성인 Zebrafish의의 측면 라인 재생을위한 분석

요약

신경 및 비 신경 질환의 많은 지브라 피쉬의 모델 성어보다는 배아 / 유생으로 연구되어 있기 때문에, 우리는 성인 zebrafish의 질병 모델에 적용 할 수있는 양적 측면 라인 회생 분석법을 개발 하였다. 분석은 1) neuromast 2) 개별 머리 세포 수준의 해상도를하고있었습니다.

초록

때문에 사람의 청각과 균형 장애의 임상 적 중요성에, 같은 제브라 피쉬와 같은 모델 생물은 옆 선 개발과 재생을 연구하는 데 사용되었습니다. 제브라 피쉬는 그것의 빠른 개발 시간과 높은 재생 능력의 이러한 연구에 특히 매력적이다. 지금까지, 옆 선 중생의 제브라 피쉬의 연구는 주로하기 때문에이 단계에서 neuromasts의 낮은 숫자의 배아와 유생 단계의 물고기를 활용했다. 이 측선 재생 /과 또는 이전 개발 단계에서보다 쉽게​​ 개발의 정량 분석​​을했다. 신경과 비 신경 질환의 많은 제브라 피쉬 모델은 어른 물고기가 아닌 배아 / 유충에서 공부하고 있기 때문에 분석이 가능했던, 그래서 우리는 현재에 적용 할 수있는 성인 제브라 피쉬의 양적 측면 라인 회생 분석 개발에 집중 성인 zebrafish의 질병 모델. 반 TRUM에 의해 이전의 연구에 구축P 등. ¹⁷ 성인 멕시코 장님 동굴 물고기와 제브라 피쉬 (다니오 rerio)에있는 유모 세포의 제거를위한 절차를 기술 한, 우리의 분석은 제어 및 실험 그룹 사이의 정량적 인 비교를 할 수 있도록 설계되었습니다. 이것은 측선의 규정 된 영역에 모발 세포의 겐타 마이신 유도 된 괴사를 다음 24 시간 기간 동안 neuromast 재현의 퍼센트에 근거 회생 neuromast 표준 곡선을 개발함으로써 달성되었다. 분석은 또한 해상도의 높은 수준이 요구되는 개별 모발 세포 레벨의 분석을 확장 할 수 있도록 설계되었다.

서문

옆 선 (LL) 시스템은 청각, 균형, rheotaxis하고 학교와 포식자 회피 ^1-5으로 중재 행동에 대한 책임이 모두 물고기와 양서류에서 발견 mechanosensory 기관이다. 이는지지 세포에 의해 둘러싸여 유모 세포의 클러스터로 구성되며, 둘 모두는 neuromasts ⁶ 불리는 구조에 배치된다. 이 neuromasts는 일반적으로 물고기의 머리에서 관찰 된 일부 수평 바늘 몸과 꼬리의 길이 방향 축을 따라 (바늘라고 함)의 수직 라인으로 구성되어 있습니다. 성인에서 neuromasts는 배아 또는 애벌레 물고기 ^6에 비해 바늘 내 번호 상당히 크다. 제브라 피쉬의 생물 의학 연구는 항생제 치료, 소음에 의한 외상, 만성 감염 등의 효과에 초점을 맞추고있다. 유모 세포에 시도에서 ^7,8 더 ^나은 인간에 미치는 영향을 이해합니다.

대부분의 척추 동물과는 달리, 테이러한 제브라 피쉬 (다니오 rerio) 등 leosts는 손실 유모 세포를 재생하는 기능이 있습니다. 제브라 피쉬 때문에 자신의 빠른 개발 시간과 높은 재생 능력으로 특히 유용하다. 그러나 현재; 옆 선 개발 및 / 또는 재생에 제브라 피쉬의 연구는 주로 쉽게 계산 및 분석 ^6,9,10 수 있습니다 옆 선 neuromasts의 감소 번호로 배아 및 애벌레 단계의 물고기를 활용했다.

그러나, 신경과 비 신경 질환 ^11-16의 많은 제브라 피쉬 모델은 어른 물고기가 아닌 유충에서 공부, 우리는 겐타 마이신을 사용하여 성인 제브라 피쉬의 옆 선 회생 분석 (이전에 zebrafish의 유충에 사용되는 아미노 글리코 사이드 개발에 초점을 맞추고 분석이 가능했던 있도록 최근에) 성인 물고기 ^(17)에 사용되는 현재의 성인 zebrafish의 질병 모델에 적용 할 수 있습니다. 이전에 반 트럼프 전자에 의해 절차를 발표하면서t AL. ¹⁷ 성어 헤어 셀 절제를위한 조건을 확립, 그들은 제어와 같은 형질 전환 지브라 피쉬 라인 또는 약리학 적으로 유도 된 질병 상태를 사용할 때와 같은 실험 그룹 간의 정량적 비교를 위해 필요한 neuromast 재생을위한 표준 곡선을 확립하지 않았다 제브라 피쉬 ^18. 따라서 우리는 제어 및 실험 그룹을 비교할 때 같은 성인 zebrafish의 질병 모델과 마찬가지로 우리의 데이터를 사용할 수 수사관을 가능하게 neuromast 재생의 표준 곡선을 설정하는 머리 세포 제거에 대한 반 트럼프 등. ^17의 절차를 따랐지만 자신의 작품에 구축 . 분석은 또한 해상도가 높은 레벨이 요구 될 때 개별 머리카락 세포로 분석의 확장을 허용하도록 설계되었다.

