Farbmetrische Papierbasierte Erkennung von<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonellen</em&gt; Spp. Und<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Von großen Mengen von Landwirtschaftliche Wasser

Zusammenfassung

A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (µPAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt schnellen kolorimetrischen Nachweis von Escherichia coli, Salmonella spp. Und Listeria monocytogenes aus großen Volumina (10 l) der landwirtschaftlichen Wasser. Hier wird das Wasser durch sterile Tupfer Modified Moore (MMS), die eine einfache Gewebefilter in einem geschlossenen Kunststoffpatrone aus filtriert, um Bakterien zu konzentrieren. Nach der Filtration sind nicht-selektive oder selektive Anreicherungen für die Ziel Bakterien in der MMS durchgeführt. Zum kolorimetrischen Nachweis der Target-Bakterien sind die Anreicherungen dann unter Verwendung von Papier-basierten Analysevorrichtungen (μPADs) mit Bakterien-Richt Substrate eingebettet getestet. Jedes Substrat reagiert mit dem Ziel anzeigenden bakteriellen Enzymen, die Erzeugung farbigen Produkte auf dem μPAD visuell (qualitativer Nachweis) detektiert werden kann. Alternativ können digitale Bilder der umgesetzten μPADs mit gemeinsamen Scannen oder fotografische Geräte erzeugt und mit ImageJ-Software, al analysiert werdengende für mehr objektive und standardisierte Interpretation der Ergebnisse. Obwohl die biochemischen Screening-Verfahren wurden entwickelt, um die oben genannten bakteriellen Krankheitserregern zu identifizieren, kann in einigen Fällen durch Enzyme Hintergrund Mikrobiota oder den Abbau der farbmetrischen Substraten ein falsch positives zu produzieren. Daher Bestätigung mit einem diskriminierender Diagnose erforderlich ist. Dennoch ist diese Bakterienkonzentration und Detektionsplattform preiswerte, empfindliche (0,1 CFU / ml Nachweisgrenze), leicht durchzuführen und eine schnelle (Konzentration, Anreicherung und Nachweis innerhalb von etwa 24 Stunden durchgeführt wird), rechtfertigen ihre Verwendung als ein Anfangsscreeningverfahren für die mikrobiologische Qualität der landwirtschaftlichen Wasser.

Einleitung

Es ist wichtig, dass lebensmittelbedingten Krankheitserreger schnell und vorzugsweise im Bereich der Basis-Einstellungen, um die Belastung der Lebensmittelerkrankungen reduzieren erkannt. Gemeinsame Strategien, um lebensmittelbedingten bakteriellen Krankheitserregern erkennen sind biochemische Profiling, selektiven und differentiellen Kultivierung, Isolierung und immunologische Nachweis und molekulare Erkennung. Allerdings sind diese Methoden durch sporadische Kontamination behindert, getestet kleinen Stichproben, die oft geringen Konzentrationen der lebensmittelbedingten pathogenen Bakterien, lange Bearbeitungszeiten, und / oder sind nicht für Feldeinstellungen. Ferner können Verbindungen, in vielen Nahrungs Matrizen hemmend Erkennung und Diagnostik. Um die Wahrscheinlichkeit von mikrobiellen Erkennung verbessern, hat die US-amerikanischen Food and Drug Administration vorgeschlagen, dass die Prüfung der landwirtschaftlichen Wasser (wie z. B. Waschwasser und Bewässerung), die entweder in Kontakt mit einer großen Oberfläche von frischen Produkten oder dient als Vehikel produce Kontamination ist eine praktikable Alternative zur direkten Prüfung von Lebensmitteln ^ein. Auch so macht der oft geringen natürlichen Erreger-Belastung verbunden mit der Verdünnungseffekt des repräsentativen landwirtschaftlichen Wasserprobe Probenvorbereitungsverfahren für Erreger-Konzentration wesentlich. Ein solches Verfahren würde erfordern Abtasten großer Wassermengen (≥ 10 L), angemessene pathogen-Konzentration und Kompatibilität mit nachgeschalteter Nachweisstrategien.

