アダルトゼブラフィッシュ側線再生のためのアッセイ

要約

神経学的および非神経疾患の多くのゼブラフィッシュモデルは成魚ではなく、胚/幼虫で研究されているため、我々は大人のゼブラフィッシュの疾患モデルに適用することができ、定量的側線再生アッセイを開発しました。アッセイは、1）感丘および2）個々の有毛細胞レベルでの解像度を含んだ。

要約

原因人間に聴覚や平衡障害の臨床的重要性、そのようなゼブラフィッシュなどのモデル生物は側線の開発と再生を研究するために使用されてきた。ゼブラフィッシュは、その急速な開発時間と高い再生能力のような研究のために特に魅力的である。現在までに、側線再生のゼブラフィッシュの研究では、主な理由は、これらの段階でneuromasts数の減少の胚および幼虫期の魚を利用してきた。これは横方向のラインの再生/および以前の発達段階での容易な開発の定量分析を行いました。神経学的および非神経疾患の多くのゼブラフィッシュモデルは成魚ではなく、胚/幼虫で研究されているため、アッセイが利用可能になるように、我々はそれが現在にも適用することができる大人のゼブラフィッシュでは、定量的側線回生アッセイの開発に焦点を当て大人のゼブラフィッシュ疾患モデル。ヴァンスペクトラムによるこれまでの研究を踏まえP ら ¹⁷アダルトメキシコブラインド洞窟魚やゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）内有毛細胞の切除のための手順を説明した、私たちのアッセイは、対照群と実験群間の定量的な比較を可能にするために設計されました。これは、横方向のラインの定義された領域内の有毛細胞のゲンタマイシン誘発性壊死を次の24時間の期間にわたって感丘再現の割合（％）に基づいて、回生感丘標準曲線を開発することによって達成された。アッセイはまた、解像度の高いレベルが必要とされる個々の有毛細胞レベルの分析の拡張を可能にするように設計された。

概要

側線（LL）システムは、聴覚、バランス、走流性や、学校教育や捕食の回避^1-5として仲介行動する責任があり、両方の魚や両生類に見られる機械刺激器官である。これは、支持細胞によって取り囲ま有毛細胞のクラスターで構成され、両方ともがneuromasts ⁶と呼ばれる構造に配置されている。これらneuromastsは、一般的に魚の頭の中で観察されたいくつかの横のステッチと身体と尾の長軸に沿って垂直線（ステッチと呼ばれる）に編成されています。成人では、neuromastsは、胚や仔魚⁶と比較して、ステッチ内の数値が有意に大きい。ゼブラフィッシュにおける生物医学の研究では、抗生物質治療、ノイズによる外傷、慢性感染症などの影響に焦点を当てている。より良い人間にその効果を理解するための試みで、有毛細胞に^7,8。

ほとんどの脊椎動物とは異なり、TEこのようなゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）などleostsは、失われた有毛細胞を再生する能力を持っている。ゼブラフィッシュは、それらの迅速な開発時間と高い再生能力が特に有用である。今日まで、しかし;側線の開発および/ ​​または再生にゼブラフィッシュの研究では、主に簡単にカウントおよび分析^6,9,10を可能にし、横のラインneuromasts数の減少に胚および幼虫期の魚を利用している。

しかし、神経学的および非神経疾患^11-16のような多くのゼブラフィッシュモデルは成魚としない幼虫で研究されて、我々はゲンタマイシンを使用して大人のゼブラフィッシュの横のラインに回生アッセイ（以前にゼブラフィッシュ幼生で使用されるアミノ配糖体の開発に焦点を当て、さらに最近では成魚¹⁷で使用される）ように、アッセイは、現在の大 ​​人のゼブラフィッシュの疾患モデルに適用することができるよう利用可能であった。ヴァントランプeだけしばらく以前に公開された手順Tら^17は、成魚での有毛細胞の切除のための条件を確立し、それらはコントロールとそのようなトランスジェニックゼブラフィッシュ系統または薬理学的に誘発される疾患状態を使用している場合などの実験グループ間の定量的な比較のために必要とされる感丘再生のための標準曲線を確立できませんでしたゼブラフィッシュ^18。したがって、我々は、対照群と実験群を比較した場合、そのような大人のゼブラフィッシュ疾患モデルと同じように我々のデータを使用するために研究者を可能にするため感丘再生の標準曲線を確立するために、有毛細胞の切除のためのヴァントランプら ¹⁷の手順に従ったが、自分の仕事上に構築された。アッセイはまた、解像度の高いレベルが要求される場合、個々の有毛細胞への分析の拡張を可能にするように設計された。

