Un test pour ligne latérale de régénération à l'âge adulte de poisson zèbre

Résumé

Parce que de nombreux modèles de poisson zèbre de maladies neurologiques et non neurologiques sont étudiés dans les poissons adultes plutôt que l'embryon / larve, nous avons développé un dosage latéral de régénération de ligne quantitative qui peut être appliquée à des modèles de maladies de poisson zèbre adulte. Le dosage impliqué résolution au neuromastes 1) et 2) les niveaux cellulaires de cheveu.

Résumé

En raison de l'importance clinique de l'ouïe et troubles de l'équilibre chez l'homme, des organismes modèles tels que le poisson zèbre ont été utilisés pour étudier le développement de la ligne latérale et la régénération. Le poisson zèbre est particulièrement intéressante pour ces études en raison de son temps de développement rapide et sa grande capacité de régénération. À ce jour, les études de poisson zèbre de latéral régénération de ligne ont principalement utilisé des poissons des stades embryonnaires et larvaires en raison de la diminution du nombre de neuromastes à ces stades. Cela a fait de l'analyse quantitative de la ligne de régénération / et ou le développement plus facile dans les premiers stades de développement latéral. Parce que de nombreux modèles de poisson zèbre de maladies neurologiques et non neurologiques sont étudiés dans les poissons adultes et non dans l'embryon / larves, nous nous sommes concentrés sur le développement d'un test latéral quantitative ligne de régénération chez le poisson zèbre adulte ainsi qu'une analyse était disponible qui pourrait être appliquée à courant modèles de la maladie de poisson zèbre adulte. S'appuyant sur des études précédentes par Van Trump et al ^17. qui décrit les procédures d'ablation de cellules ciliées de poissons adultes mexicain aveugle de la grotte et le poisson zèbre (Danio rerio), notre test a été conçu pour permettre une comparaison quantitative entre les groupes témoins et expérimentaux. Cela a été réalisé en mettant au point une courbe étalon de neuromastes régénérative sur la base de la réapparition de neuromastes pour cent pendant une période de temps de 24 heures suivant la nécrose induite par la gentamicine, de cellules ciliées dans une région définie de la ligne latérale. L'essai a également été conçu pour permettre l'extension de l'analyse au niveau des cellules ciliées individu quand un niveau supérieur de résolution est requise.

Introduction

Le système (LL) de la ligne latérale est un organe mécanosensorielle trouvé dans les deux poissons et les amphibiens qui est responsable de l'audition, l'équilibre, rhéotactisme et les comportements de médiation telles que la scolarisation et l'évitement des prédateurs ^1-5. Elle est composée de grappes de cellules ciliées entourées par des cellules de soutien, qui sont tous deux positionnés dans des structures appelées neuromastes ^6. Ces neuromastes sont généralement organisés en lignes verticales (appelé points) le long de l'axe longitudinal du corps et de la queue avec quelques points horizontaux observés dans la tête du poisson. Chez l'adulte, neuromastes sont beaucoup plus nombreux dans les points par rapport à l'embryon ou larves de poissons ^6. Études biomédicales chez le poisson zèbre ont porté sur l'effet du traitement antibiotique, traumatisme induit par le bruit, une infection chronique, etc. sur les cellules ciliées ^7,8 pour tenter de mieux comprendre leurs effets sur les humains.

Contrairement à la plupart des vertébrés, teleosts, tels que le poisson zèbre (Danio rerio), ont la capacité de régénérer les cellules de cheveux perdus. Poisson zèbre sont particulièrement utiles en raison de leur temps de développement rapide et de haute capacité de régénération. A ce jour, toutefois, études de poisson zèbre sur le développement et / ou la régénération de la ligne latérale ont principalement utilisé le poisson embryonnaire et larvaire stade en raison de la réduction du nombre de neuromastes de la ligne latérale qui permet de faciliter le comptage et l'analyse ^6,9,10.