Geändert Moore Tupfer (MMS) sind preiswert, einfach und robuste Geräte für die Konzentration von Bakterien große Mengen (≥ 10 l) Wasser ^2-4 verwendet. Der MMS besteht aus einer Kunststoffkassette mit Gaze, die als Grobfilter für große Wassermengen durch die Kassette unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe gepumpt dient gefüllt. Die MMS ist eine nicht-diskriminierende Methode der Bakterienkonzentration (≥ 10 fache Konzentration), die organischen und anorganischen Partikelmaterial erfasst einschließlich Mikroorganismen in verarbeiteten liquid Proben. Es ist wahrscheinlich, dass die ausgezeichnete Wirksamkeit der Konzentration der Ziel-Mikroorganismen durch den MMS kann durch die Tatsache, dass Mikroorganismen sollen zu dem Schluff-Lehm-Fraktion oder organische Mikroaggregate der suspendierten Feststoffe ³ befestigt werden erläutert. Das robuste Design des MMS können für die Überwindung meisten Mängel mit anderen Filtrationsverfahren für die Erfassung und Konzentration von Bakterien aus Wasser, wie das Verstopfen von Filtern, die Unfähigkeit, große Mengen zu verarbeiten, Filterproben mit hoher Trübung und hohen Kosten verbunden. Aus diesen Gründen wird die FDA empfiehlt, dass die MMS in offiziellen Verfahren für Umwelt-und produzieren bezogenen Probensammelverfahren ⁵ eingearbeitet werden.

Hier wird ein Verfahren zur Konzentration, Anreicherung und den Nachweis von Escherichia coli, Salmonella spp. Und Listeria monocytogenes aus landwirtschaftlichen Wasser beschrieben. Eine MMS ist für die Konzentration von bact verwendetEria, und dient auch als Behälter für die selektive oder nicht selektive Bakterienanreicherung. Nachweis von Bakterien biochemisch mit Papier-basierten Analysegeräte (μPADs) ⁶ gelöst. μPADs als fluidische Netzwerke oder Spot-Tests mit einer Vielzahl von Verfahren der Photolithographie, Tintenstrahldruck, Stanz-, und Wachsdruck ^7-11 hergestellt werden. Beispiele von Fluid Motive können dendritische Kanalmuster, wo die Probe in der Mitte abgeschieden und fließt anschließend zu dem distalen Reservoirs oder Einzelkanalmuster in der die Probe oder das Substrat von der äußeren Reservoirs der Kanal durch Kapillarwirkung in der Mitte ¹² herausgezogen werden. Aus diesem Protokoll, die wir gewählt haben, um für 7-mm-Durchmesser Wachs-Papier-Spot-Arrays mit chromogenen Substraten eingebettet, die durch Enzyme, die auf den hier getesteten Mikroorganismen verarbeitet werden können, beschäftigen: Chlorphenolrot β-D-galactopyranosid (CPRG) und 5 - Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-glucuronid (X-Gluc)für den Nachweis von β-Galactosidase und β-Glucuronidase von E. hergestellt coli; 5-Brom-6-chlor-3-indolyl Caprylat (magenta Caprylat) zum Nachweis von C8-Esterase von Salmonella spp. und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-myo-inositol-phosphat (X-InP) für die Detektion von Phosphatidylinositol-spezifischer Phospholipase C (PI-PLC) von L. hergestellt ^{monocytogenes-6.} Somit kann das Vorhandensein eines bestimmten Bakteriums visuell ohne die Notwendigkeit für komplexe Anlagen oder die Interpretation der Daten zu beobachten. Die Spezifität und Sensitivität der Enzymbasis μPAD kolorimetrischen Detektion dieser spezifischen Zielbakterien zuvor erforscht worden ^6. Zusätzlich wurde die Empfindlichkeit der integrierten Konzentrationsnachweisverfahren für diese Zielbakterien durch Aufstocken von großen Volumina von Wasser mit vorbestimmten Mengen an Mikroorganismen (unveröffentlichte Daten und Bisha et al. ¹³⁾ ausgewertet.

