على الورق اللونية الكشف عن<em&gt; كولاي</em&gt;،<em&gt; السالمونيلا</em&gt; النيابة، و<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em&gt; من كميات كبيرة من المياه الزراعية

Summary

A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (µPAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.

Abstract

يصف هذا البروتوكول الكشف اللونية السريع للالقولونية، السالمونيلا، والليستيريا المستوحدة كميات كبيرة من (10 لتر) من المياه الزراعية. هنا، يتم تصفية المياه من خلال التعديل العقيمة مور مسحات (MMS)، والتي تتكون من مرشح الشاش بسيطة المغلقة في خرطوشة من البلاستيك، لتركيز البكتيريا. بعد الترشيح، يتم تنفيذ التخصيب غير انتقائية أو انتقائية للبكتيريا المستهدفة في MMS. للكشف اللونية من البكتيريا المستهدفة، ثم يتم يعاير التخصيب باستخدام الورقية الأجهزة التحليلية (μPADs) جزءا لا يتجزأ مع البكتيريا الإرشادية ركائز. كل الركيزة يتفاعل مع الانزيمات البكتيرية الهدف الإرشادي، وتوليد المنتجات الملونة التي يمكن أن يتم الكشف عن البصر (الكشف النوعي) على μPAD. بدلا من ذلك، يمكن أن تتولد الصور الرقمية من μPADs تفاعلت مع المسح المشترك أو أجهزة التصوير وتحليلها باستخدام برنامج ImageJ، آلخوار لمزيد من التفسير الموضوعي وموحدة من النتائج. على الرغم من أن تصميم إجراءات الفرز البيوكيميائية لتحديد مسببات الأمراض البكتيرية المذكورة آنفا، في بعض الحالات تنتج الأنزيمات التي كتبها مجهريات البقعة الخلفية أو تدهور ركائز اللونية قد تنتج إيجابية كاذبة. وبالتالي، هناك حاجة إلى تأكيد التشخيص باستخدام أكثر التمييزية. ومع ذلك، وهذا التركيز والكشف عن منصة البكتيرية غير مكلفة وحساسة (0.1 كفو / مل حد الكشف)، من السهل القيام بها، والسريع (يتم تنفيذ التركيز، والإثراء، والكشف غضون ما يقرب من 24 ساعة)، لتبرير استخدامه كطريقة الفحص الأولي لجودة الميكروبيولوجية للمياه الزراعية.

Introduction

من المهم أن يتم الكشف عن الأمراض المنقولة بالأغذية وكلاء بسرعة ويفضل في إعدادات ميدانية من أجل الحد من عبء الأمراض المنقولة بالأغذية. وتشمل استراتيجيات مشتركة للكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية المنقولة عن طريق الأغذية التنميط الكيمياء الحيوية، وزراعة انتقائية والتفضيلية، والعزلة المناعية والكشف، والكشف الجزيئي. غير أن ما يعرقل هذه الأساليب التي تلوث متفرقة، وأحجام عينة صغيرة اختبارها، وتركيزات منخفضة في كثير من الأحيان من البكتيريا المسببة للأمراض المنقولة عن طريق الأغذية، تتطلب أوقات المعالجة طويلة، و / أو غير قابلة للتطبيق لإعدادات المجال. علاوة على ذلك، في كثير من المركبات المصفوفات الغذائية المثبطة لكشف والتطبيقات التشخيصية. من أجل تحسين احتمالات الكشف عن الجراثيم، واقترحت إدارة الأغذية والأدوية الأمريكية أن اختبار المياه الزراعية (مثل مياه الغسيل ومياه الري) التي إما يأتي في اتصال مع مساحة كبيرة من المنتجات الطازجة أو بمثابة وسيلة لعتلوث roduce هو بديل قابل للتطبيق لاختبار مباشرة من المواد الغذائية ^1. وحتى مع ذلك، وغالبا ما تكون منخفضة الطبيعية الممرض الأعباء إلى جانب تأثير التخفيف من عينة تمثيلية المياه الزراعية يجعل طرق إعداد العينات للتركيز الممرض الأساسية. ان مثل هذه الطريقة تتطلب أخذ العينات كميات كبيرة من المياه (≥ 10 L)، كافية الممرض على التركيز، والتوافق مع استراتيجيات الكشف المصب.

