Анализ на боковой линии регенерации в взрослых данио рерио

Резюме

Потому что многие данио модели неврологических и не неврологических заболеваний изучаются в взрослых рыб, а не у эмбриона / личинок, мы разработали количественный боковой линии регенеративной анализа, который можно применять взрослым моделей данио заболеваний. Анализ участие разрешение на 1) neuromast и 2) уровнях индивидуальный волосковых клеток.

Аннотация

В связи с клинической значимости слуха и нарушения баланса в человеке, модельные организмы, такие как данио были использованы для изучения развития боковой линии и регенерацию. Данио является особенно привлекательным для таких исследований из-за его быстрого времени разработки и высокой регенеративной способностью. На сегодняшний день, данио исследования боковой рекуперации в основном используется рыба из эмбриональных и личиночной стадии из-за меньшего числа невромастов на этих этапах. Это сделало количественный анализ боковой линии регенерации / и или развития легче в более ранних стадиях развития. Потому что многие данио модели неврологических и не неврологических заболеваний изучаются в взрослых рыб, а не в эмбриона / личинок, мы сосредоточены на разработке количественную боковой линии регенеративной анализа в взрослых данио, чтобы анализ был доступен, которые могут быть применены к току взрослые данио модели заболевания. Основываясь на предыдущих исследованиях Ван Trumр и др.. ^17, описанной процедуры абляции волосковых клеток во взрослой мексиканской слепой пещерной рыбы и рыбок данио (Danio рерио), наш анализ был разработан, чтобы позволить количественное сравнение между контрольной и экспериментальной групп. Это было достигнуто путем разработки регенеративную neuromast стандартную кривую на основе процента neuromast повторному течение периода с 24 часами времени после некроз гентамицина-индуцированной волосковых клеток в определенной области боковой линии. Анализ также была разработана, чтобы позволить расширение анализа на индивидуальном уровне волосковых клеток, когда более высокий уровень разрешения не требуется.

Введение

Боковая линия (LL) система является механосенсорных орган нашел в обоих рыб и амфибий, который отвечает за слуха, равновесия, rheotaxis и посреднических поведения, таких как школы и избежании хищника ^1-5. Он состоит из кластеров волосковых клеток, окруженных поддерживающих клеток, оба из которых расположены в структурах, называемых невромасты ^6. Эти невромасты обычно организованы в вертикальных линий (так называемый стежки) вдоль продольной оси тела и хвоста с некоторыми горизонтальными стежками, наблюдаемых в голове рыбы. У взрослых, невромасты значительно больше, в количестве в пределах стежками по сравнению с эмбриональной или личинок рыб ^6. Биомедицинские исследования на рыбках данио уделено влиянию лечения антибиотиками, вызванного шумом травмы, хронической инфекции и др. на волосковых клеток ^7,8 в попытке лучше понять их воздействие на человека.

В отличие от большинства позвоночных, т. е.leosts, такие как данио (Danio рерио), имеют способность к регенерации утраченных волосковых клеток. Данио рерио особенно полезны из-за их быстрого времени разработки и высокой регенеративной способностью. Однако на сегодняшний день; данио исследования по разработке боковой линии и / или регенерации в основном использовали эмбриональных и личиночной стадии рыбы в связи с уменьшением числа боковых невромастами линии что облегчает подсчета и анализа ^6,9,10.

Однако, как многие данио модели неврологических и не неврологических заболеваний ^11-16 изучаются в взрослых рыб, а не личинок, мы сосредоточились на разработке боковой линии регенеративной анализа у взрослых данио, используя гентамицин (аминогликозиды ранее использовались в данио личинок и в последнее время используются с взрослых рыб ^17), так что анализ был доступен, которые могут быть применены к текущей взрослых данио моделей заболеваний. В то время как ранее опубликована процедуры Ван Трамп ет др.. ¹⁷ создало условия для волосковых клеток абляции в взрослых рыб, они не установить стандартную кривую для neuromast регенерации, который требуется для количественного сравнения между контрольной и экспериментальной групп, таких как при использовании трансгенных линий данио или фармакологически индуцированные болезненных состояний у рыбок данио ^18. Поэтому мы последовали процедуры Ван Трамп и др. ^17. Для волосковых клеток абляции, но построен на их работу в целях создания стандартного кривую neuromast регенерации, позволяющих исследователям использовать наш данных при сравнении контрольных и экспериментальных групп, таких, как со взрослыми моделями данио болезни . Анализ также была разработана, чтобы позволить расширение анализа в отдельной ячейке волос, когда более высокий уровень разрешения не требуется.