Cependant, comme de nombreux modèles de poisson zèbre de maladies neurologiques et non neurologiques ^11-16 sont étudiés dans les poissons adultes et non les larves, nous nous sommes concentrés sur le développement d'un test de régénération de la ligne latérale chez le poisson zèbre adulte en utilisant la gentamicine (un aminoglycoside déjà utilisé dans les larves de poisson zèbre et plus récemment utilisé avec les poissons adultes ¹⁷⁾ de sorte qu'une analyse était disponible qui pourraient être appliquées à des modèles de maladies adultes actuels de poisson zèbre. Bien que les procédures précédemment publié par Van Trump et al. ¹⁷ fixe les conditions pour l'ablation des cellules ciliées dans les poissons adultes, ils n'ont pas établi une courbe standard pour la régénération neuromastes qui est nécessaire pour la comparaison quantitative entre les groupes témoins et expérimentaux tels que l'utilisation de lignes de poisson zèbre transgénique ou états pathologiques pharmacologiquement induits chez le poisson zèbre ^18. Nous avons donc suivi les procédures de Van Trump et al. ¹⁷ pour l'ablation des cellules ciliées, mais construit sur ​​leur travail pour établir une courbe standard de régénération neuromastes pour permettre aux enquêteurs d'utiliser nos données lorsque l'on compare les groupes témoins et expérimentaux tels que des modèles de la maladie de poisson zèbre adulte . L'essai a également été conçu pour permettre l'extension de l'analyse à la cellule individuelle lorsque les cheveux un plus haut niveau de résolution est requise.

Protocole

Toutes les procédures sont effectuées suivant les directives décrites dans les «Principes de protection des animaux de laboratoire» (National Institutes of Health publication no. 85-23, révisée 1985) et le protocole de l'animal Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux Université Rosalind Franklin approuvé 08-19.

1. Gentamicine-induction de cheveux nécrose des cellules

1. Préparer le sulfate de gentamicine dans du sérum physiologique à une concentration finale de 0,004% (4,32 mM).
2. Placer le poisson adulte (D. rerio, 4-6 mois) dans un récipient contenant le 0,004% (4,32 mM) de solution de gentamicine. Tout récipient peut être utilisé, mais nous utilisons un conteneur de poissons à partir d'un système aquatique Pharmacal qui est 7 de large, 6 en haut, et 7 dans longtemps. Placer le récipient avec des poissons dans un incubateur réglé à 28 ° C pendant 24 heures. Régler le volume total de fluide dans le réservoir à un niveau suffisant pour maintenir le poisson dans un état viable pour la période de 24 heures. Remarque: L'aération du fluide gentamicine n'est pas necessaire si suffisamment de volume est utilisée pour le nombre de poissons à traiter.

2. Coloration vitale des cellules ciliées

1. Préparer une concentration de 0,08% (dans une solution saline normale) du colorant vital fluorescent [4-4-diethylaminostyryl)-N-méthylpyridinium (485 nm excitation λ et 603 nm émission λ dans le methanol) à partir d'une solution de travail de réserve de 15 mg / ml dans de l'éthanol.
2. Pour déterminer si le traitement a été efficace gentamicine un sous-ensemble de contrôle et de la gentamicine poissons traités sont colorées immédiatement en plaçant le poisson dans le puits d'une plaque de culture 6 puits contenant le colorant vital. Utilisez un nombre suffisant de poissons (et des plaques de culture comme l'exige la signification statistique à atteindre. Basé sur la vitesse de l'examinateur de comptage neuromastes, placer le poisson dans les plaques de manière échelonnée dans le temps afin que les poissons ne sont pas tachés de plus de 75 min comme décrit dans l'étape 2.3.
3. Placez les plaques de l'étape 2.2 dans un tiroir de banc par le microscope à fluorescence àêtre utilisé pour l'examen de neuromastes colorées. Éteignez les lumières de la pièce pour éviter l'extinction du colorant vital au cours de la période de coloration 1 h à température ambiante.
4. Préparer la fois colorant wash-out et des réservoirs d'eau anesthésiques. Eau de wash-out colorant est de l'eau de poisson normale et de l'eau anesthésie, ajouter suffisamment de 2-phénoxyéthanol sorte qu'une dilution de 1:1000 dans l'eau du poisson normale est atteint.
5. Placer le poisson dans l'eau en excès de poisson normale pour rincer l'excès de colorant vital et passez à l'étape 3.1 pour l'observation de colorant teinté poissons vital.
6. Pour la régénération de la neuromastes, transférer les poissons de la gentamicine traités qui ont été lavés à l'eau du poisson normale dans un incubateur pour entre 8-16 heures à 28 ° C.
7. À divers moments entre 8-16 heures, les poissons sont retirées de l'incubateur, lavées et colorées comme indiqué dans les étapes 2.1 à 2.4. Passez à l'étape 3.1 pour l'observation de colorant teinté poissons vital.