Protokoll

1. Konzentration der Bakterien aus großen Mengen von Landwirtschaftliche Wasser Mit MMS

1. MMS Vorbereitung
   1. Schneiden Sie einen rechteckigen Querschnitt von 4-lagige Gaze 40 x 12 cm.
   2. Falten Sie die Gaze an beiden Achsen, um ein Rechteck von 20 x 6 cm erhalten.
   3. Rollen Sie die Gaze dicht entlang seiner Längsachse um einen zylindrischen Tupfer von ca. 6 cm hoch und 3 cm im Durchmesser bilden.
   4. Autoklavieren die Gaze Tupfer in Aluminium-Folie, nicht die Kassette im Autoklaven. Dekontaminieren Kassette durch Eintauchen für 30 min in 10% Haushaltsbleichmittel, und Deaktivieren des restlichen Chlors durch Einweichen der Kassette für 15 min in einer Natriumthiosulfat-Pentahydrat (Na ₂ S ₂ O ₃ · 5H ₂ O)-Lösung (50 mg / L in sterilem Wasser).
   5. Legen Sie den Tupfer in die MMS-Kassette.
      HINWEIS: Wenn die nicht-Wegwerf-Version des MMS-Kassette verwendet wird, mit einem 4-Blattlage Gaze beginnen michasuring 80 x 22 cm, falten Sie es auf 40 x 11 cm und rollen Sie es zu einem Zylinder etwa 11 cm hoch und 6 cm im Durchmesser bilden.
   6. Montieren Sie die MMS.
   7. Bringen Vinylschlauch mit Zapfen auf beiden Seiten der MMS, die Gewährleistung der Schlauch voll haftet an den Zapfen, und fixieren Schlauch in die Schlauchpumpe. Sicherzustellen, dass die Rohrleitung stromaufwärts von der peristaltischen Pumpe eine ausreichende Länge für die Probenahme.
2. Konzentration der Bakterien
   1. Probe mindestens 10 l Wasser landwirtschaftlichen indem die peristaltische Pumpe mit hoher Geschwindigkeit.
   2. Nach Abschluss der Probenahme ist, ziehen Sie die Schlauchpumpe Einlass aus der Wasserprobe und weiter laufen, bis die Pumpe kein Abwasser beobachtet Verlassen des MMS.
   3. Wenn ein Verteiler wird verwendet, um mehrere Proben gleichzeitig laufen, sammeln das Abwasser von je MMS, und wenn 10 L wird durch eine einzige MMS gefiltert schließen Sie das Ventil für diese bestimmte MMS und weiterlaufen die Pumpe.
      1. Bei der Beprobung is abgeschlossen ist, ziehen Sie die Schlauchpumpe Einlass von der landwirtschaftlichen Wasser, öffnen alle Ventile des Verteilers und die Pumpe läuft weiter, bis kein Abwasser beobachtet Verlassen des MMS.
3. Wenn die Konzentration wurde für alle MMS abgeschlossen ist, entfernen Sie vorsichtig die Vinyl-Schläuche von den MMS-Zapfen und der Kappe die Zapfen an beiden Seiten der MMS. Dicht verschlossen MMS kann für bis zu 12 h vor der Zugabe Anreicherungsmedien gespeichert werden.

2. MMS Anreicherung und Probenvorbereitung

1. Bereicherung
   1. Schrauben Sie den Deckel der MMS, und aseptisch 20 ml des geeigneten sterilen Anreicherungsbouillon. Verwenden Sie eine MMS für jede selektive Anreicherung. Alternativ führen eine nicht-selektive Anreicherung, alle drei Zielbakterien in der gleichen Probe zu propagieren.
      HINWEIS: Wenn die nicht-Wegwerf-Version des MMS-Kassette verwendet wird, aseptisch entfernen Gaze-Filter aus der Kassette und legen Sie in einem sterilen Beutel vor Anzeigeding 225 ml des entsprechenden Anreicherungsmedien.
      1. Zur Anreicherung von E. coli, 20 ml gepuffertes Peptonwasser (BPW) mit 8 mg / l Vancomycin-Hydrochlorid ergänzt.
      2. Zur Anreicherung von Salmonella spp., 20 ml BPW, ergänzt mit der Salmonellen-Ergänzung (4 ml / L).
      3. Zur Anreicherung von L. monocytogenes, 20 ml VIDAS UP Listeria (LPT) Brühe.
      4. Für den gleichzeitigen Nicht-selektive Anreicherung für alle drei Mikroorganismen mit Hilfe eines einzigen MMS, Universal Voranreicherung Brühe (UPB).
   2. Schrauben Sie den Deckel der MMS wieder fest. Stellen Sie sicher, dass die Zapfen sind fest verschlossen, um Verschmutzungen und mögliche Kontamination während der Anreicherung zu vermeiden.
   3. Die MMS inkubieren bis zu 18-24 Stunden in einem Schüttelinkubator bei 200 UpM. Verwenden Sie 42 ° C für E. coli und Salmonella spp. selektive Anreicherung. Verwenden Sie 30 ° C für L. monocytogenes selektive Anreicherung und verwenden 37 & #176, C für nicht-selektive Anreicherung.
2. Probenvorbereitung
   1. Wenn Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie die MMS aus dem Inkubator, uncap einer der Zapfen, und sanft zu verzichten etwa 0,5 ml in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Alternativ lösen Sie die MMS-und Pipette aus 0,5 ml über Nacht Bereicherung.
      HINWEIS: Wenn die nicht-Wegwerf-Version des MMS-Kassette verwendet wird, pipettiert 0,5 ml der Anreicherung aus der Tasche.
   2. Für farbmetrische Analyse von E. coli selektive Anreicherung oder für die Analyse von nicht-selektiven Anreicherung, beschallen 0,5 ml Anreicherungs bei 5 W, 22 kHz für 20 sec unter Verwendung einer Ultraschallsonde.

