Assay עבור התחדשות קו לרוחב בדג הזברה למבוגר

Summary

מכיוון שרבי דגמי דג הזברה של מחלות נוירולוגיות ושאינן נוירולוגיות נלמדים בדגים הבוגרים ולא את העובר / זחלים, פיתחנו assay כמותיים לרוחב שורת משובי שניתן ליישם מודלים מחלה דג הזברה מבוגרים. Assay מעורב רזולוציה בneuromast 1) ו 2) רמות תא שיער בודד.

Abstract

בשל החשיבות הקלינית של שמיעה והפרעות במאזן באדם, אורגניזמים מודל כגון דג הזברה היו בשימוש ללמוד פיתוח קו לרוחב והתחדשות. דג הזברה היא אטרקטיבי במיוחד עבור מחקרים כאלה, כי הזמן המהיר שלה לפיתוח ויכולת ההתחדשות הגבוהה שלה. עד כה, מחקרי דג הזברה של התחדשות קו לרוחב יש בעיקר מנוצלים דגים של השלבים העובריים וזחל בגלל המספר נמוך יותר של neuromasts בשלבים אלה. זה הפך את ניתוח הכמותי של קו התחדשות / או פיתוח וקל יותר בשלבי ההתפתחות המוקדמים יותר לרוחב. מכיוון שרבי דגמי דג הזברה של מחלות נוירולוגיות ושאינן נוירולוגיות נלמדים בדגים הבוגרים ולא בעובר / הזחלים, אנו מתמקדים בפיתוח assay משובי קו לרוחב כמוני בדג זברה מבוגר, כך שassay היה זמין שיכול להיות מיושם על נוכחית מודלים מחלה דג הזברה מבוגרים. בונה על מחקרים קודמים על ידי ואן מוסטרוםעמ ואח'. ¹⁷ שתוארו נהלים לאבלציה של תאי שיער בדגים בוגרים מקסיקנים עיוורים המערה ודג זברה (Danio rerio), assay שלנו נועד לאפשר השוואת כמותית בין שליטה וקבוצות ניסוי. הדבר זה הושג על ידי פיתוח עקומת סטנדרט neuromast משובי המבוססת על אחוזים מהופעתו neuromast על פני תקופה זמן 24 שעות הבאות נמק המושרה גנטמיצין של תאי שיער באזור מוגדר של קו הרוחב. Assay נועד גם כדי לאפשר הרחבה של הניתוח לרמת התא הבודד שיער כאשר רמה גבוהה יותר של רזולוציה נדרשת.

Introduction

הקו לרוחב המערכת (LL) הוא איבר mechanosensory נמצא בשני דגים ודו חיים, כי הוא אחראי לשמיעה, שיווי משקל, rheotaxis והתנהגויות מתווכות כגון השכלה והימנעות טורף ^1-5. הוא מורכב מהאשכולות של תאי שיער מוקפים בתאים תומכים, אשר שניהם ממוקמים במבנים הנקראים neuromasts ^6. neuromasts אלה מאורגנים בדרך כלל בקווים אנכיים (שנקרא תפרים) לאורך ציר האורך של הגוף והזנב עם כמה תפרים אופקיים נצפו בראש של הדג. במבוגרים, neuromasts הם גדול יותר באופן משמעותי במספר בתוך התפרים, בהשוואה לדגים עובריים או זחל ^6. מחקרים ביו בדג הזברה התמקדו בהשפעה של טיפול אנטיביוטי, טראומה כתוצאה מרעש, זיהום כרוני, וכו '. בתאי שיער ^7,8 בניסיון להבין טוב יותר את ההשפעות שלהם בבני אדם.

שלא כמו רוב בעלי חוליות, teleosts, כגון דג הזברה (Danio rerio), יש את היכולת לחדש את תאי שיער שאבדו. דג הזברה הן שימושי במיוחד משום שזמנם לפיתוח המהיר ויכולת התחדשות גבוהה. עד כה, עם זאת; מחקרי דג הזברה בפיתוח קו לרוחב ו / או התחדשות שבעיקר ניצלו את הדגים בשלב העובריים וזחל בשל המספר המופחת של neuromasts קו לרוחב המאפשר לספירה קלה ^ו6,9,10 ניתוח.

