على الفحص لتجديد الخط الجانبي في اسماك الزرد الكبار

Summary

لأنه يتم دراسة العديد من النماذج الزرد من الأمراض العصبية وغير العصبية في الأسماك البالغة بدلا من الجنين / اليرقات، وضعنا كمية الجانبي الخط التجديدي الفحص التي يمكن تطبيقها على نماذج المرض الزرد الكبار. تشارك مقايسة القرار في 1) neuromast و2) مستويات خلية الشعر الفردية.

Abstract

نظرا لأهمية سريرية السمع واضطرابات التوازن في الإنسان والكائنات نموذج مثل الزرد وقد استخدمت لدراسة تطوير وتجديد الخط الجانبي. الزرد هو جاذبية خاصة لمثل هذه الدراسات لما له من وقت التطوير السريع والقدرة العالية على التجدد. حتى الآن، وقد استخدمت الدراسات الزرد الوحشي من خط التجديد أساسا الأسماك من المراحل الجنينية واليرقات بسبب انخفاض عدد neuromasts في هذه المراحل. جعلت هذا التحليل الكمي من الخط الجانبي تجديد / أو تطوير وأسهل في المراحل التنموية السابقة. لأنه يتم دراسة العديد من النماذج الزرد من الأمراض العصبية وغير العصبية في الأسماك البالغة وليس في الجنين / اليرقات، ركزنا على تطوير الكمي الأفقي خط التجدد مقايسة في الزرد الكبار بحيث كان الفحص المتاحة التي يمكن تطبيقها على الحالي نماذج المرض الزرد الكبار. بناء على الدراسات السابقة من قبل فان Trumع وآخرون ¹⁷ التي وصفت إجراءات الاجتثاث من خلايا الشعر في الكبار المكسيكية الأسماك العمياء الكهف والزرد (دانيو rerio)، وقد صمم الاختبار لدينا للسماح المقارنة الكمية بين السيطرة والمجموعات التجريبية. وقد تحقق هذا من خلال تطوير منحنى القياسية neuromast التجدد على أساس المئة من ظهور neuromast على مدى فترة زمنية 24 ساعة التالية نخر الناجم عن جنتاميسين من خلايا الشعر في منطقة محددة من الخط الجانبي. وقد تم تصميم الفحص أيضا للسماح بتمديد التحليل إلى مستوى خلية الشعر الفرد عندما يطلب إلى مستوى أعلى من القرار.

Introduction

الخط الجانبي (LL) هو نظام الجهاز ميكانيكية حسية وجدت في كل من الأسماك والبرمائيات هي المسؤولة عن السمع والتوازن والتوسط انجذاب تياري والسلوكيات مثل التعليم وتجنب الحيوانات المفترسة ^1-5. وتتكون من مجموعات من الخلايا محاطة خلايا الشعر الداعمة، وكلاهما المتمركزة في هياكل ودعا neuromasts ^6. ويتم تنظيم هذه neuromasts عادة في خطوط عمودية (وتسمى غرزة) على طول المحور الطولي للجسم والذيل مع بعض الغرز الأفقي لوحظ في الرأس من الأسماك. في الكبار، neuromasts هي أكبر بكثير في عدد الغرز داخل بالمقارنة مع الجنينية أو اليرقات السمكية ^6. وقد ركزت الدراسات الطبية الحيوية في الزرد على تأثير العلاج بالمضادات الحيوية، والصدمات النفسية الناجمة عن الضوضاء، والعدوى المزمنة، الخ. على خلايا الشعر ^7،8 في محاولة لفهم أفضل لآثارها في البشر.

وخلافا لمعظم الفقاريات، الشركة المصرية للاتصالاتleosts، مثل الزرد (دانيو rerio)، لديها القدرة على تجديد خلايا الشعر المفقودة. الزرد هي مفيدة بشكل خاص بسبب وقتهم التطور السريع والقدرة على التجدد عالية. حتى الآن، ولكن؛ وقد استخدمت الدراسات الزرد على تطوير الخط الجانبي و / أو تجديد أساسا الأسماك واليرقات المرحلة الجنينية بسبب انخفاض عدد neuromasts الخط الجانبي الذي يسمح لتسهيل الفرز والتحليل ^6،9،10.

