색도계 탐지의 종이 기반의<em&gt; 대장균</em&gt;<em&gt; 살모넬라</em&gt; SPP., 그리고<em&gt; 리스테리아</em&gt; 농업 다량의 물에서

요약

A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (µPAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.

초록

이 프로토콜은 농업 바다의 큰 볼륨에서 대장균, 살모넬라 종., 리스테리아 모노 사이토의 빠른 비색 검출 (10 L)에 대해 설명합니다. 여기에, 물은 박테리아를 집중, 플라스틱 카트리지로 둘러싸인 간단한 거즈 필터로 구성 멸균 수정 무어 면봉 (MMS)를 통해 필터링됩니다. 여과 후, 대상 박테리아에 대한 비 선택 또는 선택 enrichments는 MMS에서 수행됩니다. 대상 박테리아의 비색 검출을 위해, enrichments은 다음 박테리아 나타내는 기판에 내장 된 종이 기반의 분석 장치 (μPADs)를 사용하여 정량된다. 각각의 기판은 μPAD에 시각 (성적 검출)를 검출 할 수있다 착색 제품을 생성하는 목표 표시된 박테리아 효소와 반응한다. 대안 적으로, 반응 μPADs의 디지털 이미지는 일반적인 스캐닝 또는 사진 장치 생성 ImageJ에 소프트웨어, 알을 사용하여 분석 할 수있다결과를보다 객관적이고 표준화 된 해석 lowing. 생화학 검사 절차는 상기 세균 병원체를 확인하도록 설계되어 있지만, 효소 배경 미생물 또는 색채 기질의 분해에 의해 생성 된 경우에 가양가 발생할 수 있습니다. 따라서, 더 차별적 진단을 사용 확인이 필요하다. 그럼에도 불구하고,이 세균 농도 및 검출 플랫폼은 초기 검사 방법으로 사용을 정당화 (농도, 농축, 검출이 약 24 시간 내에서 수행된다), 저렴 (0.1 CFU / ㎖의 검출 한계)를 구분하기 쉬운, 그리고 급속 농업용 수의 미생물 학적 품질.

서문

그것은 인성 질병 에이전트가 식품 매개 질환의 부담을 줄이기 위해 필드 기반의 설정에서 신속하고 바람직하게 감지하는 것이 중요합니다. 인성 세균 병원균을 감지하는 일반적인 전략은 생화학 적 프로파일, 선택 및 차등 배양, 면역 분리 및 검출 및 분자 검출이 (가) 있습니다. 그러나, 이러한 방법은 산발적 인 오염에 의해 방해되고, 테스트 작은 샘플 크기는 인성 병원성 세균의 종종 낮은 농도는, 긴 처리 시간을 필요로, 및 / 또는 필드 설​​정을 적용 할 수 없습니다. 또한, 많은 음식 행렬의 화합물은 검출 및 진단 응용 프로그램을 억제합니다. 미생물 검출 가능성을 향상시키기 위해, 미국 식품 의약청 (예 세척수 관개 물 등) 농업용 수를 테스트하는 농산물의 큰 표면적과 접촉하거나 차량 역할도하는 것을 제안했다 P에 대한roduce 오염 식품 ¹ 직접 테스트에 대한 실행 가능한 대안이다. 그럼에도 불구하고, 대표 농업용 샘플의 희석 효과와 결합 종종 낮은 자연 병원균 부담 병원균 농도의 샘플 준비 방법이 중요합니다. 이러한 방법은 물 (≥ 10 L), 적절한 병원균 농도 및 다운 스트림 탐지 전략과의 호환성 많은 양의 샘플이 필요합니다.

