对于侧线再生成年斑马鱼的含量

摘要

由于神经和非神经系统疾病的许多斑马鱼模型研究在成年鱼，而不是胚胎/幼虫，我们开发了可应用于成年斑马鱼疾病模型的定量侧线再生试验。该法涉及的分辨率在1）神经丘和2）单个毛细胞的水平。

摘要

由于听力和平衡紊乱在人的临床重要性，模式生物如斑马鱼已被用于研究横向线的开发和再生。斑马鱼是由于其快速的开发时间和它的高再生能力为这些研究特别有吸引力的。迄今为止，侧线再生斑马鱼的研究主要是利用，因为在这几个阶段的较小的数字神经丘的胚胎和幼虫的鱼。这使侧线再生/和或更早发育阶段的开发更容易进行定量分析。由于神经系统和非神经系统疾病的许多斑马鱼模型研究了成鱼，而不是在胚胎/幼虫，我们专注于开发一个定量的侧线试验再生的成年斑马鱼，这样的分析是可用的，可以被应用到当前成年斑马鱼疾病模型。由Van TRUM建立在前人研究所描述的毛细胞在成年墨西哥洞穴盲鱼和斑马鱼（ 斑马鱼 ）的消融过程P 等¹⁷中 ，我们分析的目的是让控制组和实验组之间的定量比较。这是通过开发一种基于神经丘再现过以下毛细胞在限定的横向线的区域庆大霉素引起的坏死一个24小时时间段的百分比的再生神经丘标准曲线来实现。该测定也被设计为允许扩展的分析，以当需要的分辨率更高水平的个体毛发细胞的水平。

引言

侧线（LL）系统是鱼类和两栖类，它负责听觉，平衡，rheotaxis调处行为，如教育和捕食者回避^1-5找到了mechanosensory器官。这两者它是由簇毛细胞，支持细胞包围，被定位在结构，称为神经丘^6。这些神经丘通常组织成垂直线（称为针）沿主体和尾部与一些在鱼的头部观察到的水平线圈的纵向轴线。在成人中，神经丘是显著更大数目的线圈相比，胚胎或仔鱼⁶内。在斑马鱼生物医学研究都集中在抗生素治疗，噪音引起的创伤，慢性感染等的影响。对毛细胞，试图^7,8，以便更好地了解他们在人体的影响。

与大多数脊椎动物，德硬骨鱼，如斑马鱼（ 斑马鱼 ），必须重新生成丢失的毛细胞的能力。因为它们的快速开发时间和高再生能力的斑马鱼是特别有用的。迄今为止，然而;侧线上的开发和/或再生斑马鱼研究主要利用的胚胎和幼虫阶段的鱼，由于侧线神经丘的数量减少可以较容易计数和分析^6,9,10。

然而，神经系统和非神经系统疾病^11-16尽可能多的斑马鱼模型研究了成鱼，而不是幼虫，我们专注于开发在成年斑马鱼用庆大霉素横向线再生法（以前在斑马鱼幼虫用一种氨基糖苷类和最近与成年鱼¹⁷用），这样的测定法是可用的，可以被应用到当前的成年斑马鱼的疾病模型。而此前公布的程序由Van特朗普ét铝^，17设立在成鱼的毛细胞消融的条件，他们没有建立标准曲线这是需要控制组和实验组利用转基因斑马鱼线或药物诱发的疾病状态时，如之间的定量比较神经丘再生在斑马鱼^18。因此，我们跟着范·特朗普等人 ¹⁷的毛细胞消融的程序，但建立在他们的工作，以建立神经丘再生的标准曲线，以使研究者比较对照组和实验组在使用我们的数据，如与成年斑马鱼疾病模型。该测定也被设计为允许扩展的分析对个体毛发细胞时，需要解决的一个更高的水平。

研究方案

所有的程序都按照“实验动物福利原则”所述的准则进行（卫生出版没有。85-23国家研究院​​，1985年修订）和经批准的罗莎琳德富兰克林大学实验动物管理和使用委员会动物协议08-19。

1，庆大霉素诱导的毛细胞坏死

1. 制备硫酸庆大霉素生理盐水在0.004％的终浓度（4.32毫摩尔）。
2. 在含有0.004％（4.32毫米）庆大霉素溶液的容器放置成鱼（ 斑马鱼 ，4-6个月的婴儿）。任何容器均可使用，但我们使用鱼容器从医药品水产系统是在宽7所示，在高6，和在长7。将容器鱼在孵化器设定在28℃，24小时。在足够的电平设置流体在罐的总容积在一个可行的状态保持鱼的24小时期间。注：庆大霉素液的曝气不是NECEssary如果有足够的容积用于鱼被处理的数量。