протокол

Все процедуры проводятся в соответствии с руководящими принципами, описанными в «Принципах лабораторных животных" (Национальные институты здравоохранения Ежегодный нет. 85-23, пересмотренная 1985) и утвержденного протокола животных Розалинд Франклин университет Комитет Уходу за животными и использование 08-19.

1. Гентамицин-индукция волосковых клеток некроза

1. Подготовка сульфата гентамицина в нормальном солевом растворе до конечной концентрации 0,004% (4,32 мм).
2. Наведите взрослых рыб (Д. рерио, 4-6 месячного возраста) в контейнере, содержащем 0,004% (4,32 мм) гентамицин решение. Любой контейнер может быть использован, но мы используем рыбы контейнера из Pharmacal водной системы, которая 7 в ширину, 6 в высокой, и 7 в длину. Поместите контейнер с рыбой в инкубатор при 28 ° С в течение 24 часов. Установить общий объем жидкости в резервуаре на достаточном уровне, чтобы для ч период 24 поддерживать рыбу в жизнеспособном состоянии. Примечание: Аэрация гентамицин жидкости не neceмируется необходимый если достаточный объем используется для количества рыбы, подлежащего лечению.

2. Vital Окрашивание клеток волос

1. Подготовка концентрацию 0,08% (в нормальном физиологическом растворе) флуоресцентного витальным красителем [4-4-diethylaminostyryl)-N-метилпиридини (485 нм λ возбуждения 603 нм и λ эмиссии в метаноле) из рабочей исходного раствора 15 мг / мл в этаноле.
2. Чтобы определить, гентамицину лечение было эффективным подмножество контроля и гентамицин обработанные рыбы окрашивают сразу же, поместив рыбу в лунку 6-луночного планшета культуры, содержащей витальным красителем. Используйте достаточное количество рыбы (и культуру, живущую в соответствии с требованиями для статистической значимости должны быть достигнуты. Основываясь на скорости экзаменатора из neuromast подсчета, поместите рыбу в пластинах в шахматном порядке в течение долгого времени так, чтобы рыба не окрашивают в течение более 75 мин как описано на стадии 2.3.
3. Место пластин с шага 2.2 в скамейке ящик флуоресцентным микроскопом вбыть использованы для изучения окрашенных невромастами. Выключите свет в комнате, чтобы предотвратить тушение жизненной красителя на 1 час окрашивания период при комнатной температуре.
4. Подготовить как краситель вымывания и обезболивающий емкостей для воды. Краска вымывания водой нормально рыбы вода и для анестезии воды, добавьте достаточное 2-феноксиэтанол, чтобы разведение 1:1000 в нормальном рыбы воды достигается.
5. Поместите рыбу в избытке нормальной рыбы воды, чтобы ополоснуть избыток жизненно красителя и перейдите к шагу 3.1 для наблюдения рыб жизненно красителя окрашивают.
6. Чтобы исследовать регенерацию невромастами, передача гентамицина обработке рыбы, которые были промыты в нормальном рыбы воды в инкубаторе для между 8-16 ч при 28 ° С.
7. В разное время между 8-16 ч, рыба вынимали из инкубатора, промывали и окрашивали, как указано в пунктах 2.1-2.4. Перейдите к шагу 3.1 для наблюдения рыб жизненно красителя окрашивают.