수정 무어 면봉 (MMS)는 물 ^2-4의 큰 볼륨 (≥ 10 L)에서 박테리아를 집중 사용, 저렴, 간단하고 견고한 장치입니다. MMS는 연동 펌프를 사용하여 카세트를 통해 펌핑 다량의 물에 대한 거친 필터 역할을 거즈로 채워진 플라스틱 카세트로 구성되어 있습니다. MMS 처리 리 미생물 등의 유기 및 무기 미립자 물질을 포착 세균 농도 (≥ 10 배 농도)의 비 차별적 방법pond 지폐 샘플. 그것은 MMS 기준 대상 미생물 농도의 우수한 효능 미생물 실트 점토 분획 또는 부유 물질 ^(3)의 유기 미세 골재에 부착 될 것으로 예상된다는 사실에 의해 설명 될 수 있다는 가능성이있다. MMS의 견고한 설계는 필터의 막힘, 많은 양을 처리 할 수​​없는, 높은 탁도 필터 샘플 및 높은 비용 등의 물에서 세균의 캡처 및 농도에 대한 다른 여과 방법과 관련된 대부분의 단점을 극복 할 수 있습니다. 이러한 이유로, FDA는 MMS의 이용은 환경 및 생산 관련 샘플 수집 절차 ⁵ 공식 절차에 혼입되는 것이 추천된다.

여기서, 방법은 농도, 농축하고, 대장균의 검출, 살모넬라 종. 및 농업 워터스 리스테리아 대해 설명한다. MMS는 BACT의 농도에 사용되는eria, 또한 선택 또는 비 선택 세균 농축을위한 용기로 사용됩니다. 세균 검출은 종이 기반의 분석 장치 (μPADs) ^6를 사용하여 생화학 적으로 얻을 수있다. μPADs는 유체 네트워크 또는 포토 리소그래피, 잉크젯 인쇄, 스탬핑, 왁스가 ^7-11 인쇄 등의 다양한 방법을 사용하여 현장 시험으로 제조 할 수있다. 유체 디자인의 예는 시료 중심에 증착 된 이후에 샘플 또는 기판은 중심 ^(12)으로 모세관 작용에 의해 채널의 외측 저수지에서 뽑은되는 원위 저수지 또는 단일 채널 패턴으로 흐른다 수지상 채널 패턴 일 수있다. 이 프로토콜에 대한, 우리는 여기에서 테스트 한 미생물을 나타내는 효소에 의해 처리 할 수​​있는 발색 기판에 새겨 져 7 mm 직경의 왁스 종이 자리 배열에 사용하도록 선택했습니다 : 클로로 페놀 레드 β-D-갈 락토 (CPRG) 및 5 -에게 브로 모 -4 - 클로로 -3 - 인돌 릴의 β-D-글루 쿠로 니드 (X-Gluc)E.에 의해 생성 된 β-갈 락토시다 아제 및 β-글루 쿠로의 검출 대장균; 살모넬라 종에 의해 생성 된 C8-에스 테라 제의 발견을위한 5 - 브로 모 -6 - 클로로 -3 - 인돌 릴 카 프릴 (진홍색 카 프릴),. 포스파티딜 이노시톨 특이 적 포스 포 리파제 C의 검출 및 5 - 브로 모 -4 - 클로로 -3 - 인돌 릴-미오 - 이노시톨 포스페이트 (X-의 InP) (PI-PLC)에 의해 생성 L. ^{6 모노} 사이토 겐. 따라서, 특정 세균의 존재는 복잡한 장비 또는 데이터 해석을위한 필요없이 시각적으로 관찰 할 수있다. 이러한 특정 대상 세균의 효소 기반의 비색 μPAD 검출의 민감도와 특이도는 이전에 ^6을 탐구하고있다. 또한, 이들 목표 세균 집적 농도 검출 방법의 민감도는 미생물 (미발표 데이터 및 비샤 외. ^13)의 소정 레벨로 다량의 물 중에서 스파이 킹함으로써 평가 하였다.