مسحات مور تعديل (MMS) هي أجهزة غير مكلفة وبسيطة، وعرة تستخدم لتركيز البكتيريا من كميات كبيرة (≥ 10 لتر) من الماء ^2-4. يتكون MMS من شريط من البلاستيك مليئة الشاش، والتي هي بمثابة فلتر الخشنة لكميات كبيرة من المياه التي يتم ضخها من خلال الكاسيت باستخدام مضخة تحوي. رسائل الوسائط المتعددة هي طريقة غير التمييزي لتركيز البكتيريا (≥ تركيز 10 أضعاف) الذي يلتقط المواد العضوية وغير العضوية الجسيمات بما في ذلك الكائنات الحية الدقيقة في معالجة لىعينات مضغة. فمن المرجح أن فعالية ممتازة للتركيز الكائنات الدقيقة المستهدفة من قبل MMS يمكن تفسير حقيقة أن من المتوقع أن تعلق على جزء الطمي أو الطين العضوية المجاميع الصغيرة من المواد الصلبة العالقة ³ الكائنات الحية الدقيقة. تصميم وعرة للMMS يسمح للتغلب على أوجه القصور المرتبطة معظم طرق الترشيح الأخرى لالتقاط وتركيز البكتيريا من المياه، مثل انسداد المرشحات، وعدم القدرة على معالجة كميات كبيرة، وعينات فلتر مع العكارة العالية، وارتفاع التكاليف. لهذه الأسباب، وادارة الاغذية والعقاقير توصي بإدراج لMMS في الإجراءات الرسمية لإجراءات جمع العينات البيئية والمتعلقة ^تنتج-5.

هنا، يتم وصف طريقة لتركيز، والإثراء، والكشف عن الإشريكية القولونية، السالمونيلا، والليستيريا المستوحدة من المياه الزراعية. ويستخدم MMS للتركيز جرثومةeria، وأيضا بمثابة سفينة لتخصيب البكتيرية انتقائية أو غير انتقائية. ويتحقق كشف البكتيريا كيميائيا باستخدام الورقية الأجهزة التحليلية (μPADs) ^6. يمكن تصنيعها μPADs كشبكات فلويديك أو اختبارات البقعة باستخدام مجموعة متنوعة من الأساليب بما في ذلك ضوئيه والطباعة النافثة للحبر، وختم، والشمع الطباعة ^7-11. يمكن أمثلة من التصاميم فلويديك تكون أنماط قناة شجيري حيث يترسب العينة في الوسط وبعد ذلك يتدفق إلى الخزانات البعيدة أو أنماط قناة واحدة التي يتم فيها سحب العينة أو الركيزة من الخزانات الخارجية للقناة عن طريق عمل شعري في مركز ^12. لهذا البروتوكول، الذي اخترناه لتوظيف لمدة 7 ملم قطرها الشمع ورقة صفائف بقعة جعلهما مع ركائز مولد اللون التي يمكن معالجتها بواسطة الأنزيمات يدل على الكائنات الحية الدقيقة اختبار هنا: الكلورية الحمراء β-D-galactopyranoside (CPRG) و 5 - برومو كلورو-4-3-indolyl β-D-غلوكورونيد (X-الحلاوة)للكشف عن β-غالاكتوزيداز وβ غلوكورونيداز التي تنتجها E. القولونية؛ كابريلات 5 برومو كلورو 6-3-indolyl (أرجواني كابريلات) للكشف عن C8-استريز التي تنتجها السالمونيلا.؛ و5-برومو-4-كلورو-3-indolyl-ميو اينوزيتول الفوسفات (X-الشرطة الوطنية العراقية) للكشف عن فوسفتيدلينوستول محددة فسفوليباز C (PI-PLC) التي تنتجها L. المستوحدة ^6. وبالتالي، فإن وجود بكتيريا خاصة يمكن ملاحظتها بصريا دون الحاجة إلى معدات معقدة أو تفسير البيانات. خصوصية وحساسية اللونية الكشف μPAD القائم على إنزيم من هذه البكتيريا هدف محدد قد تم استكشافه من قبل ^6. بالإضافة إلى ذلك، تم تقييم حساسية طريقة الكشف عن تركيز متكاملة لهذه البكتيريا المستهدفة من قبل ارتفاعه كميات كبيرة من الماء مع المستويات المحددة مسبقا من الكائنات الحية الدقيقة (بيانات غير منشورة وبيشة وآخرون ^13).