プロトコル

すべての手順は、「実験動物管理の原則」で説明したガイドラインに従って実施された（厚生掲載の国民の協会がない。85から23、1985年改訂）し、承認されたロザリンド·フランクリン大学機関動物実験委員会の動物プロトコルは、8月19日。

有毛細胞壊死の1。ゲンタマイシン誘導

1. 0.004％（4.32ミリモル）の最終濃度で通常の生理食塩水に硫酸ゲンタマイシンを準備します。
2. 0.004％（4.32 mM）のゲンタマイシン溶液の入った容器に成魚（D.フィッシュ 、生後4〜6ヶ月）を配置します。すべてのコンテナを使用することができますが、我々は広い7、高における6、長期での7ですファーマ水生システムからの魚のコンテナを使用しています。 24時間28℃に設定したインキュベーター中で魚と容器を置きます。 24時間の期間の間生存可能な状態で魚を維持するのに十分なレベルで、タンク内の流体の総体積を設定する。注意：ゲンタマイシン流体の通気はNECEではありませんssary十分な量、治療される魚の数が使用される場合。

有毛細胞の2。生体染色

1. 15 mg / mlとワーキングストック溶液からの蛍光生体色素[4-4 - ジエチルアミノスチリル）-N-メチルピリジニウムヨージド（485 nm励起λ、メタノール中で603 nm放射λ）（生理食塩水）で0.08％の濃度を準備しますエタノール中。
2. ゲンタマイシン治療が有効であったかどうかを判断するために、制御およびゲンタマイシン処理魚のサブセットは、生体色素を含む6ウェル培養プレートのウェルに魚を置くことで、すぐに染色される。達成すべき統計的有意性のために必要とされる十分な魚の数（および培養プレートを使用してください。感丘カウントの検者速度に基づいて、魚は75オーバー分間染色されないように、時間をかけて、時間差をおいて、プレートに魚を置く工程2.3に記載のように。
3. 、蛍光顕微鏡でベンチの引き出しにステップ2.2からプレートを配置染色neuromastsの検査に使用される。室温で1時間染色にわたって生体色素の消光を防止するために、部屋の照明をオフにします。
4. 色素ウォッシュアウトし、麻酔水タンクの両方を準備します。染料は水は通常の魚の水である、洗い流し、麻酔薬水のため、通常の魚の水中での1:1,000の希釈が達成されるよう、十分な2 - フェノキシエタノールを追加します。
5. 過剰生体色素をすすぎ、生体色素染色した魚の観察3.1に進み、過剰な通常の魚の水の中の魚を置きます。
6. 28℃で8月16日の間に時間インキュベーターに通常の魚の水で洗浄し、ゲンタマイシン処理魚を移す、neuromastsの再生を検討するために、
7. 8月16日時間の間に様々な時間で、魚が、培養器から取り出し、洗浄して、ステップ2.1から2.4に示したように染色する。生体染色色素で染色魚の観察3.1に進みます。