עם זאת, כפי שרבי דגמי דג הזברה של מחלות נוירולוגיות ושאינן נוירולוגיות ^11-16 נלמדים בדגים הבוגרים ולא הזחלים, אנו מתמקדים בפיתוח assay קו לרוחב משובי בדג זברה מבוגר באמצעות גנטמיצין (aminoglycoside השתמש בעבר בזחלי דג הזברה ו משמש יותר לאחרונה עם דגים בוגרים ¹⁷⁾ כך שassay היה זמין שיכול להיות מיושם על מודלים מחלה הנוכחיים למבוגרים דג הזברה. אמנם פורסם בעבר על ידי נהלים ואן טראמפ דוארt אל. ¹⁷ הקימו את התנאים לאבלציה של תאי שיער בדגים הבוגרים, הם לא הקימו עקומת סטנדרט להתחדשות neuromast אשר נדרש להשוואת כמותית בין שליטה וקבוצות ניסוי כגון בעת שימוש בקווי דג הזברה מהונדסים או מצבי מחלה פרמקולוגית-induced בדג הזברה ^18. לפיכך, אנו פעלנו בהתאם להליכים של ואן טראמפ et al. ¹⁷ לאבלציה של תאי שיער, אך בנויים על העבודה שלהם להקים עקומת סטנדרט של התחדשות neuromast כדי לאפשר לחוקרים להשתמש בנתונים שלנו כאשר משווים שליטה וקבוצות ניסוי כגון עם מודלים מחלה דג הזברה מבוגרים . Assay נועד גם כדי לאפשר הרחבה של הניתוח לתא השיער הבודד, כאשר ברמה גבוהה יותר של רזולוציה נדרשת.

Protocol

כל ההליכים מתבצעים בעקבות ההנחיות מתוארות ב" עקרונות של מעבדה טיפול בבעלי חיים "(המכונים הלאומיים לבריאות אין פרסום. 85-23, מתוקן 1985) ופרוטוקול ועדת בעלי החיים מוסדי טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת פרנקלין רוזלינד אושר 08-19.

1. גנטמיצין אינדוקציה של נימק תא שיער

1. הכן סולפט גנטמיצין במלח רגיל בריכוז סופי של 0.004% (4.32 מ"מ).
2. הנח דגים בוגרים (ד rerio, 4-6 חודשים של גיל) במכל המכיל את 0.004% (4.32 מ"מ) פתרון גנטמיצין. ניתן להשתמש בכל מיכל, אבל אנחנו משתמשים במכל דגים ממערכת Aquatic Pharmacal שהיא 7 ברחב, 6 בגבוהים, ו -7 בארוכים. מניחים את המכל עם דגים בחממה נקבעה על C ° 28 ל24 שעות. הגדר את הנפח הכולל של נוזל במכל ברמה מספיק כדי לשמור על דגים במדינה בת קיימא לתקופה hr 24. הערה: אוורור של נוזל גנטמיצין אינו necessary אם נפח מספיק משמש למספר הדגים שטופלו.

2. מכתים חיוני של תאי שיער

1. הכן ריכוז 0.08% (במלח רגיל) של הצבע החיוני הניאון [יודיד 4-4 diethylaminostyryl-)-N-methylpyridinium (λ עירור 485 ננומטר ו603 λ פליטת ננומטר במתנול) מפתרון מניות חוזרת בסך של 15 מ"ג / מיליליטר באתנול.
2. כדי לקבוע אם הטיפול היה יעיל גנטמיצין משנה של שליטה וגנטמיצין דגים טופלו מוכתמים מייד על ידי הצבת דגים בבאר של צלחת תרבות גם 6 המכילה את הצבע החיוני. השתמש במספר מספק של דגים (וצלחות תרבות כפי שנדרש למובהקות סטטיסטיות להיות מושגת. בהתבסס על מהירותו של הבוחן של ספירת neuromast, הנח את הדגים בצלחות באופן מדורג על פני זמן ולכן הדגים שאינם מוכתמים עבור מעל 75 דקות כמתואר בשלב 2.3.
3. מקם את הצלחות מהשלב 2.2 במגירת ספסל על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדילשמש לבחינת neuromasts המוכתמת. כבה את האורות בחדר, כדי למנוע מרווה של הצבע החיוני על פני התקופה מכתים 1 שעות בטמפרטורת חדר.
4. הכן שני לצבוע לשטוף החוצה ומיכלי מים הרדמה. מים לשטוף החוצה דאי הוא מים דגים רגילים ולמי הרדמה, להוסיף 2-phenoxyethanol מספיק כך שדילול 1:1,000 במי דגים רגילים מושגת.
5. הנח דג במי דגים רגילים עודפים לשטוף חיוני לצבוע עודף והמשך לשלב 3.1 לתצפית של דגי צבע מוכתם חיוניים.
6. כדי לבחון התחדשות של neuromasts, להעביר דגים שטופלו גנטמיצין שנשטפו במי דגים רגילים לחממה לבין 8-16 שעות ב28 ° C.
7. בזמנים שונים בין 8-16 שעה, דגים יוסרו מן החממה, שטפו ומוכתם, כמצוין בצעדים 2.1-2.4. המשך לשלב 3.1 לתצפית של דגי צבע מוכתם חיוניים.