Protocol

1. تركيز البكتيريا من كميات كبيرة من المياه للأغراض الزراعية عن طريق MMS

1. إعداد MMS
   1. قطع مستطيلة المقطع من 4 رقائق جبن قياس 40 × 12 سم.
   2. طي القماش القطني على طول المحورين للحصول على مستطيل من 20 × 6 سم.
   3. لفة القماش القطني بإحكام على طول المحور الطويل لتشكيل أسطواني مسحة من حوالي 6 سم و 3 سم في القطر.
   4. الأوتوكلاف مسحة القماش القطني في رقائق الألومنيوم، لا الأوتوكلاف الكاسيت. تطهير الكاسيت عن طريق نقع لمدة 30 دقيقة في 10٪ التبييض المنزلية، وتنشيط الكلور المتبقي عن طريق نقع الكاسيت لمدة 15 دقيقة في ماءات خماسية ثيوسلفات الصوديوم (نا ₂ S ₂ O ₃ · 5H ₂ O) الحل (50 ملغ / لتر أعدت في الماء المعقم).
   5. إدراج مسحة في الكاسيت MMS.
      ملاحظة: إذا تم استخدام نسخة غير القابل للتصرف من الكاسيت MMS، وتبدأ مع ورقة 4 رقائق من القماش القطني ليasuring 80 × 22 سم، وأضعاف ذلك إلى 40 × 11 سم وألفه لتشكيل الاسطوانة حوالي 11 سم و 6 سم في القطر.
   6. تجميع MMS.
   7. نعلق الفينيل الأنابيب إلى صنابير على جانبي MMS، وضمان أنابيب تلتزم بالكامل إلى صنابير، وإصلاح أنابيب إلى مضخة تحوي. التأكد من أن أنابيب المنبع للمضخة تحوي هو من طول كافية لأخذ العينات.
2. تركيز البكتيريا
   1. عينة لا يقل عن 10 لتر من المياه المستخدمة في الزراعة عن طريق تشغيل مضخة تحوي بسرعة عالية.
   2. بعد أخذ العينات اكتمال سحب مضخة مدخل تحوي عينة من المياه ومتابعة تشغيل المضخة حتى يتم احترام أي مياه تخرج من النفايات السائلة MMS.
   3. إذا تم استخدام متعددة لتشغيل عدة عينات في نفس الوقت، وجمع النفايات السائلة من كل MMS، وعندما يتم تصفية 10 L من خلال MMS واحدة إغلاق صمام لذلك MMS خاصة ومتابعة تشغيل المضخة.
      1. عند أخذ العينات طق الانتهاء، سحب مضخة مدخل تحوي من المياه للأغراض الزراعية، وفتح كل صمامات مشعب، ومتابعة تشغيل المضخة حتى يتم احترام أي مياه النفايات السائلة التي تخرج من MMSS.
3. عندما تم الانتهاء تركيز لجميع MMSS، وإزالة بعناية أنابيب الفينيل من صنابير MMS وغطاء صنابير على كلا الجانبين من MMS. ويمكن تخزين MMS توج بإحكام لمدة تصل إلى 12 ساعة قبل أن يضيف وسائل الإعلام تخصيب اليورانيوم.

2. MMS إثراء وإعداد نموذج

1. تخصيب
   1. فك غطاء MMS، وجو معقم و مطهر إضافة 20 مل من مرق تخصيب معقمة مناسبة. استخدام أحد MMS لكل تخصيب انتقائية. بدلا من ذلك، إجراء تخصيب غير انتقائية لنشر جميع البكتيريا المستهدفة الثلاث في نفس العينة.
      ملاحظة: إذا تم استخدام نسخة غير القابل للتصرف من الكاسيت MMS، وإزالة جو معقم و مطهر مرشح القماش القطني من الكاسيت ووضع في كيس معقم قبل الإعلانقرع 225 مل من وسائل الإعلام تخصيب المناسبة.
      1. لإثراء E. القولونية، إضافة 20 مل من الماء مخزنة ببتون (BPW) تستكمل مع 8 ملغ / لتر من هيدروكلوريد فانكومايسين.
      2. لإثراء السالمونيلا.، إضافة 20 مل من BPW تستكمل مع الملحق السالمونيلا (4 مل / لتر).
      3. لإثراء L. المستوحدة، إضافة 20 مل من فيداس UP الليستيريا (LPT) مرق.
      4. للتخصيب غير انتقائي في وقت واحد لجميع الكائنات الحية الدقيقة الثلاث باستخدام MMS واحد، استخدم العالمية مرق preenrichment (UPB).
   2. المسمار غطاء MMS مرة أخرى على بإحكام. تأكد من أن صنابير وتوج بإحكام لتجنب تسرب وتلوث محتمل خلال تخصيب اليورانيوم.
   3. احتضان MMS لمدة تصل إلى 18-24 ساعة في حاضنة تهتز في 200 دورة في الدقيقة. استخدام 42 درجة مئوية لمدة E. كولاي والسالمونيلا. التخصيب انتقائية. استخدام 30 درجة مئوية لمدة L. المستوحدة تخصيب انتقائية، واستخدام 37 & #176؛ C لتخصيب غير انتقائية.
2. تحضير العينة
   1. عند اكتمال الحضانة، وإزالة MMS من الحاضنة، إرفع قبعة واحدة من صنابير، والاستغناء بلطف حوالي 0.5 مل في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. بدلا من ذلك، فك MMS وماصة من 0.5 مل من تخصيب بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: إذا تم استخدام الإصدار القابل للتصرف لا من الكاسيت MMS، ماصة 0.5 مل من تخصيب من الكيس.
   2. لتحليل اللونية من E. القولونية تخصيب انتقائية، أو لتحليل التخصيب غير انتقائية، يصوتن 0.5 مل من التخصيب في 5 W، 22 كيلو هرتز لمدة 20 ثانية باستخدام sonicator التحقيق.

