Endotelial Tubo celular Formação ensaio para a<em&gt; In Vitro</em&gt; Estudo da angiogênese

Resumo

O ensaio de formao de tubo é um método rápido, quantificável para medir a angiogénese in vitro. As células endoteliais são combinados com meios condicionados e semeadas em extracto de membrana basal. A formação do tubo ocorre dentro de poucas horas e túbulos recém-formados facilmente quantificada.

Resumo

A angiogénese é um processo fundamental para o desenvolvimento de tecido normal e cicatrização de feridas, mas também está associada a uma variedade de condições patológicas. Utilizando este protocolo, a angiogénese pode ser medida in vitro, de um modo rápido, quantificável. Células endoteliais primárias ou imortalizadas são misturados com meios condicionados e semeadas em matriz de membrana basal. As células endoteliais formam estruturas semelhantes a capilares em resposta a sinais angiogénicos encontrados em meios condicionados. A formação do tubo ocorre rapidamente com células endoteliais começam a alinhar-se dentro de 1 hora e túbulos contendo lúmen começando a aparecer dentro de 2 horas. Os tubos podem ser visualizados utilizando um microscópio invertido de contraste de fase, ou as células podem ser tratadas com calceína AM antes do ensaio e tubos visualizado através de fluorescência ou microscopia confocal. O número de locais de filiais / nós, laços / malhas, o número ou o comprimento dos tubos de formados podem ser facilmente quantificado como uma medida de em VITRo angiogénese. Em resumo, este ensaio pode ser usado para identificar genes e vias que estão envolvidos na promoção ou inibição de angiogénese de um modo rápido, reprodutível e quantitativa.

Introdução

A angiogénese, desenvolvimento de novos vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes, é essencial para uma variedade de processos, incluindo o crescimento de órgãos, desenvolvimento embrionário, a cicatrização de feridas e ^1-3. Recentemente desenvolvido vasos sanguíneos, revestidos por células endoteliais, suprimento de oxigênio e nutrientes para os tecidos, promover a vigilância imunológica por células hematopoiéticas e remover os resíduos ^2,4. A angiogênese é de fundamental importância durante o desenvolvimento embrionário e fetal. No entanto, este processo permanece dormente no adulto, exceto durante os períodos de cicatrização de feridas, crescimento esquelético, a gravidez ou durante o ciclo menstrual ^1-3.

Ao longo das duas últimas décadas, os mecanismos moleculares fundamentais que regulam a angiogênese começaram a surgir. A angiogênese é um evento estritamente regulado, equilibrado pelo pró e antiangiogênicos sinais incluindo as integrinas, quimiocinas, angiopoietinas, agentes sensores de oxigênio, moléculas juncional e inibidores endógenos ^5. Uma vez proangiogenic sinais tais como o factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e factor de crescimento epidérmico (EGF) activam os receptores de células endoteliais nas células endoteliais libertam proteases para degradar a membrana basal. As células endoteliais proliferam em seguida e migram, formando brotos a uma taxa de vários milímetros por ^6,7 dias.

A angiogénese está associada a várias condições patológicas, incluindo cancro, psoríase, retinopatia diabética, artrite, asma, doenças auto-imunes, doenças infecciosas, e aterosclerose ^8-10. Devido à importância da angiogénese em várias doenças, compreendendo os genes e vias que regulam este processo é crítica para a concepção de melhores terapias.

O ensaio de formao de tubo é um método rápido e quantitativo para a determinação de genes ou vias envolvidas na angiogénese. Descrita pela primeira vez em 1988,os princípios subjacentes a este ensaio são as células endoteliais que retêm a capacidade de dividir e migrar rapidamente, em resposta a sinais angiogénicos ^11-13. Além disso, as células endoteliais são induzidas a diferenciar e formar estruturas semelhantes a tubos quando cultivadas numa matriz de extracto de membrana basal (BME). Estes tubos contêm um lúmen rodeado por células endoteliais ligadas entre si por meio de complexos juncionais. A formação do tubo ocorre rapidamente com a maioria dos tubos formando neste ensaio dentro de 2-6 horas, dependendo da quantidade e do tipo de estímulos angiogénicos.

