild der Röhre Netzwerk mit einem inversen Mikroskop, um eine Digitalkamera, oder Fluoreszenz / konfokalen Mikroskop angebracht, wenn die Zellen mit Calcein AM wie in 4.1.1 gefärbt.
      2. Zur Fixierung des Rohrnetzes für später Visualisierung, und fügen Sie 4% Para jedemgut abgesaugt und die Proben für 15 min bei Raumtemperatur.
         1. Para entfernen, waschen zweimal mit DPBS, dann frisch DPBS hinzufügen 1 ml in jede Vertiefung.
         2. Mikroskopisch Bild vor der Fixierung so wenige Rohre können bei diesem Verfahren zu brechen.

6. Quantifizierung von Rohrnetz

1. Quantifizierung der Rohrnetz auf verschiedene Weise, je nach Präferenz des Untersuchers und mehrere Computerprogramme die Fähigkeit haben, die folgenden Parameter zu messen: Anzahl der Rohre; Anzahl der Schleifen / Maschen; Anzahl der Verzweigungsstellen / Knoten; Länge der Rohre.
2. Verwenden repräsentativen Computerprogramm wie Bild J mit der Angiogenese Analyzer Plugin ¹⁶ zur Quantifizierung von Rohrnetzen.

Ergebnisse

Maus 3B-11-Endothelzellen wurden auf verfestigtem reduzierte Wachstumsfaktor BME ausgesät - in diesem Assay das Produkt Matrigel wurde - und über die Zeit verfolgt. Wie in 1 gezeigt, sind in der Lage der Schlauchbildung zu induzieren über die Zeit angiogenen Faktoren entweder durch Maus-Keratinozyten oder Fibroblasten sezerniert. Endothelzellen migrieren und beginnen, kleine Äste in 1-2 h Beschichtung bilden. Maximaler Rohrbildung wurde durch 4-6 h mit zuvor aus Keratinozyten erhalten konditionierte...

Diskussion

Angiogenese ist sowohl in physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt sind. Studium der Mechanismen der Angiogenese beteiligt die Verwendung von Assays, die die Hauptschritte bei der Angiogenese rekapitulieren. Die Endothelzellen Rohr-Assay bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Tests. Es ist einfach zu Set-up, ist relativ kostengünstig, produziert Tubuli innerhalb von Stunden, und quantifizierbar ist. Ferner kann sie in 24 oder 96-Well-Platten durchgeführt werden, und können somit zur Hochdurchsatz-Sc...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Costar 24-well tissue culture-treated plate	Corning	3524
BD Matrigel basement membrane matrix, growth factor reduced	BD Biosciences	354230
Gibco 0.05% trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
Gibco L-glutamine 200 mM (100x)	Life Technologies	25030-081
Gibco pen strep	Life Technologies	15140-122
Gibco DMEM (1x)	Life Technologies	11965-092
Gibco DPBS (1x)	Life Technologies	14190-144
Fetal Bovine Serum	Atlas Biologicals	F-0500-A
Calcein AM	Life Technologies	C3100MP
DMSO	ATCC	4-X