比色検出の紙ベース<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;<em&gt;サルモネラ</em&gt;属、および<em&gt;リステリア菌</em&gt;農業大量の水から

要約

A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (µPAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.

要約

このプロトコルは、。 大腸菌、サルモネラの迅速な比色検出を説明し、農業の水の大量（10リットル）からのリステリア菌 。ここで、水は、細菌を濃縮するために、プラスチック製のカートリッジに封入単純ゴーズフィルタからなる​​無菌の変形ムーアスワブ（MMS）を介して濾過する。濾過に続いて、標的細菌に対して非選択的または選択的な富化をMMSで行われる。標的細菌の比色検出のために、濃縮度は、その後、細菌指標基質を用いて埋め込まれた紙ベースの分析装置（μPADs）を用いてアッセイする。各基板はμPAD上に視覚的に検出可能な着色生成物（定性的検出）を生成し、標的を示す細菌の酵素と反応する。あるいは、反応しμPADsのデジタル画像は、共通の走査または写真デバイスで生成し、ImageJソフトウェア、アルを用いて分析することができる結果のより客観的かつ標準化された解釈のためlowing。生化学的スクリーニング手順は、上記の細菌病原体を同定するために設計されているが、いくつかのケースでは、背景微生物叢または比色基質の分解によって生成される酵素は、偽陽性を生成することができる。そのため、より多くの差別的な診断を使用して確認が必要となります。それにもかかわらず、この細菌濃度及び検出プラットフォームは、初期スクリーニング法としての使用を正当化する、（濃縮、富化、及び検出は、約24時間以内に行われる）、安価な（0.1 CFU / mlの検出限界）に敏感、実施が容易で、かつ迅速である農業用水の微生物学的品質のために。

概要

これは、食品媒介疾患剤は、食品媒介疾患の負担を軽減するために、フィールドベースの設定で迅速に、好ましくは検出されることが重要である。食中毒細菌の病原体を検出するための一般的な戦略は、生化学的プロファイリング、選択的かつ差動培養、免疫学的分離と検出、分子検出があります。しかしながら、これらの方法は、散発的な汚染によって妨げ小さなサンプルサイズは、試験された、食品媒介病原菌の多くの場合、低濃度、長い処理時間を必要とし、および/またはフィールドの設定に適用可能ではない。さらに、多くの食品マトリックス中の化合物は、検出および診断アプリケーションへの抑制性である。微生物検出の可能性を向上させるために、米国食品医薬品局は、（例えば、洗浄水及び灌漑用水として）農業用水のテストが新鮮な農産物の大きな表面積に接触し又はビヒクルとして機能するいずれかのものであることが示唆されているpについてroduce汚染は、食品¹の直接試験に対する実行可能な代替手段です。そうであっても、代表的な農業用水のサンプルの希釈効果と相まって、多くの場合、低い固有の病原体を負担は、病原体濃度のためのサンプル調製法が必要不可欠になります。そのような方法は、水（≥10 L）、適切な病原体濃度、および下流側検出戦略との相溶性を大量にサンプリングが必要となる。

修正されたムーアスワブ（MMS）は、水^2-4大量の（≥10リットル）から細菌を濃縮するために使用される、安価でシンプルな、そして堅牢なデバイスです。 MMSは、蠕動ポンプを用いて、カセットを通してポンプ大量の水のための粗いフィルターとして機能し、ガーゼで満たされたプラスチックカセット、から構成されています。 MMSは処理されたリチウム中の微生物を含む有機及び無機微粒子を捕捉し細菌濃度（≥10倍濃度）の非差別的な方法である頭の良いサンプル。それはMMSによる標的微生物の濃度の優れた効力は微生物シルト-粘土画分又は懸濁固体³の有機微小凝集体に結合することが期待されているという事実によって説明できる可能性がある。 MMSの頑丈なデザインは、このようなフィルタの目詰まり、大量に処理することができないこと、高濁度フィルタサンプル、および高コストなどの水からの細菌の捕捉および濃縮のための他の濾過方法に関連するほとんどの欠点を克服することができます。これらの理由のために、FDAは、MMSの、環境および産生に関連するサンプル収集手順⁵の公式手順に組み込まれることが推奨される。