Vários tipos de células endoteliais pode ser utilizado para este ensaio, incluindo ambas as células primárias e as linhas de células imortalizadas ^14,15. A linha celular utilizada para este artigo foi rato 3B-11, mas o mesmo método pode ser aplicado a outras linhas de células endoteliais, tais como SVEC4-10 (ratinho) ou células endoteliais primárias, tais como células humanas (HUVEC). Dependendo da linhagem de células é utilizado e se o ce endoteliallls são transformadas ou não transformadas, a optimização necessita de ser realizado para identificar o tempo ideal necessário para a formação do tubo adequado.

Protocolo

1 Coleção de meios condicionados teste para potencial angiogênico

1. Cultivar células primárias ou imortalizadas para ser testado para potencial angiogênico ou anti-angiogênico em meio de soro nativas ou baixas e recolher meios condicionados.
   1. Em alternativa, a utilização de meios condicionados imediatamente, ou divididos em alíquotas e armazenado a -80 ° C durante vários meses. Usar meios de soro nativo ou nonconditioned baixo como um controlo negativo, e utilizar meios não-condicionado completo de crescimento (10% FBS, ou concentração apropriada) como um controlo positivo. Como alternativa, para testar potenciais estimuladores da angiogênese, suplemento de carvão mídia despojado sem fatores de crescimento, com concentrações conhecidas de proteínas específicas de interesse e comparar com fator de crescimento mídia livre sozinho.

2 Preparação de células endoteliais antes do ensaio

1. Dois dias antes do ensaio, a passagem 3B-11 células para um novo frasco T-75. Número de passagem das células é importante. Este ensaio funciona melhor quando as células estão entre as segunda e sexta passagens. O ensaio não vai funcionar bem se as células endoteliais são utilizados antes da segunda ou após a décima passagem.
2. Crescer as células durante 24 horas em DMEM suplementado com 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 100 U / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina.
3. Um dia antes do ensaio, soro fome 3B-11 células, como se segue:
   1. Aspirar mídia das células 11 3B-.
   2. Adicionar meio de soro reduzido de DMEM suplementado com 0,2% de FBS, 2 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 100 U / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina.
   3. Crescer as células durante mais 24 horas adicionais.

3: Preparação de reagentes antes do ensaio

NOTA: As concentrações de minorias étnicas são altamente variável dependente muito. O BME não funcionam bem, se a concentração é inferior a 10 mg / ml, por conseguinte, o fabricante deve ser contactado BME antes da compra para asseguraraquisição de um lote de concentrado de forma adequada.

1. Degelo reduzido fator de crescimento BME na geladeira. BME solidifica quando aquecido, por isso deve ser mantido frio antes de usar. BME pode ser armazenado sob refrigeração durante algumas semanas, ou divididos em alíquotas e congeladas a -80 ° C.
2. Um fator de crescimento reduzido BME é preferível a BME tradicional. A falta de fatores angiogênicos na BME irá torná-lo mais fácil de observar o efeito que os fatores do meio condicionado têm na formação do tubo.
3. Meios de descongelação para ser testado.

4 Preparação de Células Endoteliais Imediatamente antes do ensaio

1. Lavar 3B-11 em células de DPBS.
   1. Se a visualização em microscopia confocal de fluorescência ou é desejado, antes de lavá-3B 11 células, adicionar calceina AM às células endoteliais em meio a uma concentração final de 2 ug / ml. Colocar as células marcadas calceína no escuro a 37 ° C e 5% de CO ₂ antes do início do ensaio. Dissolver estoque calce�aAM em DMSO e uma vez que a calceina é diluída em meio de concentração final de DMSO não deve exceder 0,1%. Após 30-45 min lavagem calce�a AM a partir das células (passo 4.1) e continuar com o experimento segue.
2. Tripsinizar as células por adição de 1 ml de tripsina-EDTA para frascos T-75.
3. Após tripsinização é completa, neutralizar a tripsina por ressuspensão células para um volume final de 10 ml em DMEM, 10% FBS, 2 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 100 U / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina.
4. Células filtro através do 100 um filtro de células para remover pedaços.
5. Contar as células e ressuspender as células a uma concentração final de 7,5 x 10 ⁶ células / ml em DMEM, 10% FBS, 2 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 100 U / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina.