3. Обезболивающий Рыба и флуоресцентная Подсчет невромастов

1. Пятно каждую рыбу на бумажное полотенце, чтобы удалить лишнюю жидкость, а затем поместить его на влажную кусочек фильтровальной бумаги, в центре которого на крышке пластиковой чашке Петри.
2. Поместите крышку на сцене флуоресцентной стерео микроскоп для получения цифрового изображения жизненно важных красителей окрашенных невромастов середине стежков тела.
3. С помощью цифровой камеры размещен на флуоресцентного стереомикроскопа установить увеличении 2X для захвата изображения для последующего количественного анализа. Примечание: Установка увеличение из стереомикроскопом может зависеть от марки микроскопа, используемого, но обстановка должна позволить легко просматривать и подсчета отдельных невромастами в середине стежков тела.
4. Определить количество регенерации путем подсчета количества видимых невромастами в четырех обозначенных швов на нижнем наиболее вентральной стороне рыбы просто проксимального в нужное грудного плавника (см. рисунок 1). Для статистического анализа использовать соответствующую проверку таких как ANOVA Oг Т-критерий Стьюдента. Эксперименты следует использовать, как минимум, 5 особей на момент времени, и все эксперименты должны быть повторены, как минимум, в 3 раза.
5. Исходя из кривой времени регенерации neuromast (см. рисунок 3), рассчитывать невромасты между 8-16 ч после гентамицин вымывания быть в пределах линейного фазы кривой регенерации. Примечание: Использование линейной фазы времени позволяет для правильного количественного анализа между контрольной и экспериментальной групп.

4. Люминесцентная Подсчет клеток отдельного волоса для получения высшего Постановление количественного анализа, если Neuromast Анализ не является статистически значимым

1. Если количественный анализ на уровне невромастов не является существенным, анализ на уровне отдельной клетки волос также может быть использован, чтобы получить более высокую степень разрешения. Выберите рыбу в определенной временной точке сообщению гентамицин вымывания (момент времени на основе предыдущих исследований neuromast), жизненно красителя-гоайн рыбу, как описано в Протоколе 2, а затем усыпить рыбу, используя 2-феноксиэтанол в разведении 1:500 для 1-5 минут.
2. В приглушенном свете, чтобы предотвратить тушение, сделать четыре разрезы так, что квадратный подготовка лоскут кожи производится следующим образом. Сделайте надрез вдоль верхних ребер рыбы пока не приведен в соответствие с анального плавников, а затем сделать надрез через живот, и наконец, сделать две вертикальные разрезы на каждой стороне этих разрезов так квадрат кожный лоскут создается. Примечание: Этот препарат кожа будет включать средние стежки тела, используемые в neuromast экспериментов.
3. Поместите образец кожи на предметное стекло, а затем поместить круглую покровным стеклом над подакцизным образца кожи, чтобы помочь с якоря и сгладить ткани для последующей цифровой обработки изображений.
4. Используя образцы кожи от шаге 4.3, получить цифровые изображения волосковых клеток внутри каждого neuromast середины стежков тела. Съемку при увеличении крайней мере 60X, а затем подсчитывают волос CELLS пределах отдельных невромастами для сравнительного количественного анализа контрольных и экспериментальных групп (см. рисунок 4).

Результаты

Оптимизация процедур количественного neuromast регенерацию боковой линии в взрослых данио.

Невромасты из личинок рыбок данио легко поддаются количественной оценке; Однако, боковая линия из взрослых данио имеет гораздо большее число невромастами в стежка делает к...

Обсуждение

На основе обширного объема литературы, которая была создана для анализа боковой линии (LL) регенерации в эмбриональном и личинок рыбок данио ^8,24,25, цель нашего исследования состояла в разработке количественного анализа для боковой рекуперации у рыбок данио, которые могли бы быть п?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gentamicin sulfate solution (50 mg/ml)	Sigma Aldrich	G1397
2 Phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
4-4-Diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) in methanol	Aldrich	D-3418	485 nm excitation λ and 603 nm emission λ
6-well Plates	Mid Sci	TP92006
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
Glass Bottom Microwell Dishes	Matek Corporation	P35G-1.5-14-C
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting  Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
ImageJ software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.
Confocal microscope	Olympus	FV10i	Any high resolution fluorescent microscope is suitable
Aquatic System	KG Aquatics ZFS Rack System		Any aquatic system can be used