3. Anesthésier le poisson et comptage fluorescent de Neuromastes

1. Blot chaque poisson sur une serviette en papier pour enlever l'excès de liquide, puis placez-le sur un morceau de papier humide de filtre qui est centrée sur le couvercle d'une boîte de Petri en plastique.
2. Placer le couvercle sur la scène d'un microscope stéréo fluorescent pour obtenir une image numérique des colorants neuromastes colorées vitaux des points du corps milieu.
3. Utilisez un appareil photo numérique placé sur le microscope stéréo fluorescent fixé un grossissement de 2X pour capturer des images pour l'analyse quantitative ultérieure. Remarque: Le réglage de grossissement du microscope stéréo peut dépendre de la marque de microscope utilisé, mais le réglage doit permettre l'affichage et le comptage des neuromastes individuels facile dans le milieu des points du corps.
4. Déterminer la quantité de régénération en comptant le nombre de neuromastes visibles dans les quatre points désignés sur le côté inférieur le plus ventrale du poisson juste en amont de la nageoire pectorale droite (voir la figure 1). Pour l'analyse statistique en utilisant un test approprié tel que ANOVA or T-test de Student. Les expériences doivent utiliser un minimum de 5 poissons par point de temps et toutes les expériences doivent être répétées au moins 3x.
5. Sur la base de la courbe de temps neuromastes de régénération (voir la figure 3), compter neuromastes entre 8-16 heures après la gentamicine wash-out pour être dans la phase linéaire de la courbe de régénération. Remarque: L'utilisation de la phase de temps linéaire permet une analyse quantitative adéquate entre les groupes témoins et expérimentaux.

4. Comptage fluorescent de cellules ciliées individuelle pour l'obtention d'une résolution plus élevée de l'analyse quantitative si l'analyse neuromastes n'est pas statistiquement significative

1. Si l'analyse quantitative au niveau de neuromastes n'est pas significative, une analyse au niveau de la cellule individuelle de cheveux peut également être utilisée pour obtenir un plus haut degré de résolution. Sélectionnez poisson à un particulier le point de temps après la gentamicine de wash-out (point de temps sur la base des études de neuromasts antérieures), colorant vital stain le poisson tel que décrit dans le protocole 2, puis euthanasier les poissons en utilisant le 2-phénoxyéthanol à une dilution 1:500 1-5 min.
2. Dans une lumière tamisée pour éviter l'extinction, faire quatre incisions ainsi qu'un carré préparation de lambeau de peau est faite comme suit. Faire une incision le long des côtes supérieures du poisson jusqu'à ce qu'il soit aligné avec les nageoires anales, puis faire une incision dans le ventre, et enfin, faire deux incisions verticales de chaque côté de ces incisions de sorte que le volet carré de la peau est créé. Note: Cette préparation de la peau intégrera les points du corps milieu utilisés dans les expériences de neuromasts.
3. Placer l'échantillon de peau sur une lame de verre, puis placez une circulaire lamelle de verre sur le spécimen excisé de la peau pour aider à l'ancre et aplatir le tissu pour l'imagerie numérique ultérieure.
4. En utilisant les échantillons de peau provenant de l'étape 4.3, d'obtenir des images numériques de cellules ciliées dans chaque neuromastes des points milieu du corps. Prenez des photos à un grossissement d'au moins 60X et puis de compter le CE de cheveuxlls dans neuromastes individuels pour l'analyse quantitative comparative de la commande et les groupes expérimentaux (voir figure 4).

Résultats

Optimisation des procédures pour quantifier neuromastes régénération de la ligne latérale chez le poisson zèbre adulte.

Les neuromastes de poisson zèbre larves sont facilement quantifiables; Cependant, la ligne latérale de poisson zèbre adulte a un plus grand nombre de neuromastes par point faisant des analyses quantitatives plus difficile ^6,17,19,20. Comme on le voit sur ​​la figure 1A, la tête a un nombre significativement plus él...

Discussion

Basé sur le vaste corpus de littérature qui a été mis en place pour l'analyse de la ligne latérale (LL) de la régénération chez le poisson zèbre embryonnaire et larvaire ^8,24,25, le but de notre étude était de développer un dosage quantitatif pour la régénération de la ligne latérale chez le poisson zèbre qui pourrait être appliquée à des modèles de maladies qui sont les mieux étudiés dans les poissons adultes. Nous avons constaté que certains points critiques sont importantes lors...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gentamicin sulfate solution (50 mg/ml)	Sigma Aldrich	G1397
2 Phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
4-4-Diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) in methanol	Aldrich	D-3418	485 nm excitation λ and 603 nm emission λ
6-well Plates	Mid Sci	TP92006
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
Glass Bottom Microwell Dishes	Matek Corporation	P35G-1.5-14-C
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting  Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
ImageJ software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.
Confocal microscope	Olympus	FV10i	Any high resolution fluorescent microscope is suitable
Aquatic System	KG Aquatics ZFS Rack System		Any aquatic system can be used