Yetişkin Zebra balığı Lateral Hat Rejenerasyon için bir Deneyi

Özet

Nörolojik ve non-nörolojik hastalıkların çok zebra balığı model yetişkin balık ziyade embriyo / larva incelenir için, erişkin zebrabalıkları hastalık modellerinde uygulanabilen bir nicel yan hat rejeneratif deneyi geliştirilmiştir. Deney 1) neuromast ve 2) tek tek saç hücre düzeyde çözünürlüğü dahil.

Özet

Nedeniyle insanda işitme ve denge bozuklukları, klinik önemi, bu tür Zebra balığı gibi model organizmalar yanal hat geliştirme ve rejenerasyon çalışması için kullanılmıştır. Zebra balığı nedeniyle hızlı gelişimi zaman ve yüksek rejeneratif kapasitesinin bu tür çalışmalar için özellikle çekici. Bugüne kadar, yanal çizgi rejenerasyon Zebrafish çalışmalar esas olarak, çünkü bu aşamada neuromasts alt sayısının embriyonik ve larva evrelerinin balık kullanmıştır. Bu yanal çizgi rejenerasyon ve / veya daha önceki gelişim evrelerinde daha kolay gelişme kantitatif analizini yapmıştır. Nörolojik ve non-nörolojik hastalıkların çok zebra balığı model yetişkin balık olup embriyo / larva incelenir için bir deney kullanılabilir, böylece o akım tatbik edilebilir, yetişkin Zebrafish kantitatif bir yan hat rejeneratif tahlili geliştirilmesi üzerine odaklanmıştır yetişkin zebrabalıkları hastalık modelleri. Van TRUM tarafından daha önceki çalışmaları üzerine inşap vd. ^17. yetişkin Meksika kör mağara balık ve Zebra balığı (Br.rerio) saç hücrelerinin ablasyonu için prosedürleri tarif, bizim tahlil deney ve kontrol grupları arasında nicel bir karşılaştırmasını sağlamak üzere tasarlanmıştır. Bu yanal doğrultusunda belirli bir bölgede saç hücrelerinin gentamisin kaynaklı nekroz izlenerek ve 24 saatlik bir zaman periyodu boyunca neuromast yeniden ortaya çıkma yüzdesi göre bir rejeneratif neuromast standart eğri geliştirerek gerçekleştirildi. Tahlil, aynı zamanda çözünürlüğü daha yüksek bir düzeyde gerekli olan tek tek saç hücre seviyesine analiz uzantısı izin verecek şekilde tasarlanmıştır.

Giriş

Yanal çizgi (LL) sistemi işitme, denge, rheotaxis ve bu tür eğitim ve yırtıcı kaçınma ^1-5 olarak aracılık davranışları sorumludur hem de balık ve amfibiler bulunan bir mechanosensory organdır. Bu destek hücreleri ile çevrili saç hücre kümeleri oluşur, her ikisi de neuromasts ^6'ya yapılar konumlandırılmıştır. Bu neuromasts tipik olarak balık baş görülen yatay bir dikiş ile gövde ve kuyruk uzunlamasına ekseni boyunca (dikişler adlandırılır) dik çizgiler halinde düzenlenir. Yetişkinde, neuromasts embriyonik ya da larva balık ⁶ ile karşılaştırıldığında, dikiş içinde sayısında önemli ölçüde daha fazladır. Zebrafish Biyomedikal çalışmalar antibiyotik tedavisi, gürültü kaynaklı travma, kronik enfeksiyon, vb etkisi üzerinde odaklanmıştır. saç hücrelerinin çabasıyla ^7,8 daha iyi insanlarda etkilerini anlamak için.

Pek çok omurgalılarda aksine, teBöyle Zebra balığı (Br.rerio) gibi leosts, kayıp saç hücrelerinin yenilenmesine yeteneği var. Zebrafish nedeniyle hızlı bir gelişme süresi ve yüksek rejeneratif kapasitesinin özellikle yararlıdır. Ancak bugüne kadar; yanal hat geliştirme ve / veya rejenerasyon Zebrafish çalışmalar kaynaklanmaktadır kolay sayma ve analiz ^6,9,10 sağlayan yanal çizgi neuromasts azaltılmış sayısına embriyonik ve larva balık kullanmıştır.