프로토콜

MMS를 사용하여 농업 다량의 물에서 박테리아의 1. 집중

1. MMS 준비
   1. 40 × 12 센티미터 크기의 4 겹의 무명천의 사각형 부분을 잘라냅니다.
   2. 20 × 6 cm의 사각형을 얻기 위해 두 축을 따라 투박한을 접습니다.
   3. 높이 약 6cm, 지름 3cm의 원통형 면봉을 형성하기 위해 단단히 긴 축을 따라 투박한을 굴립니다.
   4. 알루미늄 호일의 투박한 면봉을 압력솥, 카세트를 압력솥하지 않습니다. 10 %의 가정용 표백제에 30 분 정도 담가 카세트의 오염을 제거하고, 티오 황산나트륨 오수화물 (나 ₂ S ₂ O ₃ · 5H ₂ O) 용액 (50 ㎎ / L에서 15 분 동안 카세트를 담가 잔류 염소를 비활성화 ) 멸균 제조.
   5. MMS 카세트에 면봉을 삽입합니다.
      NOTE : MMS 카세트의 일회용이 아닌 버전을 사용하는 경우, 무명천의 4 겹의 시트를 시작하는 날80 X 22cm를 asuring, 40 X 11cm로 접어 직경 약 11 ㎝ 높이와 6cm 실린더를 형성하기를 굴립니다.
   6. MMS를 조립합니다.
   7. 튜브가 완전히 스피을 준수 보장, MMS의 양쪽에 스피에 비닐 튜브를 연결하고 연동 펌프로 튜브를 고정합니다. 연동 펌프의 튜브 상류 샘플링을위한 충분한 길이가 있는지 확인합니다.
2. 박테리아의 농도
   1. 고속 연동 펌프를 실행하여 농업용 수의 샘플 적어도 10 L.
   2. 샘플링이 완료되면, 물 샘플에서 연동 펌프 유입구를 철회하고 제공된 배출수는 MMS를 종료 관찰되지 않을 때까지 펌프를 계속 실행.
   3. 매니 폴드가 동시에 여러 샘플을 실행하는 데 사용되는 경우, 각 MMS의 유출 물을 수집하고, 10 L은 단일 MMS를 통해 여과 될 때 해당 특정 MMS위한 밸브를 닫고 펌프를 계속 실행.
      1. 나는 샘플링 할 때완료들, 농업 물에서 연동 펌프의 입구를 철회 매니 폴드의 모든 밸브를 열고 아무 유출 물이 MMSS을 종료 관찰 될 때까지 펌프를 계속 실행.
3. 농도는 모두 MMSS 대해 완료되면, 정중 MMS의 스피에서 비닐 호스를 분리하고 MMS 양쪽 스피 캡. 단단히 캡핑 MMS는 농축 미디어를 추가하기 전에 최대 12 시간 동안 저장 될 수있다.

2. MMS 농축 및 시료 전처리

1. 심화
   1. MMS의 뚜껑을 나사를 풀고, 무균 적절한 멸균 농축 국물 20 ㎖를 추가합니다. 각각의 선택적 농축에 대해 하나의 MMS를 사용합니다. 또한, 동일한 샘플에 세 대상 박테리아를 전파하는 비 선택적 농축을 수행합니다.
      NOTE : MMS 카세트의 일회용이 아닌 버전이 사용되는 경우, 무균 카세트에서 무명천 필터를 제거하고 광고 전에 멸균 봉지에 배치적절한 농축 미디어의 딩 225 ML.
      1. E.의 농축을위한 대장균, 반코마이신 염산염 8 ㎎ / L로 보충 완충 펩톤 수 (BPW) 20 ㎖를 추가합니다.
      2. 살모넬라 종의 농축을 위해., BPW 20 ㎖ 살모넬라 균의 보충 (4 ㎖ / L)로 보충을 추가합니다.
      3. L.의 농축을위한 모노 사이토는 VIDAS UP 리스테리아 (LPT) 국물 20 ㎖를 추가합니다.
      4. 하나의 MMS를 사용하여 세 가지 미생물을 동시에 비 선택적 농축을 위해, 보편적 preenrichment 국물 (UPB)를 사용합니다.
   2. 다시 단단히에 MMS의 덮개를 고정합니다. 스피 단단히 농축 동안 유출 및 오염 가능성을 방지하기 위해 덮인되어 있는지 확인합니다.
   3. 200 rpm에서 진탕 배양기에서 최대 18 ~ 24 시간 동안 MMS를 품어. E. 42 °의 C를 사용 대장균과 살모넬라 종. 선택적 enrichments. L. 30 °의 C를 사용 모노 사이토 선택적 농축, 사용 37 & #176, 비 선택적 농축을위한 C.
2. 샘플 준비
   1. 배양이 완료되면, 인큐베이터에서 MMS를 제거 스피 중 하나를 덮개를 벗기다, 부드럽게 1.5 ML microcentrifuge 관에 약 0.5 ml의 분배. 또한, 중 MMS 피펫 0.5 밤새 농축 ML을 풉니 다.
      NOTE : MMS 카세트의 일회용없는 버전이 사용되는 경우, 백에서 농축 0.5 ㎖를 피펫.
   2. E.의 비색 분석 콜라이 선택적 농축하거나 비 선택적 enrichments의 분석을 위해, 5 W, 프로브 초음파기를 사용하여 20 초 동안 22 kHz에서 농축 0.5 ㎖ 초음파 처리.