ومع ذلك، يتم دراسة العديد من نماذج الزرد من الأمراض العصبية وغير العصبية ^11-16 في الأسماك البالغة وليس اليرقات، ركزنا على تطوير التجدد فحص الخط الجانبي في الزرد الكبار باستخدام الجنتاميسين (أمينوغليكوزيد المستخدمة سابقا في اليرقات الزرد و تستخدم في الآونة الأخيرة مع الأسماك البالغة ¹⁷⁾ بحيث كان الفحص المتاحة التي يمكن تطبيقها على الكبار نماذج المرض الزرد الحالي. في حين نشرت سابقا الإجراءات التي كتبها فان ترامب هر آل ¹⁷ التي أنشئت شروط الاجتثاث خلية الشعر في الأسماك البالغة، إلا أنها لم تنشئ المنحنى القياسي لتجديد neuromast وهو مطلوب للمقارنة كمية بين السيطرة والمجموعات التجريبية مثل عند استخدام خطوط الزرد المعدلة وراثيا أو الحالات المرضية التي يسببها عقاقيري- في الزرد ^18. وبالتالي فإننا الإجراءات المتبعة فان ترامب وآخرون ⁽¹⁷⁾ لالاجتثاث خلية الشعر، ولكن مبنية على عملهم لإنشاء منحنى القياسية للتجديد neuromast لتمكين الباحثين لاستخدام البيانات المتوفرة لدينا عند مقارنة الضابطة والتجريبية مثل مع نماذج مرض الزرد الكبار . وقد تم تصميم الفحص أيضا للسماح بتمديد التحليل إلى خلية الشعر الفردية عندما يكون مطلوبا مستوى أعلى من القرار.

Protocol

يتم تنفيذ كافة الإجراءات التالية الإرشادات الموضحة في "مبادئ رعاية الحيوان المعملية" (المعاهد الوطنية للصحة المنشور رقم 85-23، منقحة 1985) وبروتوكول الحيوان اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام روزاليند فرانكلين جامعة افق 08-19.

1. جنتاميسين-تحريض الشعر خلية نخر

1. إعداد جنتاميسين سلفات في المياه المالحة العادية في تركيز النهائي من 0.004٪ (4.32 ملم).
2. وضع الأسماك البالغة (D. rerio، 4-6 أشهر من العمر) في وعاء يحتوي على 0.004٪ (4.32 ملم) حل الجنتاميسين. أي حاوية يمكن استخدامها، ولكن نحن نستخدم وعاء الأسماك من نظام المائية صيدلي وهو 7 في نطاق واسع، 6 في ارتفاع، و 7 في طويلة. وضع الحاوية مع الأسماك في حاضنة وضعت في 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. تعيين إجمالي حجم السائل في الخزان على مستوى كاف للحفاظ على الأسماك في دولة قابلة للحياة لفترة ساعة 24. ملاحظة: تهوية السائل جنتاميسين ليس necessary إذا تم استخدام حجم كاف لعدد من الأسماك التي يجري علاجها.

2. تلطيخ الحيوية من خلايا الشعر

1. إعداد تركيز 0.08٪ (في المياه المالحة العادي) من الصبغة الحيوية الفلورسنت [4-4-diethylaminostyryl)-N-methylpyridinium يوديد (485 نانومتر الإثارة λ و 603 نانومتر λ الانبعاثات في الميثانول) من محلول المخزون من العمل 15 ملغ / مل في الايثانول.
2. لتحديد ما إذا كان العلاج الفعال جنتاميسين مجموعة فرعية من السيطرة وجنتاميسين هي ملطخة الأسماك تعالج على الفور عن طريق وضع الأسماك في بئر من لوحة 6 جيدا الثقافة تحتوي على الصبغة الحيوية. استخدام عدد كاف من الأسماك (وألواح الثقافة كما هو مطلوب للدلالة إحصائية لتحقيقه. بناء على سرعة الفاحص العد neuromast، ضع السمك في لوحات بطريقة متداخلة مع مرور الوقت بحيث لا يتم ملطخة أن الأسماك لأكثر من 75 دقيقة كما هو موضح في الخطوة 2.3.
3. وضع لوحات من الخطوة 2.2 في درج مقاعد البدلاء بواسطة المجهر الفلورسنت لأن تستخدم لفحص neuromasts الملون. إطفاء الأنوار غرفة التبريد لمنع الصبغة الحيوية خلال الفترة تلطيخ 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
4. إعداد كل من الصبغة غسل التدريجي وخزانات المياه مخدر. صبغ المياه تغسل هي أسماك المياه العادية والمياه مخدر، إضافة الكافي 2-فينوكسييثانول بحيث يتم التوصل إلى التخفيف 1:1،000 في أسماك المياه العادية.
5. وضع الأسماك في المياه الزائدة السمك العادي لشطف الصبغة الحيوية الزائدة وانتقل إلى الخطوة 3.1 لمراقبة صبغ الملون الأسماك الحيوية.
6. لدراسة تجديد neuromasts، ونقل الأسماك المعالجة جنتاميسين التي تم غسلها في الماء السمك العادي إلى حاضنة لمدة تتراوح بين 8-16 ساعة عند 28 درجة مئوية.
7. في أوقات مختلفة بين 8-16 ساعة، يتم إزالة الأسماك من الحاضنة، وغسلها وملطخة كما هو مبين في الخطوات 2،1-2،4. انتقل إلى الخطوة 3.1 لمراقبة صبغ الملون الأسماك الحيوية.