Ancak, nörolojik ve non-nörolojik hastalıklar ^11-16 gibi birçok zebrabalıkları modelleri yetişkin balık değil larva incelenir, biz gentamisini kullanılarak yetişkin zebrabalıkları bir yanal çizgi rejeneratif tahlili (önce Zebra balığı larvaları kullanılan bir aminoglikozid geliştirilmesi üzerinde duruldu ve bir deney kullanılabilir, böylece daha yakın) yetişkin balık ^17, kullanılan mevcut yetişkin zebrabalıkları hastalık modellerinde de uygulanabilir. Daha önce Van Trump e prosedürleri yayınlandığı süret al. ¹⁷ yetişkin balıklarda saç hücre ablasyonu için kurulmuş koşullar, bu kontrol ve bu transgenik çizgiler zebra balığı veya farmakolojik-kaynaklı hastalık durumlarını kullanırken olduğu gibi Deney grupları arasında Kantitatif karşılaştırma için gereklidir neuromast rejenerasyon için bir standart eğri oluşturmak yoktu Zebra balığı ^18. Bu nedenle kontrol ve deney grupları karşılaştırırken böyle yetişkin zebrabalıkları hastalık modellerinde olduğu gibi bizim verilerini kullanmak müfettişleri sağlamak için neuromast rejenerasyon standart bir eğri oluşturmak için saç hücre ablasyon için Van Trump ve ark. ¹⁷ prosedürleri takip etti, ama onların çalışmaları üzerine inşa . Tahlil, aynı zamanda çözünürlüğü daha yüksek bir düzeyde gerekli olduğunda tek tek saç hücreye analiz uzantısı izin verecek şekilde tasarlanmıştır.

Protokol

Tüm işlemler "Laboratuar Hayvan Bakım Prensipleri" anlatılan yönergeleri izleyerek gerçekleştirilir (Sağlık yayın National Institutes hayır. 85-23, 1985 revize) ve onaylı Rosalind Franklin Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu hayvan protokol 08-19.

1.. Saç Hücre Nekroz gentamisin-indüksiyon

1. % 0.004 lik bir nihai konsantrasyonda (4.32 mM) normal tuzlu su içinde gentamisin sülfat hazırlayın.
2. 0.004% (4.32 mM) gentamisin çözeltisi içeren bir kap içinde yetişkin balık (D. rerio, yaş 4-6 ay) yerleştirin. Herhangi bir kap kullanılabilir ancak geniş 7, yüksek 6, 7 ve uzun olan bir Pharmacal Su Sistemi Bir balık kap kullanır. 24 saat boyunca 28 ° C'de ayarlanmış bir kuluçka makinesi içinde balık kap yerleştirin. 24 saatlik bir süre için uygun bir halde balık korumak için yeterli düzeyde tanktaki sıvının toplam hacmi ayarlayın. Not: gentamisin sıvının havalandırma NECE değilssary yeterli bir miktar, tedavi edilen balık sayısı için kullanılırsa.

Saç Hücreleri 2. Vital Boyama

1. 15 mg / ml 'lik bir işlem stok çözeltisinden floresan vital boya [4-4-diethylaminostyryl)-N-metilpiridinyum iyodit (485 nm eksitasyon ve metanol içinde λ 603 nm emisyon λ) (normal tuzlu su içinde)% 0.08 bir konsantrasyonda hazırlanması etanol.
2. Gentamisin ile tedavinin, tedavi araştırmak vital boya ihtiva eden bir 6 yuvalı kültür plakasının kuyudaki balık yerleştirerek hemen boyanmış kontrol ve gentamisin bir alt kümesini etkili olup olmadığını belirlemek. Bu balık 75 üzerinden dakika boyunca lekeli değildir bu nedenle, istatistiksel anlamlılık elde edilmesi için gerekli olan yeterli bir balık sayısı (ve kültür plakaları kullanın. Neuromast sayma muayene eden hızına bağlı olarak, zaman içinde karşı karşıya gelmeyen bir şekilde plakalarda balık yer Adım 2.3 'de tarif edildiği gibi.
3. Floresan mikroskop ile bir tezgah çekmece adım 2.2 tabak yerleştirinlekeli neuromasts incelenmesi için de kullanılabilir. Oda sıcaklığında 1 saatlik bir süre boyunca boyama hayati boyanın söndürme önlemek için oda ışıkları kapatın.
4. Boya yıkama-out ve anestezik su depoları hem hazırlayın. Boya bir yıkama suyu normal bir balık su ve normal balık su içinde bir 1:1000 seyreltme elde edilir, böylece anestezi, su için yeterli bir 2-fenoksietanol ilave edin.
5. Aşırı hayati boya durulayın ve hayati boya lekeli balık gözlem için 3.1 adıma geçmek için fazla normal bir balık suda balık yerleştirin.
6. 28 ° C de 8-16 arasında saat için bir kuluçka makinesi normal balık su içinde yıkandı, gentamisin ile tedavi edilen balık transferi, neuromasts rejenerasyonunu incelemek
7. 8-16 saat arasında, çeşitli zamanlarda, balık, inkübatörden çıkarılmıştır yıkandı ve adımlar 2,1-2,4 belirtildiği gibi boyanır. Hayati boya lekeli balık gözlem için 3.1 adıma geçin.