ここで、この方法は濃度、濃縮、および大腸菌の検出、 サルモネラ属、農業水からのリステリア·モノサイトゲネスに記載されている。 MMSはBACTの濃度で使用されているERIA、また選択的または非選択的細菌濃縮のための容器として機能します。細菌検出は、紙ベースの分析装置^{（μPADs）6を}使用して生化学的に達成される。 ^{μPADs7-11を}印刷^し 、フォトリソグラフィー、インクジェット印刷、スタンピング、およびワックスを含む種々の方法を用いて流体ネットワークまたはスポット試験として製造することができる。流体設計の例は、サンプルが中心部に堆積され、その後、サンプル又は基板の中心¹²内に毛管作用によってチャネルの外のリザーバから引き出された遠位リザーバ又は単一のチャネルパターンに流れる樹状チャネルパターンとすることができる。このプロトコルのために、我々はここでテスト微生物の指標酵素で処理可能な発色性基質を用いて埋め込まれた7 mmの直径ワックスペーパースポットアレイに採用することを選択した。クロロフェノールレッド-β-D-ガラク（CPRG）と5 - ブロモ-4 - クロロ-3 - インドリルβ-D-グルクロニド（X-Glucを）E.によって生成β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼを検出するための大腸菌 ; サルモネラ属によって産生さC8-エステラーゼの検出のための5 -ブロモ-6 -クロロ-3 -インドリルカプリレート（マゼンタカプリル酸）;および5 -ブロモ-4 -クロロ-3 -インドリル-myo-イノシトールリン酸（X型InP）L.により製造ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC（PI-PLC）の検出のためのリステリア ^6。したがって、特定の細菌の存在は、複雑な装置又はデータ解釈を必要とせずに視覚的に観察することができる。これらの特定の標的細菌の酵素ベースの比色μPAD検出の特異性および感度は、以前は⁰⁶探求されてきた。さらに、これらの標的細菌のための統合濃度検出方法の感度は、微生物の予め決めレベル大量の水を加えることによって評価した（未発表データとビーシャら ^13）。

プロトコル

MMSを使用して、農業大量の水からの細菌の1。集中

1. MMSの準備
   1. 40×12 cmの4プライのチーズクロス矩形部分をカット。
   2. 20×6cmの矩形を取得するために両方の軸に沿ってチーズクロスを折る。
   3. 背の高い約6センチ、直径3cmの円柱状の綿棒を形成するために、しっかりとその長軸に沿ってチーズクロスをロールバックします。
   4. アルミホイルにチーズクロス綿棒をオートクレーブカセットオートクレーブしないでください。 10％の家庭用漂白剤で30分間、それを浸すことによってカセットを除染し、チオ硫酸ナトリウム五水和物（のNa ₂ S ₂ O _{3·5H 2} O）溶液（50ミリグラム/ Lで15分間カセットを浸漬することにより残留塩素を非アクティブ滅菌水で調製）。
   5. MMSのカセットに綿棒を挿入します。
      NOTE：MMSカセットの非使い捨て版が使用される場合、チーズクロス私の4プライシートで始まる80×22センチasuring、40×11 cmのそれを折ると、約11センチ、直径6cmの円筒を形成するためにそれをロールバックします。
   6. MMSを組み立てます。
   7. チューブが完全に差込口に付着して確保すること、MMSの両側の差込口にビニールチューブを取り付け、蠕動ポンプにチューブを固定します。蠕動ポンプの上流チューブはサンプリングに十分な長さであることを確認してください。
2. 細菌の濃度
   1. サンプルを高速で蠕動ポンプを実行することにより、農業用水の少なくとも10 L。
   2. サンプリングが完了した後、水試料から蠕動ポンプ入口を撤回ず、排水が、MMSを終了観察されなくなるまでポンプを実行し続ける。
   3. マニホールドが同時にいくつかのサンプルを実行するために使用されている場合は、各MMSの流出物を収集し、10 Lは、単一のMMSを介して濾過されたときには、その特定のMMS用のバルブを閉じて、ポンプを稼働し続ける。
      1. 私のサンプリング時完成したS、、農業用水からの蠕動ポンプ入口を撤回マニホールドのすべてのバルブを開いて、何流出水がMMSSを終了観察されなくなるまでポンプを実行し続ける。
3. 濃度はすべてのMMSS終了したときに、慎重にMMSのスピゴットからビニールチューブを除去し、MMSの両側にスピゴットキャップ。しっかりと蓋をMMSは、濃縮メディアを追加する前に、最大12時間保存することができます。