3。麻酔魚とNeuromastsの蛍光カウント

1. ブロット紙タオル上の各魚が余分な水分を除去した後、プラスチックシャーレの蓋を中心とした濾紙の湿らせた一枚の上に配置する。
2. ミッドボディステッチの生体色素染色neuromastsのデジタル画像を得るために、蛍光実体顕微鏡のステージ上にふたをする。
3. 使用する蛍光実体顕微鏡上に配置されたデジタルカメラは後続の定量分析のために画像を取り込むように2Xの倍率を設定する。実体顕微鏡の倍率設定が使用顕微鏡のブランドに依存してもよいが、設定はミッドボディのステッチ内で簡単に表示し、個々のneuromastsのカウントを許可する必要があります。注意して​​ください。
4. （ 図1を参照）の右胸鰭のすぐ近くの魚の一番下の腹側の4指定された縫い目の中に見えるneuromastsの数を数えることによって回生量を決定します。統計分析のために、このような分散分析Oのような適切なテストを使用するRスチューデントのt検定。実験は、時点当たり5魚の最小値を利用するべきであり、全ての実験は最低3回繰り返されるべきである。
5. 感丘再生時間曲線に基づいて、（ 図3参照）、再生曲線の線形位相内であることが8〜16時間後ゲンタマイシンウォッシュアウトの間neuromastsを数える。注：線形時相の使用は、対照群と実験群との間の適切な定量分析を可能にする。

感丘分析が統計的に有意でない場合は定量分析より高い解像度を得るための個々の有毛細胞の4。蛍光カウント

1. neuromastsのレベルの定量分析が有意でない場合、個々の有毛細胞のレベルでの分析は、より高い解像度を得るために利用することができる。特定の時点ポストゲンタマイシンウォッシュアウト（時点を以前感丘の研究に基づいて）、生体色素STで魚を選択するプロトコール2に記載し、その後1-5分間、1:500希釈で、2 - フェノキシエタノールを使用して、魚を安楽死させるように魚アイン。
2. 次のように正方形の皮膚弁の準備が行われているように、急冷を防ぐために、落ち着いた光の中で、4切開を行います。それは肛門フィンと整列するまで、魚の上部肋骨に沿って切開すると、腹全体で切開を行い、正方形の皮膚弁を作成したので、最後に、これらの切開の両側に二つの垂直切開を行う。注：この肌の準備が感丘の実験で使用したミッドボディステッチを組み込む予定。
3. スライドガラス上の皮膚片を配置し、アンカーを助け、その後のデジタルイメージングのための組織をフラット化するために切除された皮膚試料上円形ガラスカバースリップを配置。
4. ステップ4.3から皮膚片を使用して、ミッドボディーステッチの各感丘内有毛細胞のデジタル画像を取得する。少なくとも60Xの倍率で画像を撮影した後、髪のCEを数える対照群と実験群との比較定量分析のための個々のneuromasts以内LLS（ 図4参照）。

結果

大人のゼブラフィッシュの横のラインの感丘再生を定量化するための手順の最適化。

幼虫のゼブラフィッシュのneuromastsは容易に定量化され;しかし、大人のゼブラフィッシュの側線は^6,17,19,20定量分析をより困難ステッチごとneuromastsのはるかに大きい数を持っています。 図1Aに見られるように、ヘッドは、中間部又は尾部のいずれかと比...

ディスカッション

胚および幼虫ゼブラフィッシュ^8,24,25の横ライン（LL）再生の解析のために確立されている多くの文献に基づいて、我々の研究の目的は、ゼブラフィッシュの横のライン再生のための定量的アッセイを開発することだったことでし最高の成魚で研究された疾患モデルに適用される。私たちは、成魚に胚/仔魚のために開発された手順を適用するときに、ある臨界点が重要であることがわ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gentamicin sulfate solution (50 mg/ml)	Sigma Aldrich	G1397
2 Phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
4-4-Diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) in methanol	Aldrich	D-3418	485 nm excitation λ and 603 nm emission λ
6-well Plates	Mid Sci	TP92006
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
Glass Bottom Microwell Dishes	Matek Corporation	P35G-1.5-14-C
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting  Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
ImageJ software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.
Confocal microscope	Olympus	FV10i	Any high resolution fluorescent microscope is suitable
Aquatic System	KG Aquatics ZFS Rack System		Any aquatic system can be used