3. الأسماك التخدير والعد نيون من Neuromasts

1. وصمة عار كل سمكة على منشفة ورقية لإزالة السوائل الزائدة ومن ثم وضعه على قطعة مبللة من ورق الترشيح التي تركز على غطاء طبق بتري البلاستيكية.
2. وضع غطاء على مسرح المجهر الفلورسنت ستيريو للحصول على الصور الرقمية من الصبغة neuromasts الملون الحيوية للغرز منتصف الجسم.
3. استخدام كاميرا رقمية توضع على المجهر الفلورسنت ستيريو ضبط التكبير من 2X لالتقاط الصور للتحليل الكمي لاحقة. ملاحظة: الإعداد التكبير للمجهر ستيريو قد تعتمد على نوع من المجهر المستخدمة، ولكن الإعداد ينبغي أن يسمح عرض سهلة والعد من neuromasts فرد داخل غرز منتصف الجسم.
4. تحديد مقدار التجديد عن طريق حساب عدد من neuromasts مرئية داخل غرز أربعة المعينة على الجانب السفلي معظم بطني من الأسماك فقط الأقرب إلى الحق في الزعنفة الصدرية (انظر الشكل 1). لاستخدام التحليل الإحصائي لاختبار ANOVA المناسبة مثل سص T-اختبار الطالب. يجب الاستفادة من التجارب ما لا يقل عن 5 الأسماك في نقطة زمنية وينبغي تكرار كل التجارب الحد الأدنى من 3X.
5. استنادا إلى منحنى الوقت neuromast تجديد (انظر الشكل 3)، عد neuromasts بين 8-16 ساعة آخر جنتاميسين غسل إلى أن تكون ضمن المرحلة خطية من المنحنى التجدد. ملاحظة: استخدام المرحلة الزمن الخطي يسمح للتحليل الكمي السليم بين السيطرة والمجموعات التجريبية.

4. عد نيون من الخلايا الفردية الشعر لقرار الحصول العالي من التحليل الكمي إذا كان التحليل Neuromast ليست ذات دلالة إحصائية

1. إذا كان التحليل الكمي على مستوى neuromasts ليست كبيرة، والتحليل على مستوى الخلية الفردية الشعر يمكن أيضا أن تستخدم للحصول على درجة أعلى من القرار. اختر الأسماك في نقطة زمنية معينة آخر جنتاميسين-تغسل (نقطة زمنية استنادا إلى دراسات neuromast في وقت سابق)، صبغة حيوية شارععين السمكة كما هو موضح في البروتوكول 2، ومن ثم الموت ببطء الأسماك باستخدام 2-فينوكسييثانول في التخفيف 1:500 لمدة 1-5 دقيقة.
2. في ظل هادئا لمنع التبريد، وجعل أربعة شقوق بحيث يتم إعداد ساحة رفرف الجلد على النحو التالي. إجراء شق على طول أضلاعه العلوي من الأسماك حتى يتم محاذاة مع زعانف الشرج، ثم إجراء شق في جميع أنحاء البطن، وأخيرا، وجعل اثنين من الشقوق العمودية على كل جانب من هذه الشقوق حتى يتم إنشاء مربع رفرف الجلد. ملاحظة: هذا الإعداد الجلد دمج غرز جسم منتصف المستخدمة في التجارب neuromast.
3. وضع عينة الجلد على شريحة زجاجية ثم وضع غطاء زجاجي دائري الانزلاق على عينة الجلد رفعه للمساعدة مرساة ولشد الأنسجة للتصوير الرقمي لاحقة.
4. باستخدام عينات الجلد من الخطوة 4.3، الحصول على الصور الرقمية من خلايا الشعر داخل كل neuromast من غرز منتصف الجسم. التقاط صور في التكبير من 60X على الأقل ثم عد م الشعرLLS داخل neuromasts الفردية للتحليل الكمي المقارن من السيطرة والمجموعات التجريبية (انظر الشكل 4).

النتائج

تعظيم الاستفادة من إجراءات لقياس neuromast تجديد الخط الجانبي في الزرد الكبار.

وneuromasts من الزرد اليرقات هي قابلة للقياس بسهولة؛ ومع ذلك، فإن الخط الجانبي من الزرد الكبار لديها عدد أكبر بكثير من neuromasts في غرزة جعل التحليلات ال?...

Discussion

استنادا إلى مجموعة كبيرة من المؤلفات التي أنشئت لتحليل الخط الجانبي (LL) في تجديد الجنينية واليرقات الزرد ^8،24،25، كان الهدف من دراستنا لوضع مقايسة الكمية لتجديد خط الجانبي في الزرد التي يمكن أن يتم تطبيقها على نماذج المرض التي من الأفضل أن تدرس في الأسماك البالغة...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gentamicin sulfate solution (50 mg/ml)	Sigma Aldrich	G1397
2 Phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
4-4-Diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) in methanol	Aldrich	D-3418	485 nm excitation λ and 603 nm emission λ
6-well Plates	Mid Sci	TP92006
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
Glass Bottom Microwell Dishes	Matek Corporation	P35G-1.5-14-C
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting  Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
ImageJ software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.
Confocal microscope	Olympus	FV10i	Any high resolution fluorescent microscope is suitable
Aquatic System	KG Aquatics ZFS Rack System		Any aquatic system can be used