μPADs 3. 준비 및 발색 기질의 임베딩

1. 각 시험 샘플 및 대상에 대한 충분한 μPADs를 준비합니다. E.를 검출 대장균 살모넬라 종에 대해, CPRG 및 X-Gluc μPADs를 준비합니다. 탐지는 MC의 μPADs을 준비하고, L.에 대한 monocytogenes 검출은 X-의 InP μPADs를 준비합니다.
   1. HEPES 버퍼를 준비 비색 기판에 대한 [0.1 M 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)와 HEPES]를 사용하는 것입니다 기판에 따라 버퍼의 pH를 조정한다 : CPRG 또는 X-Gluc의 준비를위한 pH가 7.5, MC에 대한 pH가 9 및 X-InP를위한 pH가 7.
   2. pH의 기판의 주식 솔루션을 준비 3 MM (CPRG), 62.5 밀리미터 (X-Gluc), 15 MM (MC), 100 ㎜ (X-의 InP)의 농도 HEPES 버퍼를 조정. 빛에서 주식 솔루션을 보호합니다.
   3. 각 기판 원액 24 μL로 μPAD의 microspot를 끼워 넣다, 멸균 페트리 접시 안에 μPADs를 놓습니다.

4. 검색 및 데이터 분석

1. 검출
   1. 페트리 접시에 포함 된 각 해당 μPAD의 microspot에 풍부한 샘플의 10 μl를 추가합니다.
   2. 페트리 접시의 뚜껑을 다시 놓고 파라 필름으로 밀봉.
   3. 샘플을 품어microspots의 발색과 건조를 허용 할 최대 3 시간 동안 37 ° C에서 μPAD와.
2. 결과의 육안 검사
   1. μPADs의 색깔 변화의 간단한 육안 검사로 검출을 수행합니다.
      참고 : 일반적으로, 최종 색상의 변화를 생성 강한 반응은 추가 설명의 필요성을 사전에 제거해야하며, 긍정적 인 고려되어야한다 농축의 18 ~ 24 시간, 다음 예상된다.
   2. E.의 존재를 결정 붉은 보라색과 파란색 - 녹색 무색에서 X-Gluc 변화에 박혀있는 걸 microspots 노란색에서 CPRG 변화에 박혀있는 걸 microspots을 관찰하여 대장균 양성 샘플.
   3. L.의 존재를 결정 무색에서 인디고에 X-InP의 변화에 박혀있는 걸 microspots을 관찰하여 긍정적 인 샘플 모노 사이토 겐.
   4. 살모넬라 종의 존재를 확인합니다. COL에서 MC 변화에 박혀있는 걸 관찰 microspots으로 긍정적 인 샘플자주색 자주 빛에 orless.
3. 소프트웨어를 돕는 데이터 분석
   참고 : 분명히 약한 반응이 양 또는 음의 여부를 확인하고 그 결과의 반 정량 분석​​을 가능하게 하였다.
   1. μPADs가 완전히 건조 할 수 있습니다.
   2. 플랫 베드 스캐너를 사용하여 μPAD를 스캔합니다.
   3. 이미지를 처리​​하기 위해 ImageJ에 소프트웨어를 사용합니다.
      1. 메인 메뉴 (누르거나 "CLT + O")에서 "파일"탭 아래에있는 ImageJ에 분석 할 수있는 스캔 한 이미지를 "열기".
      2. ( "CLT는 + + I 시프트"를 누르거나) 주 메뉴에서 '편집'탭 아래에있는 "반전"을 선택하여 이미지를 반전.
      3. 주 메뉴에서 "분석"탭을 사용하여 분석보고 된 측정을 선택하려면 "설정 측정 ..."를 선택합니다.
      4. 반드시 "평균 회색 강도", "임계 값 제한 확인하십시오"와 "표시 레이블"상자는확인하고 Enter 키를 눌러 "OK."이 소프트웨어가 선택한 각 영역을 분석하는 방법을 설정하는 방법과 그것을보고합니다.
      5. 당신이 내 측정 할 영역을 설명 원을 그리려면 "타원형"도구를 사용합니다.
      6. "분석"탭에서 "측정"(누르거나 "CLT + M")를 선택합니다. 이 소프트웨어는 정의 된 영역 내에서의 평균 회색 강도를 측정 및 복사 및 추가 분석을 위해 엑셀에 붙여 넣을 수있는 팝업 화면을보고합니다.
         참고 :보다 정확한 분석을 위해, 각각의 샘플의 적어도 두 기술은 복제가 수행되어야한다.