3. إعداد وتضمينها من ركائز اللونية في μPADs

1. إعداد ما يكفي من μPADs لكل عينة والهدف اختبارها. للكشف عن E. القولونية إعداد CPRG وX-الحلاوة μPADs، على السالمونيلا. الكشف عن إعداد μPADs MC، وL. monocytكشف ogenes إعداد μPADs X-الشرطة الوطنية العراقية.
   1. إعداد العازلة HEPES [0.1 M HEPES مع 0.1٪ الأبقار مصل الزلال (BSA)] لركائز اللونية وضبط درجة الحموضة من المخزن المؤقت وفقا لالركيزة التي على وشك أن يستخدم: 7.5 درجة الحموضة لإعداد CPRG أو X-الحلاوة، الرقم الهيدروجيني 9 للمولودية، ودرجة الحموضة 7 لX-الشرطة الوطنية العراقية.
   2. إعداد الحلول الأسهم من ركائز في درجة الحموضة تعديلها العازلة HEPES بتركيزات 3 ملي (CPRG)، 62.5 ملم (X-الحلاوة)، 15 مم (MC)، و 100 ملي (X-الشرطة الوطنية العراقية). حماية حلول الأسهم من الضوء.
   3. وضع μPADs داخل طبق بتري معقمة، ثم يسجي على microspot μPAD مع 24 ميكرولتر من كل الركيزة محلول المخزون.

4. كشف وتحليل البيانات

1. كشف
   1. إضافة 6 ميكرولتر من العينة المخصب إلى كل microspot μPAD المناسبة الواردة في طبق بتري.
   2. ضع الغطاء الخلفي على طبق بتري وختم ذلك مع parafilm.
   3. احتضان العينةمع μPAD عند 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 ساعة للسماح للتنمية اللون وجفاف microspots.
2. الفحص البصري للنتائج
   1. تنفيذ الكشف عن طريق التفتيش البصري البسيط للتغيرات لون μPADs.
      ملاحظة: بشكل عام، من المتوقع أن تنتج ردود فعل قوية يتغير لون نهائي التالية 18-24 ساعة من التخصيب، والتي ينبغي أن تغني عن الحاجة إلى مزيد من التوضيح وينبغي النظر الإيجابية.
   2. تحديد وجود E. القولونية عينة إيجابية من خلال مراقبة microspots جعلهما مع تغير CPRG من الأصفر إلى الأحمر البنفسجي وmicrospots جعلهما مع تغير X-الحلاوة من عديم اللون إلى اللون الأزرق والأخضر.
   3. تحديد وجود L. المستوحدة عينة إيجابية من خلال مراقبة microspots جعلهما مع تغير X-الشرطة الوطنية العراقية من عديم اللون إلى النيلي.
   4. تحديد وجود النيابة السالمونيلا. عينة إيجابية من خلال مراقبة microspots جعلهما مع تغير MC من عمودorless إلى الأرجواني والبنفسجي.
3. البرمجيات بمساعدة تحليل البيانات
   ملاحظة: أجريت لتحديد ما إذا كانت ردود الفعل بوضوح ضعف إيجابية أو سلبية، وتمكين تحليل شبه الكمي للنتائج.
   1. السماح للμPADs لتجف تماما.
   2. مسح μPAD باستخدام ماسح ضوئي سرير مسطح.
   3. استخدام البرمجيات يماغيج لمعالجة الصورة.
      1. "فتح" الصورة الممسوحة ضوئيا ليتم تحليلها في ImageJ تقع تحت "ملف" علامة على القائمة الرئيسية (أو اضغط على "CLT + O").
      2. عكس الصورة اختيار "عكس" الموجود تحت "تحرير" علامة على القائمة الرئيسية (أو اضغط على "CLT + شيفت + I").
      3. استخدام "تحليل" علامة على القائمة الرئيسية واختيار "مجموعة المقاييس ..." لتحديد قياسات ذكرت تحليلها.
      4. تأكد من أن "كثافة رمادي متوسط"، "الحد الى عتبة" و "مربعات التسمية العرض" هيفحص، ثم اضغط على "موافق". هذا يحدد كيف البرنامج يحلل كل المنطقة المحددة وكيف يفيد ذلك.
      5. استخدام "البيضاوي" أداة لرسم دائرة التي تحدد المنطقة التي تريد لقياس الداخل.
      6. تحت عنوان "تحليل" التبويب حدد "القياس" (أو اضغط على "CLT + M"). يقوم البرنامج قياس متوسط ​​كثافة اللون الرمادي ضمن المنطقة المحددة ورفع تقرير بذلك في شاشة المنبثقة التي يمكن نسخها ولصقها على التفوق لمزيد من التحليل.
         ملاحظة: للحصول على تحليلات أكثر دقة، ويجب أن يتم تنفيذ اثنين على الأقل مكررات التقنية لكل عينة.