3. Vorbereitung und Einbetten von Farbmetrische Substrate in μPADs

1. Vorbereitung genug μPADs für jede Probe und Ziel getestet. Um zu erkennen, E. coli vorzubereiten CPRG und X-Gluc μPADs, Salmonella spp. Erkennung vorzubereiten MC μPADs und für L. monocytogenes Erkennung bereiten X-InP μPADs.
   1. Vorbereitung HEPES-Puffer [0,1 M HEPES mit 0,1% Rinderserumalbumin (BSA)] für die kolorimetrische Substrate und der pH-Wert des Puffers nach dem Substrat, die gehen, verwendet werden: pH 7,5 für die Herstellung von CPRG oder X-Gluc, pH 9 für MC und pH 7 für X-InP.
   2. Stammlösungen der Substrate im pH HEPES-Puffer bei Konzentrationen von 3 mM (CPRG), 62,5 mM (X-Gluc), 15 mM (MC), 100 mM (X-InP). Schützen Sie die Stammlösungen aus Licht.
   3. Legen Sie die μPADs in einer sterilen Petrischale, die dann einbetten μPAD Mikrospots mit 24 ul jedes Substrat-Stammlösung.

4. Erkennung und Datenanalyse

1. Entdeckung
   1. In 6 ul der Probe angereichert mit jedem geeigneten μPAD Mikrospots in einer Petrischale enthalten.
   2. Legen Sie die Abdeckung wieder auf die Petrischale und verschließen Sie diese mit Parafilm.
   3. Inkubierenmit der μPAD bei 37 ° C für 3 h bis zur Farbentwicklung und Trocknung der Mikrospots zu ermöglichen.
2. Visuelle Prüfung der Ergebnisse
   1. Führen Erfassung durch einfache visuelle Prüfung der Farbänderungen der μPADs.
      HINWEIS: In der Regel sind starke Reaktionen, die endgültige Farbveränderungen erzeugen nach 18-24 Stunden der Bereicherung, die die Notwendigkeit zur weiteren Klärung zu vermeiden sollte und was als positiv erwartet.
   2. Bestimmung der Anwesenheit eines E. coli positive Probe durch Beobachtung Mikrospots mit CPRG Umschlag von gelb nach rot-violett und Mikrospots mit X-Gluc Umschlag von farblos nach blau-grün eingebettet eingebettet.
   3. Bestimmen Sie die Anwesenheit eines L. monocytogenes-positiven Probe durch Beobachtung Mikrospots mit X-InP Umschlag von farblos nach indigo eingebettet.
   4. Bestimmung der Gegenwart von Salmonella spp. positive Probe durch Beobachtung Mikrospots mit MC Wechsel von col eingebettetorless bis violett-lila.
3. Aided Software Data Analysis
   HINWEIS: geführt, um eindeutig festzustellen, ob schwache Reaktionen positiv oder negativ sind und eine semi-quantitative Analyse der Ergebnisse zu ermöglichen.
   1. Lassen Sie die μPADs vollständig trocken.
   2. Scannen Sie den μPAD mit einem Flachbett-Scanner.
   3. Verwenden Sie ImageJ-Software, um das Bild zu verarbeiten.
      1. "Öffnen", um das gescannte Bild in ImageJ unter dem Reiter "Datei" im Hauptmenü (oder drücken Sie "Clt + O") befindet analysiert werden.
      2. Kehren Sie die Bildauswahl "Invert" unter der Registerkarte "Bearbeiten" im Hauptmenü befindet (oder drücken Sie "Clt + Shift + I").
      3. Verwenden Sie die Registerkarte "Analysieren" im Hauptmenü und wählen Sie "Set Maße ...", um die gemeldeten Messungen analysiert auswählen.
      4. Stellen Sie sicher, dass die "mittlere Intensität grau", "Limit to Schwelle" und "Display Label"-Boxen sindüberprüft, und drücken Sie "OK". Dieser legt fest, wie die Software analysiert jedes Bereich ausgewählt und wie sie es Berichte.
      5. Verwenden Sie das "Oval"-Tool, um einen Kreis, der den Bereich, den Sie innerhalb messen wollen skizziert ziehen.
      6. Unter dem Reiter "Analyze" wählen Sie "Measure" (oder drücken Sie "Clt + M"). Die Software wird die durchschnittliche Grauintensität innerhalb des definierten Bereiches messen und es in einem Pop-up-Bildschirm, kopiert und zur weiteren Analyse übertreffen werden.
         HINWEIS: Für eine genauere Analyse, zumindest zwei technische Replikate von jeder Probe durchgeführt werden sollte.