결과

이 프로토콜에 설명 된 바와 같이, MMS를 사용하여 세균의 농도 (도 1)은 약 15 ~ 20 분 내에 수행 될 수있다. 두 개의 분리 된 구성 요소에 아크릴로 니트릴 부타디엔 스티렌 (ABS)로부터 구성에서 MMS; 원통형 무명천 면봉가 삽입되는 집적 마개 조립체 (도 1a)와 양쪽 덮개와 카트리지. 두 구성 요소는 다음 함께 MMS (그림 1B)를 형성 망했다. MMS 기반 처리는 필드 설​?...

토론

이 프로토콜은 E.를 검출하기위한 통합 방법을 개시 대장균, 살모넬라 균의 종., 그리고 L. 농업 물에 리스테리아 모노 사이토 겐. 여기에, 농업용 수의 큰 볼륨에서 박테리아의 MMS 농도 (10 L)을, 세균 농축과 결합하고, 세균성 나타내는 색채 감지 μPADs을 사용하고 있습니다. 세균 10 배 집중하는 동안 MMS 절차는 물 시료에서 높은 미립자 내용에 대응할 수있는 강력하고 최?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agricultural water			Irrigation water, produce wash water, well water, etc.
Vinyl tubing	Wilmar	BN-CVT1005	1/4" inner diameter,  3/8" outer diameter, available at:  http://www.wilmar.com
Modified Moore Swab cartridge	Lumiere Diagnostics		11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at:  http://www.lumierediagnostics.com.  Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text)
Cheesecloth	Chesapeake Wiper & Supply, Inc.	CC90	Grade #90, 44 x 36 weave, available at:  www.raglady.com
Household Bleach	Various		Sodium hypochlorite concentration approx. 6%
Sodium thiosulphate 5-hydrate	Mallinckrodt Baker Inc	8100-04
Manifold	Built in-house		Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings
Peristaltic pump	Micron Meters	RPP1300	Available at:  http://www.micronmeters.com
Serological pipette	Various		Disposable, 10 ml
Universal preenrichment broth	Difco	223510
Buffered peptone water	Difco	218105
Salmonella supplement	Biomérieux Industry	42650	http://www.biomerieux-usa.com
VIDAS UP Listeria (LPT) Broth	Biomérieux Industry	410848	http://www.biomerieux-usa.com
Vancomycin	Sigma-Aldrich	861987	http://www.sigmaaldrich.com
Pipet-Aid	Various		Drummond DP-110 used here
Shaking incubator	Various		Excella E25, New Brunswick Scientific used here
Micropipette	Various		10 μl, 1 ml
Micropipette tips	Various		Barrier, 10 μl, 1 ml
1.5 microcentrifuge tubes	Various		RNase- and DNase-free
Probe sonicator	Q Sonica LLC	XL-2000 series
µPADs	Avant		Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid]	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A8022
Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG)	Sigma-Aldrich	59767
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc)	Sigma-Aldrich	B8174
5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate)	Sigma-Aldrich	53451
5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP)	Sigma-Aldrich	38896
Petri dishes, polystyrene 100 mm by 15 mm	Various		Sterile
Flat bed scanner	Various		Xerox USB scanner
ImageJ software	National Institutes of Health		http://rsb.info.nih.gov/ij/