النتائج

كما هو موضح في هذا البروتوكول، وتركيز البكتيريا باستخدام رسائل الوسائط المتعددة (الشكل 1) لا يمكن أن يؤديها في حوالي 15-20 دقيقة. وMMS في شيدت من الستايرين الأكريلونيتريل (ABS) في اثنين من مكونات منفصلة؛ غطاء وخرطوشة على حد سواء مع التجمع حنفية دمجها والتي يتم إدرا...

Discussion

يصف هذا البروتوكول وسيلة متكاملة للكشف عن E. القولونية، السالمونيلا، وL. المستوحدة في المياه الزراعية. هنا، وتركيز MMS البكتيريا كميات كبيرة من (10 لتر) من المياه للأغراض الزراعية، ويقترن مع تخصيب البكتيرية، والكشف اللونية بكتيريا الإرشادية باستخدام μPADs. الإجراء MM...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agricultural water			Irrigation water, produce wash water, well water, etc.
Vinyl tubing	Wilmar	BN-CVT1005	1/4" inner diameter,  3/8" outer diameter, available at:  http://www.wilmar.com
Modified Moore Swab cartridge	Lumiere Diagnostics		11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at:  http://www.lumierediagnostics.com.  Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text)
Cheesecloth	Chesapeake Wiper & Supply, Inc.	CC90	Grade #90, 44 x 36 weave, available at:  www.raglady.com
Household Bleach	Various		Sodium hypochlorite concentration approx. 6%
Sodium thiosulphate 5-hydrate	Mallinckrodt Baker Inc	8100-04
Manifold	Built in-house		Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings
Peristaltic pump	Micron Meters	RPP1300	Available at:  http://www.micronmeters.com
Serological pipette	Various		Disposable, 10 ml
Universal preenrichment broth	Difco	223510
Buffered peptone water	Difco	218105
Salmonella supplement	Biomérieux Industry	42650	http://www.biomerieux-usa.com
VIDAS UP Listeria (LPT) Broth	Biomérieux Industry	410848	http://www.biomerieux-usa.com
Vancomycin	Sigma-Aldrich	861987	http://www.sigmaaldrich.com
Pipet-Aid	Various		Drummond DP-110 used here
Shaking incubator	Various		Excella E25, New Brunswick Scientific used here
Micropipette	Various		10 μl, 1 ml
Micropipette tips	Various		Barrier, 10 μl, 1 ml
1.5 microcentrifuge tubes	Various		RNase- and DNase-free
Probe sonicator	Q Sonica LLC	XL-2000 series
µPADs	Avant		Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid]	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A8022
Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG)	Sigma-Aldrich	59767
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc)	Sigma-Aldrich	B8174
5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate)	Sigma-Aldrich	53451
5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP)	Sigma-Aldrich	38896
Petri dishes, polystyrene 100 mm by 15 mm	Various		Sterile
Flat bed scanner	Various		Xerox USB scanner
ImageJ software	National Institutes of Health		http://rsb.info.nih.gov/ij/