Ergebnisse

Wie in diesem Protokoll beschrieben, kann die Konzentration der Bakterien unter Verwendung der MMS (Fig. 1) innerhalb von ca. 15-20 Minuten durchgeführt werden. Die MMS aus Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS) in zwei getrennten Komponenten aufgebaut ist; einen Deckel und eine Kassette sowohl mit einem integrierten Zapfhahnanordnung in die ein zylindrischer Gaze Tupfer eingeführt wird (Fig. 1A). Beide Komponenten werden dann zusammengeschraubt, welche die MMS (Abbildung 1B).

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt ein integriertes Verfahren zur Detektion von E. coli, Salmonella spp., und L. monocytogenes in landwirtschaftlichen Wasser. Hier MMS Bakterienkonzentration aus großen Volumina (10 l) der landwirtschaftlichen Wasser wird mit Bakterienanreicherung gekoppelt und gegen Bakterien anzeigt colorimetrische Detektion mit μPADs. Der MMS-Verfahren mit hoher Partikelgehalt in den Wasserproben zu bewältigen, während die Konzentration der Bakterien 10-fach, ist robust und einfach genu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agricultural water			Irrigation water, produce wash water, well water, etc.
Vinyl tubing	Wilmar	BN-CVT1005	1/4" inner diameter,  3/8" outer diameter, available at:  http://www.wilmar.com
Modified Moore Swab cartridge	Lumiere Diagnostics		11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at:  http://www.lumierediagnostics.com.  Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text)
Cheesecloth	Chesapeake Wiper & Supply, Inc.	CC90	Grade #90, 44 x 36 weave, available at:  www.raglady.com
Household Bleach	Various		Sodium hypochlorite concentration approx. 6%
Sodium thiosulphate 5-hydrate	Mallinckrodt Baker Inc	8100-04
Manifold	Built in-house		Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings
Peristaltic pump	Micron Meters	RPP1300	Available at:  http://www.micronmeters.com
Serological pipette	Various		Disposable, 10 ml
Universal preenrichment broth	Difco	223510
Buffered peptone water	Difco	218105
Salmonella supplement	Biomérieux Industry	42650	http://www.biomerieux-usa.com
VIDAS UP Listeria (LPT) Broth	Biomérieux Industry	410848	http://www.biomerieux-usa.com
Vancomycin	Sigma-Aldrich	861987	http://www.sigmaaldrich.com
Pipet-Aid	Various		Drummond DP-110 used here
Shaking incubator	Various		Excella E25, New Brunswick Scientific used here
Micropipette	Various		10 μl, 1 ml
Micropipette tips	Various		Barrier, 10 μl, 1 ml
1.5 microcentrifuge tubes	Various		RNase- and DNase-free
Probe sonicator	Q Sonica LLC	XL-2000 series
µPADs	Avant		Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid]	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A8022
Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG)	Sigma-Aldrich	59767
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc)	Sigma-Aldrich	B8174
5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate)	Sigma-Aldrich	53451
5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP)	Sigma-Aldrich	38896
Petri dishes, polystyrene 100 mm by 15 mm	Various		Sterile
Flat bed scanner	Various		Xerox USB scanner
ImageJ software	National Institutes of Health		http://rsb.info.nih.gov/ij/