프로토콜

모든 절차는 "실험 동물 관리의 원칙"에 설명 된 지침에 따라 수행된다 (건강 간행물의 국립 연구소 없음. 85-23, 1985 년 개정) 및 승인 로잘린 프랭클린 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 동물 프로토콜은 08-19.

머리 세포 괴사의 1. 겐타 마이신 유도

1. 0.004 %의 최종 농도 (4.32 ㎜)에 생리 식염수에 황산 젠타 마이신을 준비한다.
2. 0.004 % (4.32 ㎜) 겐타 마이신 용액이 들어있는 용기에 어른 물고기 (D. rerio, 연령 4 ~ 6 개월) 놓습니다. 모든 컨테이너를 사용할 수 있습니다,하지만 우리는 폭 7, 고 6, 긴 7 인 Pharmacal 물 시스템에서 물고기 컨테이너를 사용합니다. 24 시간 동안 28 ° C에서 설정 인큐베이터에서 물고기와 컨테이너를 배치합니다. 24 시간 동안 실행 가능한 상태로 물고기를 유지하기에 충분한 수준으로 탱크 내의 유체의 총 체적을 설정한다. 참고 : 겐타 마이신 유체의 통기가 nece하지 않습니다ssary 충분한 볼륨이 치료되는 어류의 번호를 사용하는 경우.

머리 세포의 2. 생명 염색

1. 15 ㎎ / ㎖ 작업 스톡 용액으로부터 형광 중요한 염료 [4-4 - 디 에틸 아미노)-N-메틸 피리 디늄 요오다 이드 (485 nm의 여기 λ 및 메탄올 603 nm의 발광 λ)의 (정상 식염수) 0.08 % 농도를 준비 에탄올.
2. 젠타 마이신 치료가 치료 물고기가 중요한 염료를 포함하는 6 웰 배양 플레이트의 우물에서 물고기를 배치하여 즉시 얼룩 져 제어 및 겐타 마이신의 일부 효과가 있는지 확인하십시오. 그 물고기는 75 분 동안 염색되지 않도록 통계적 유의성이 달성 될 때까지 필요에 따라 충분한 물고기의 수 (및 배양 플레이트를 사용합니다. neuromast 계산의 심사관의 속도에 따라, 시간이 지남에 따라 지그재그 방식으로 접시에 물고기를 배치 단계 2.3에 기재된대로.
3. 형광 현미경에 의해 벤치 서랍 단계 2.2에서 접시를 놓습니다스테인드 neuromasts의 검사에 사용. 실온에서 1 시간 염색에 걸쳐 중요한 염료의 냉각을 방지하기 위해 실내 조명을 끄십시오.
4. 염료 세척 아웃 마취 물 탱크를 모두 준비합니다. 염료 씻어 ​​아웃 물은 일반 물 물고기이며, 보통 물고기 물에 1:1,000 희석이 달성되도록 마취 물, 충분한 2 - 페녹시 에탄올을 추가합니다.
5. 초과 중요한 염료를 씻어 중요한 염료 염색 물고기의 관찰 3.1 단계로 진행하기 위해 여분의 일반적인 물고기 물에서 물고기를 놓습니다.
6. 28 ℃에서 8-16 사이의 시간 동안 인큐베이터에 일반 물고기 물에 세척 겐타 마이신 처리 된 생선을 전송, neuromasts의 재생을 검사하려면
7. 8-16 시간 사이에 여러 번, 물고기, 인큐베이터에서 제거 세척 단계 2.1-2.4에 표시된 스테인드됩니다. 중요한 염료 염색 물고기의 관찰 3.1 단계로 진행합니다.