毛细胞的2。活体染色

1. 制备的荧光活体染料[4 - 4 - 二乙基氨基）-N-甲基吡啶鎓碘化物（485nm激发λ和甲醇603 nm发射λ）从15毫克/毫升的工作原液的0.08％的浓度（在生理盐水中）乙醇。
2. 以确定是否庆大霉素治疗是有效的控制和庆大霉素的一个子集处理的鱼是由在含有活体染料6孔培养板的孔放置鱼立即染色。根据需要为要达到统计学显着性使用鱼的足够数量（培养板，基于神经丘计数检查者的速度，将鱼在所述板以交错的方式随着时间的推移，这样的鱼不染色，在75分钟按照步骤2.3中所述。
3. 通过荧光显微镜放置板从一个抽屉里板凳2.2步可用于检查神经丘染色的。关掉房间的灯，以防止活体染料的猝灭过在室温下1小时，染色时间。
4. 准备两种染料洗出和麻醉水箱。染料洗出的水是正常的鱼和水的麻醉水，补充足2 - 苯氧基乙醇，这样一1:1000稀释在正常的鱼水的实现。
5. 将鱼超出正常的鱼水冲洗多余的活体染料，并继续执行步骤3.1观察生命染料染色的鱼。
6. 为了研究神经丘的再生，转移在28°C洗涤正常的鱼水的孵化8-16小时之间的庆大霉素处理的鱼
7. 在8-16小时之间的不同时间，鱼从培养箱中取出，洗涤，染色按照步骤2.1-2.4所示。继续执行步骤3.1观察生命染料染色的鱼。

3，麻醉测定鱼和神经丘的荧光计数

1. 吸干纸巾上每条鱼去除多余的液体，然后将其放置在一个湿润的滤纸是集中在塑料培养皿的盖子。
2. 放置在荧光立体显微镜阶段的盖子，得到的中间体线圈的活体染料染色的神经丘的数字图像。
3. 使用数码相机放置在荧光立体显微镜载2X的放大率捕获图像用于后续的定量分析。注：立体显微镜的放大倍数设定可能取决于显微镜使用的品牌，但该设置应该让身体中缝内便于查看和个别神经丘的计数。
4. 通过计数在鱼刚好接近右胸鳍的最底层的腹侧四个指定的线圈内的可见神经丘的数量（参见图1）确定再生的量。统计分析使用适当的测试，如方差分析Ør中的学生T检验。实验应利用最少的每个时间点5鱼和所有的实验应重复至少3倍的。
5. 基于神经丘再生时间曲线（ 见图3），数8-16小时庆大霉素后洗出的神经丘是再生曲线的线性相位内。注意：使用线性时间阶段允许控制组和实验组之间的正确定量分析。

个别毛细胞4。为获得更高的分辨率定量分析的，如果神经丘分析无统计学意义荧光计数

1. 如果在神经丘水平的定量分析是不显著，分析在单个毛细胞的电平也可以被用来获得较高程度的分辨率。在特定的时间点庆大霉素后洗出（时间点的基础上，早期的神经丘研究），活体染料ST选择鱼泉如在方案2中所述的鱼，然后用2 - 苯氧基乙醇以1:500稀释为1-5分钟安乐死的鱼。
2. 在柔和的光，以防止淬火，使4切口，使得正方形皮瓣制备是如下进行的。做一个切口沿鱼的上肋，直到它与肛门鳍对准，然后使整个腹部切口，最后，这样的方皮瓣被创建使这些切口的每一侧上的两个垂直切口。注意：这种皮肤准备工作将纳入在神经丘实验中使用的身体中针。
3. 将皮肤标本在载玻片上，然后将一个圆形玻璃盖片在皮肤切除标本帮锚杆和扁平化的组织进行后续的数字成像。
4. 利用皮肤标本从步骤4.3，获得毛细胞的中间体的线圈的每个神经丘内的数字图像。拍摄图像在至少60X的放大倍数再算上头发CE单个神经丘内LLS为对照组和实验组的比较定量分析（ 见图4）。

结果

优化的程序，在量化成年斑马鱼的侧线神经丘再生。

斑马鱼幼虫的神经丘是容易量化;然而，成年斑马鱼的侧线具有更大数目的每针脚神经丘作出定量分析更加困难^6,17,19,20的。就像在图1A中 ，头部有许多神经丘相比，任一中间部分或尾部的显著更高;用具有如图所示的一维数最少的神经丘的尾部区域。因为线圈中的头...

讨论

基于已建立的侧线（LL）再生的胚胎和幼虫斑马鱼^8,24,25分析文献的广泛身体，我们的研究目标是开发在斑马鱼的定量检测横向线条的再生可能被应用到被研究最好在成年鱼的疾病模型。我们发现，应用到成鱼开发的胚胎/仔鱼过程时，某些关键点是很重要的。最重要的这些点被认为：1）侧线的数量沿鱼的纵向轴线神经丘，神经丘毛细胞染色的2），3）治疗的氨基糖苷的浓度和持续时间，和4...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gentamicin sulfate solution (50 mg/ml)	Sigma Aldrich	G1397
2 Phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
4-4-Diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) in methanol	Aldrich	D-3418	485 nm excitation λ and 603 nm emission λ
6-well Plates	Mid Sci	TP92006
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
Glass Bottom Microwell Dishes	Matek Corporation	P35G-1.5-14-C
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting  Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
ImageJ software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.
Confocal microscope	Olympus	FV10i	Any high resolution fluorescent microscope is suitable
Aquatic System	KG Aquatics ZFS Rack System		Any aquatic system can be used