Formação 5 Tubo de Ensaio

1. Colocar 24 poços de placas e 1 ml de pontas em frigorífico ou em gelo durante 20-30 minutos antes de carregar a placa de modo que a BME não prematurely solidificar.
2. Pipetar 250 l de factor de crescimento reduzida de BME em cada poço de uma placa de 24 poços. Evite criar bolhas por não pressionar a pipeta para sua última parada, enquanto a distribuição. Tome cuidado para que suficiente BME continua no centro do poço quando as formas de menisco; Se a matriz é muito fino, apenas as células formarão uma monocamada.
3. Incubar placa de 24 poços a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 30 minutos para solidificar BME.
4. Uma vez que a BME definiu, misturar cerca de 300 ul de meio condicionado com 10 ul de ressuspensos 3B-11 células (aproximadamente 75.000 células).
   1. Ajustar o volume de meio condicionado, o número de células plaqueadas dependendo do tipo de célula endotelial utilizado, e testar as diluições em série dos meios condicionados para demonstrar a actividade. Se comparando células cultivadas sob diferentes condições, normalizar condicionado volume de mídia para o número de células que foram utilizadas para condicionar os meios de comunicação.
5. Tubos will começam a se formar dentro de 2-4 horas. Dependendo da concentração de factor angiogénico no meio condicionado, a formação do tubo de pico pode ocorrer entre 3 e 12 horas e o tempo do ensaio terá de ser optimizada. Se estiver a trabalhar com células endoteliais primárias, em vez de células imortalizadas, a formação do tubo inicial pode ser atrasada por várias horas.
   1. Tubes, muitas vezes, começam a deteriorar-se no prazo de 18 células endoteliais hr e passará por apoptose.
6. No momento da formação pico tubo, mídia cuidadosamente aspirado do poço para evitar a ruptura do tubo de rede na BME.
   1. Lavar cada poço com 1 ml de DPBS, em seguida, aspirar.
      1. Para visualização imediata, adicione 1 ml DPBS frescas para cada rede tubo bem e imagem usando um microscópio invertido ligado a uma câmera digital, ou fluorescência / microscópio confocal se as células foram marcadas com calceína AM como em 4.1.1.
      2. Para fixar a rede de tubos para posterior visualização, e adicionar paraformaldeído 4% a cadaaspirada bem e incubar durante 15 min à temperatura ambiente.
         1. Remover paraformaldeído, lavar duas vezes com DPBS e depois adicionar 1 mL de DPBS fresco a cada poço.
         2. Microscopicamente imagem antes da fixação de alguns dos tubos pode quebrar durante este procedimento.

6. Quantificação da rede de metro

1. Quantificar a rede de tubos de várias maneiras diferentes, dependendo da preferência do investigador, e vários programas de computador têm a capacidade de medir os seguintes parâmetros: número de tubos; número de loops / malhas; número de locais de filiais / nós; comprimento de tubos.
2. Use programa de computador representante como J Imagem com o plugin angiogênese Analyzer ¹⁶ para quantificação de redes de tubos.

Resultados

Rato 3B-11 as células endoteliais foram semeadas em factor de crescimento reduzida solidificada BME - neste ensaio, o produto foi utilizado Matrigel - e seguido ao longo do tempo. Como mostrado na Figura 1, os factores angiogénicos segregados por qualquer queratinócitos de ratinho ou de fibroblastos são capazes de induzir a formação do tubo ao longo do tempo. As células endoteliais migram e começam a se formar pequenos ramos dentro de 1-2 horas de galvanização. Formação máxima tubo foi alca...

Discussão

A angiogénese está envolvida em ambos os processos fisiológicos e patológicos. O estudo dos mecanismos envolvidos na angiogénese necessita da utilização de ensaios que recapitulam as etapas principais na angiogénese. O ensaio de formao de tubo endotelial oferece várias vantagens em relação a outros ensaios. É fácil de configurar, é relativamente barato, produz túbulos dentro de horas, e é quantificável. Além disso, pode ser completado em 24 ou placas de 96 poços, e, assim, pode ser utilizado para a tr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Costar 24-well tissue culture-treated plate	Corning	3524
BD Matrigel basement membrane matrix, growth factor reduced	BD Biosciences	354230
Gibco 0.05% trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
Gibco L-glutamine 200 mM (100x)	Life Technologies	25030-081
Gibco pen strep	Life Technologies	15140-122
Gibco DMEM (1x)	Life Technologies	11965-092
Gibco DPBS (1x)	Life Technologies	14190-144
Fetal Bovine Serum	Atlas Biologicals	F-0500-A
Calcein AM	Life Technologies	C3100MP
DMSO	ATCC	4-X