3. 마취 생선 Neuromasts의 형광 계수

1. 과량의 유체를 제거하고 플라스틱 페트리 접시 뚜껑의 중앙에 여과지 적신 장에 배치하는 종이 타월에 각각 물고기 럽히.
2. 중앙 신체 바늘의 중요한 염료 염색 neuromasts의 디지털 이미지를 얻기 위해 형광 실체 현미경의 무대에 뚜껑을 놓습니다.
3. 사용하는 형광 실체 현미경에 배치 된 디지털 카메라는 이후의 정량 분석​​을위한 이미지를 캡처하는 배의 배율을 설정합니다. 실체 현미경의 배율 설정이 사용되는 현미경의 브랜드에 따라 달라질 수 있지만, 설정은 중앙 신체 바늘에서 쉽게 볼 수 있도록 개별 neuromasts의 계산을 허용해야합니다.
4. (그림 1 참조) 오른쪽 가슴 지느러미에 바로 인접 물고기의 가장 아래 복부 측면에있는 4 개의 지정 바늘에서 볼 수 neuromasts의 수를 계산하여 재생의 양을 결정합니다. 통계 분석을 위해 같은 ANOVA 오 같은 적절한 테스트를 사용연구 학생의 T-테스트. 실험 시점 당 5 물고기의 최소값을 활용해야하고 모든 실험은 3 배의 최소 반복되어야한다.
5. neuromast 재생 시간 곡선을 바탕으로 (그림 3 참조), 재생 곡선의 선형 위상 내에 8-16 시간 포스트 겐타 마이신 씻어 아웃 사이 neuromasts을 계산합니다. 참고 : 선형 시간 단계의 사용은 제어 및 실험 그룹간에 적절한 정량 분석​​을 할 수 있습니다.

Neuromast 분석은 통계적으로 유의하지 않은 경우 정량 분석​​의 높은 해상도를 얻기 위해 개별 모발 세포의 4. 형광 계수

1. neuromasts의 레벨에서 정량적 분석이 중요하지 않은 경우에, 개별 모발 세포 수준에서의 분석은 또한 해상도가 높은 수준을 얻기 위해 이용 될 수있다. 특정 시점 포스트 겐타 마이신 씻어 아웃 (시점을 이전 neuromast 연구 기준), 생명 색소 성에서 물고기를 선택이 프로토콜에 설명 된 물고기를 아인 후 1-5 분 동안 1:500 희석액에 2 - 페녹시 에탄올을 사용하여 물고기를 안락사.
2. 다음과 같이 사각형 피변 준비가 이루어 지도록 담금질 않도록 부드러운 조명에서, 네 개의 절개를 만든다. 이 뒷 지느러미와 정렬 될 때까지 물고기의 상부 늑골을 따라 절개를 한 후 배에서 절개를하고, 마지막으로, 그래서 광장 피부 플랩이 만들어 이러한 절개의 양쪽에있는 두 개의 수직 절개를합니다. 참고 :이 피부 준비 neuromast 실험에 사용 된 중간 바디 스티치를 통합 할 것입니다.
3. 유리 슬라이드에 피부 표본을 놓고 다음 앵커를하는 데 도움이 이후의 디지털 이미징을위한 조직을 평평하게 절제 피부 표본을 통해 원형 유리 커버 슬립을 배치합니다.
4. 단계 8.6에서 피부 표본을 사용하여, 중간 품 스티치 각각 neuromast 내의 유모 세포의 디지털 이미지를 얻는다. 적어도 60 배의 배율로 이미지를 가져온 후 머리 CE를 계산제어 및 실험 그룹의 비교 정량 분석에 대한 개별 neuromasts 내 LLS (그림 4 참조).

결과

성인 제브라 피쉬의 측면 라인의 neuromast 재생을 정량화하기위한 절차의 최적화.

애벌레 제브라 피쉬의 neuromasts 쉽게 가늠할 수있다; 그러나, 성인 제브라 피쉬의 측면 라인은 ^6,17,19,20 정량적 분석을 더욱 어렵게 만드는 스티치 당 neuromasts 훨씬 더 많은 수 있습니다. 도 1a에 도시 된 바와 같이, 헤드는 중앙부 또는 꼬리 하나에 비해 neuromasts의 ...

토론

배아와 애벌레 zebrafish의 ^8,24,25의 옆 선 (LL) 중생의 분석을 위해 설립 된 문학의 광대 한 몸을 바탕으로, 우리의 연구의 목표는 제브라 피쉬의 옆 선 재생을위한 정량적 분석을 개발하는 것이라고 할 수 최고의 성인 물고기에서 공부하는 질병 모델에 적용 할 수. 우리는 성인 물고기 배아 / 애벌레 물고기를 위해 개발 절차를 적용 할 때 특정 중요한 포인트가 중요하다는 것을 발견했다. 이?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gentamicin sulfate solution (50 mg/ml)	Sigma Aldrich	G1397
2 Phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
4-4-Diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) in methanol	Aldrich	D-3418	485 nm excitation λ and 603 nm emission λ
6-well Plates	Mid Sci	TP92006
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
Glass Bottom Microwell Dishes	Matek Corporation	P35G-1.5-14-C
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting  Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
ImageJ software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.
Confocal microscope	Olympus	FV10i	Any high resolution fluorescent microscope is suitable
Aquatic System	KG Aquatics ZFS Rack System		Any aquatic system can be used