2。、MMSの濃縮およびサンプル調製

1. 充実
   1. MMSの蓋を外して、無菌的に適切な無菌の濃縮ブイヨンの20ミリリットルを追加します。 1 MMSは、それぞれの選択的濃縮のために使用してください。あるいは、同じ試料中のすべての3つの標的細菌を増殖させる非選択的濃縮を行う。
      注：MMSカセットの非使い捨てのバージョンを使用する場合は、無菌的にカセットからチーズクロスフィルタを削除し、広告の前に、滅菌袋に置く適切な濃縮メディアの丁225ミリリットル。
      1. Eの濃縮のための大腸菌 、バンコマイシン塩酸塩の8 mg / Lの補充したバッファリングされたペプトン水（BPW）の20ミリリットルを追加します。
      2. サルモネラ属菌の濃縮のために。、BPWの20ミリリットルを追加サルモネラサプリメント （4ミリリットル/ L）を補充した。
      3. Lの濃縮のためのリステリア 、VIDAS UPリステリア（LPT）ブロス20ミリリットルを追加。
      4. シングルMMSを使用して、すべての3の微生物同時非選択的濃縮のために、ユニバーサルpreenrichmentブロス（UPB）を使用します。
   2. 背中緊密にMMSの蓋をネジ止めします。差込口がしっかり濃縮の際に流出し、汚染の可能性を避けるために蓋をしていることを確認します。
   3. 200 rpmで振とう培養器で最大18〜24時間のMMSをインキュベートする。 E. 42℃を使用する大腸菌やサルモネラ属。選択的濃縮度。 L·30℃を使用するリステリア選択増、そして37＆＃を使用176、非選択的濃縮のためのC。
2. 試料調製
   1. インキュベーションが完了したときに、差込口のいずれかを暴露する、インキュベーターからMMSを削除してから、静かに1.5mlのマイクロチューブに約0.5mlを分注する。別の方法として、外で一晩濃縮の0.5ミリリットルを、MMSやピペットを外します。
      NOTE：MMSカセットの使い捨てではないバージョンが使用される場合、バッグから富化を0.5mlをピペット。
   2. Eの比色分析のための大腸菌選択的濃縮、または非選択的濃縮度を分析するための、5 ​​Wでの濃縮の0.5ミリリットル音波処理、プローブソニケータを使用して20秒22 kHzの。

μPADs3。準備比色基質の埋め込み

1. 試験した各サンプルおよびターゲットのための十分なμPADsを準備します。 E.を検出するために大腸菌、サルモネラ属菌のため、CPRGとX-GlucをμPADsを準備。検出は、MCμPADsを作成し、L.のためのmonocytogenes検出は、X型InPμPADsを準備します。
   1. 比色基質についてHEPES緩衝液[0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）と0.1 M HEPES]を調製し、使用されようとしている基板に記載の緩衝液のpHを調整してpH 7.5 CPRG又はX-Glucを調製するための、 MCのためのpH 9、及びX-InPのためのpH 7。
   2. pHの基質のストック溶液を準備します3 MM（CPRG）、62.5ミリメートル（X-Glucを）、15 MM（MC）、100ミリ（X-INP）の濃度でHEPES緩衝液を調整した。光からストック溶液を保護します。
   3. その後、各基板原液24μlのμPADマイクロスポットを埋め込む、無菌ペトリ皿の内側μPADsを置きます。