3. הרדמת דגים וספירה של פלורסנט Neuromasts

1. תמחה כל דגים על מגבת נייר כדי להסיר את הנוזלים עודפים ולאחר מכן הנח אותו על פיסת נייר סינון לחה כי הוא מרוכז על המכסה של צלחת פטרי פלסטיק.
2. מניחים את המכסה על הבמה של מיקרוסקופ סטריאו ניאון כדי לקבל תמונה דיגיטלית של neuromasts המוכתם הצבע החיוני של התפרים גוף הבינוניים.
3. שימוש במצלמה דיגיטלית מונחת על מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו להגדיר הגדלה של 2X ללכוד תמונות לניתוח כמותי שלאחר מכן. הערה: הגדרת ההגדלה של מיקרוסקופ סטריאו יכולה להיות תלויה במותג של מיקרוסקופ המשמש, אבל ההגדרה צריכה לאפשר צפייה נוחה וספירה של neuromasts הבודד בתוך התפרים הגוף בינוני.
4. לקבוע את הסכום של התחדשות על ידי ספירת מספר neuromasts הגלוי בתוך ארבעה התפרים מיועדים בצד התחתון ביותר הגחון של הדג רק הפרוקסימלי לסנפיר החזה הימני (ראה תרשים 1). לניתוח סטטיסטי להשתמש בדיקה מתאימה כגון o אנובהr T-הבדיקה של הסטודנט. ניסויים צריכים לנצל מינימום של 5 דגים לכל נקודת זמן ויש לחזור על כל הניסויים מינימליים של פי 3.
5. בהתבסס על עקומת זמן התחדשות neuromast (ראה איור 3), לספור neuromasts בין 8-16 ההודעה hr גנטמיצין לשטוף החוצה כדי להיות במסגרת השלב ליניארי של עקומת ההתחדשות. שים לב: השימוש בשלב הזמן ליניארי מאפשר ניתוח כמוני ראוי בין השליטה וקבוצות ניסוי.

4. ספירת פלורסנט של תאים בודדים שיער לקבלת רזולוציה גבוהה יותר של ניתוח כמותי אם ניתוח Neuromast אינו מובהק סטטיסטי

1. אם הניתוח כמוני ברמה של neuromasts אינו משמעותי, ניתוח ברמה של תא שיער האדם יכול גם להיות מנוצל כדי להשיג רמה גבוהה יותר של רזולוציה. בחרו דגים בהודעה גנטמיצין נקודת זמן מסוים, צבע חיוני לשטוף החוצה (נקודת זמן המבוסס על מחקרי neuromast קודם לכן) stעין הדג כפי שמתואר בפרוטוקול 2, ולאחר מכן להרדים את הדגים באמצעות 2-phenoxyethanol בדילול 1:500 ל1-5 דקות.
2. באור עמום כדי למנוע מרווה, לעשות ארבעה חתכים כך שהכנת דש עור מרובעת מורכבת כדלקמן. עושה חתך לאורך הצלעות העליונות של הדג עד שהוא מיושר עם הסנפירים אנאליים, ואז עושה חתך לרוחב הבטן, ובסופו, לעשות שני חתכים אנכיים בכל צד של החתכים האלה כל כך את יריעת העור המרובע שנוצרה. הערה: הכנת עור זה תהיה לשלב את התפרים גוף האמצע משמשים בניסויים neuromast.
3. הנח את דגימת העור בשקופית זכוכית ולאחר מכן במקום להחליק כיסוי זכוכית עגול מעל הדגימה העור נכרת כדי לעזור עוגן ולשטח את הרקמה להדמיה דיגיטלית שלאחר מכן.
4. שימוש בדגימות העור משלב 4.3, להשיג תמונות דיגיטליות של תאי השיער בתוך כל neuromast של התפרים גוף הבינוניים. קח את התמונות בהגדלה של לפחות 60x ולאחר מכן לספור את הספירה השיערLLS בתוך neuromasts פרט לניתוח כמוני השוואתי של השליטה וקבוצות ניסוי (ראה איור 4).

תוצאות

אופטימיזציה של התהליכים לכימות התחדשות neuromast של קו הרוחב בדג זברה מבוגר.

Neuromasts של דג הזברה זחל הוא לכימות; לעומת זאת, בקו הרוחב של דג הזברה המבוגר יש מספר גדול הרבה יותר של neuromasts לתפר ביצוע ניתוחים כמותיים קשים ^6,17,19,20

Discussion

בהתבסס על ההיקף הנרחב של ספרות שכבר נקבעה לניתוח של קו לרוחב התחדשות (LL) בדג זברה עוברית וזחל ^8,24,25, מטרת המחקר שלנו הייתה לפתח assay כמותיים להתחדשות קו לרוחב בדג זברה שיכל להיות מיושם על מודלים מחלה, כי הם למדו הטובים ביותר בדגים הבוגרים. מצאנו כי נקודות קריטיות מס?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gentamicin sulfate solution (50 mg/ml)	Sigma Aldrich	G1397
2 Phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
4-4-Diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) in methanol	Aldrich	D-3418	485 nm excitation λ and 603 nm emission λ
6-well Plates	Mid Sci	TP92006
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
Glass Bottom Microwell Dishes	Matek Corporation	P35G-1.5-14-C
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting  Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
ImageJ software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.
Confocal microscope	Olympus	FV10i	Any high resolution fluorescent microscope is suitable
Aquatic System	KG Aquatics ZFS Rack System		Any aquatic system can be used