3.. Anestezi Balık ve Neuromasts Floresan Sayma

1. Aşırı sıvı kaldırmak ve daha sonra plastik bir Petri kabı kapağının merkezli filtre kağıdı nemli bir parçası üzerine yerleştirmek için bir kağıt havlu üzerinde her balık kurutun.
2. Orta gövde dikiş hayati boya lekeli neuromasts bir dijital görüntü elde etmek için bir floresan stereo mikroskop sahnede kapağı yerleştirin.
3. Kullanın floresan stereo mikroskop üzerine yerleştirilen bir dijital kamera sonraki kantitatif analiz için görüntüleri yakalamak için 2X büyütme ayarlayın. Stereo mikroskop büyütme ayarı kullanılan mikroskop markası bağlı olabilir, ancak ayar orta gövde dikişleri içinde kolay görüntüleme ve bireysel neuromasts sayma izin vermelidir: Not.
4. (Bkz. Şekil 1) sağ göğüs fin için sadece yakın balık en alt ventral tarafında dört belirlenen ilmek içinde görünür neuromasts sayısını sayarak rejenerasyon miktarını belirler. İstatistiksel analiz için böyle ANOVA o gibi uygun bir testi kullanmakr Student T-testi. Deneyler, her bir zaman noktasında 5 balık az kullanmak gerekir ve bütün deneyler 3x az tekrarlanmalıdır.
5. Neuromast rejenerasyon zaman eğrisinin dayanarak (bkz. Şekil 3), rejenerasyon eğrisinin doğrusal faz içinde olduğu 8-16 saat sonrası gentamisin yıkama-out arasında neuromasts saymak. Not: Doğrusal zaman aşamasında kullanılması deney ve kontrol grupları arasında uygun bir kantitatif analiz için izin verir.

Neuromast istatistiksel olarak anlamlı değildi ise Kantitatif Analiz Yüksek Çözünürlük alma için Bireysel Saç Hücreleri 4. Floresan Sayma

1. Neuromasts düzeyinde kantitatif analiz önemli değilse, tek tek saç hücre düzeyinde analiz de daha yüksek bir çözünürlük derecesi elde etmek için kullanılabilir. Belirli bir zaman noktası sonrası gentamisin wash-out (zaman noktasını önceki neuromast çalışmalara dayanarak), vital boya st balıkları seçinProtokol 2 de tarif edildiği gibi balık ain ve daha sonra 1-5 dakika boyunca, bir 1:500 seyreltmede 2-fenoksietanol kullanarak balık euthanize.
2. Aşağıdaki gibi, bir kare flep hazırlama yapılır, böylece söndürme önlemek için, uygun ışık olarak, dört kesiler yapmak. Bu anal yüzgeçleri ile aynı hizaya gelene kadar balık üst kaburgalar boyunca bir kesi yapmak, sonra göbek arasında bir kesi yapmak, ve nihayet, bu yüzden kare flep oluşturulan bu kesiler her iki tarafında iki dikey kesiler yapmak. Not: Bu cilt hazırlama neuromast deneylerde kullanılan orta gövde dikiş dahil edecektir.
3. Bir cam slayt deri örneği yerleştirin ve sonra çapa yardım ve sonraki dijital görüntüleme için doku düzleştirmek için kesilip deri örneğinin üzerine bir yuvarlak cam kapak kayma yerleştirin.
4. Aşama 4.3 gelen deri örnekleri kullanarak, orta gövde dikişlerin her biri neuromast içindeki saç hücrelerinin dijital görüntü elde etmek. En az 60X büyütme görüntüleri almak ve sonra saç ce saymakdeney ve kontrol gruplarının karşılaştırmalı kantitatif analiz için ayrı neuromasts içinde lls (bkz. Şekil 4).

Sonuçlar

Yetişkin zebrabalıkları yanal çizginin neuromast rejenerasyon miktarının belirlenmesi için prosedürlerin optimizasyonu.

Larva zebrabalıkları neuromasts kolaylıkla ölçülebilir vardır; Bununla birlikte, yetişkin zebrafish yan hat ^6,17,19,20 kantitatif analiz daha zor hale dikiş başına neuromasts çok daha büyük bir sayı vardır. Şekil 1A'da görüldüğü gibi, baş orta bölümü ya da kuyruk ya kıyasla neuromasts bir be...

Tartışmalar

Embriyonik ve larva zebrabalıkları ^8,24,25 lateral hat (LL) rejenerasyon analizi için kurulmuştur edebiyat geniş gövdesine dayanarak, çalışmamızın amacı zebrabalıkları yanal hat rejenerasyon için niceliksel bir test geliştirmek olduğunu olabilir en iyi yetişkin balık incelenir hastalık modelleri uygulanabilir. Biz yetişkin balık embriyonik / larva balık için geliştirilen yöntemler uygulanarak zaman belli kritik noktalarda önemli olduğunu bulundu. Bu noktaların en önemli kabul edi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gentamicin sulfate solution (50 mg/ml)	Sigma Aldrich	G1397
2 Phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
4-4-Diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) in methanol	Aldrich	D-3418	485 nm excitation λ and 603 nm emission λ
6-well Plates	Mid Sci	TP92006
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
Glass Bottom Microwell Dishes	Matek Corporation	P35G-1.5-14-C
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting  Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
ImageJ software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.
Confocal microscope	Olympus	FV10i	Any high resolution fluorescent microscope is suitable
Aquatic System	KG Aquatics ZFS Rack System		Any aquatic system can be used