4。検出とデータ解析

1. 検出
   1. シャーレに含まれる各適切なμPADマイクロスポットに濃縮されたサンプルの6を添加する。
   2. ペトリ皿のカバーを背面に配置し、パラフィルムでそれを封印。
   3. サンプルをインキュベートマイクロスポットの発色と乾燥を可能にするために、最大3時間、37℃でμPADと。
2. 結果の目視検査
   1. μPADsの色の変化の簡単な目視検査により検出を行う。
      注：通常、決定的な色の変化をもたらす強力な反応をさらに明確化の必要性を回避する必要があり、陽性とみなされるべきである濃縮の18〜24時間後には、次の期待されている。
   2. Eの存在を決定赤紫色や青緑、無色からのX-Glucを変更して埋め込 ​​まれたマイクロスポットが黄色からCPRG変更に埋め込 ​​まマイクロスポットを観察することによって大腸菌陽性サンプル。
   3. Lの存在を決定インディゴ無色からのX-InPの変化に埋め込 ​​まマイクロスポットを観察することによってリステリア陽性サンプル。
   4. サルモネラの存在を決定する。 COLから、MCの変更に埋め込まマイクロスポットを観察することによって、正のサンプル紫藤色にorless。
3. ソフトウェア支援データ解析
   NOTE：明らかに弱い反応が陽性または陰性であるかどうかを決定するために、結果の半定量分析を可能にするために実施。
   1. μPADsは、完全に乾燥できます。
   2. フラットベッドスキャナを使用してμPADをスキャンします。
   3. 画像を処理するためにImageJソフトウェアを使用してください。
      1. メインメニュー（または[「CLT + O」）の「ファイル」タブの下にあるImageJの中で、分析されるスキャンした画像を「OPEN」。
      2. （「CLT + +の私Shiftキー」を押すか）、メインメニューの「編集」タブの下にある「反転」を選択画像を反転します。
      3. メインメニューの「分析」タブを使用して分析した報告された測定値を選択する」に設定し測定を...」を選択します。
      4. 「平均グレイ強度」、「しきい値に制限」、および「表示ラベル」ボックスがあることを確認してくださいチェックし、Enterキーを押して「OK」これは、ソフトウェアが選択した各領域を分析し、どのように設定して、どのようにそれを報告します。
      5. あなたは内に測定したい領域の概要を説明し、円を描くように「楕円」ツールを使用します。
      6. 「分析」タブで「測定」（またはキーを押し「CLT + M "）を選択します。ソフトウェアが定義された領域内で平均グレイ強度を測定し、コピーして、更なる分析のために、Excelに貼り付けることができ、ポップアップ画面でそれを報告します。
         注：より正確な分析のために、各試料の少なくとも二つの技術的反復を実行する必要がある。

結果

このプロトコルに記載のように、MMS（ 図1）を用いて細菌の濃度は、約15〜20分以内に行うことができる。 2つの別個の構成要素でアクリロニトリルブタジエンスチレン（ABS）から構成においてMMS;円筒状のチーズクロススワブが挿入される集積スピゴット体（ 図1A）との両方の蓋とカートリッジ。両成分は、その後、MMS（ 図1B）を形成螺合されている。 MMS...

ディスカッション

このプロトコルは、 大腸菌を検出するための統合された方法を説明します大腸菌 、 サルモネラ属、およびL.農業用水におけるリステリア 。ここで、農業用水の大量からの細菌のMMS濃度（10 L）は、細菌の濃縮、およびμPADsを用いて細菌を示す比色検出に連結されている。細菌を10倍に濃縮しながら、MMS手順は水試料中の微粒子高含有コンテンツに対応できる?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agricultural water			Irrigation water, produce wash water, well water, etc.
Vinyl tubing	Wilmar	BN-CVT1005	1/4" inner diameter,  3/8" outer diameter, available at:  http://www.wilmar.com
Modified Moore Swab cartridge	Lumiere Diagnostics		11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at:  http://www.lumierediagnostics.com.  Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text)
Cheesecloth	Chesapeake Wiper & Supply, Inc.	CC90	Grade #90, 44 x 36 weave, available at:  www.raglady.com
Household Bleach	Various		Sodium hypochlorite concentration approx. 6%
Sodium thiosulphate 5-hydrate	Mallinckrodt Baker Inc	8100-04
Manifold	Built in-house		Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings
Peristaltic pump	Micron Meters	RPP1300	Available at:  http://www.micronmeters.com
Serological pipette	Various		Disposable, 10 ml
Universal preenrichment broth	Difco	223510
Buffered peptone water	Difco	218105
Salmonella supplement	Biomérieux Industry	42650	http://www.biomerieux-usa.com
VIDAS UP Listeria (LPT) Broth	Biomérieux Industry	410848	http://www.biomerieux-usa.com
Vancomycin	Sigma-Aldrich	861987	http://www.sigmaaldrich.com
Pipet-Aid	Various		Drummond DP-110 used here
Shaking incubator	Various		Excella E25, New Brunswick Scientific used here
Micropipette	Various		10 μl, 1 ml
Micropipette tips	Various		Barrier, 10 μl, 1 ml
1.5 microcentrifuge tubes	Various		RNase- and DNase-free
Probe sonicator	Q Sonica LLC	XL-2000 series
µPADs	Avant		Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid]	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A8022
Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG)	Sigma-Aldrich	59767
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc)	Sigma-Aldrich	B8174
5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate)	Sigma-Aldrich	53451
5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP)	Sigma-Aldrich	38896
Petri dishes, polystyrene 100 mm by 15 mm	Various		Sterile
Flat bed scanner	Various		Xerox USB scanner
ImageJ software	National Institutes of Health		http://rsb.info.nih.gov/ij/