Colorimétrico Papel a base de Detección de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp,. Y<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; De grandes volúmenes de agua en la agricultura

Resumen

A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (µPAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.

Resumen

Este protocolo describe la detección colorimétrica rápida de Escherichia coli, Salmonella spp., Y Listeria monocytogenes a partir de grandes volúmenes (10 L) de aguas agrícolas. Aquí, el agua se filtra a través estéril modificados hisopos de Moore (MMS), que consisten en un filtro simple gasa encerrado en un cartucho de plástico, para concentrar bacterias. Después de la filtración, enriquecimientos no selectivos o selectivos para las bacterias diana se realizan en el MMS. Para la detección colorimétrica de las bacterias diana, los enriquecimientos después se ensayan utilizando dispositivos analíticos basados ​​en papel (μPADs) incrustados con sustratos bacterias indicativas. Cada sustrato reacciona con enzimas bacterianas-objetivo indicativo, la generación de productos coloreados que pueden detectarse visualmente (detección cualitativa) en el μPAD. Alternativamente, las imágenes digitales de los μPADs reaccionado se pueden generar con la exploración común o dispositivos fotográficos y se analizaron utilizando el software ImageJ, ALtes para la interpretación más objetiva y estandarizada de los resultados. Aunque los procedimientos de cribado bioquímico están diseñadas para identificar los patógenos bacterianos mencionados anteriormente, en algunos casos, las enzimas producidas por la microbiota fondo o la degradación de los sustratos colorimétricos puede producir un falso positivo. Por lo tanto, es necesaria una confirmación mediante un diagnóstico más discriminatorio. Sin embargo, esta concentración y detección de la plataforma bacteriana es barato, sensible (0,1 CFU límite de detección / ml), fácil de realizar, rápido y (concentración, enriquecimiento, y la detección se llevan a cabo dentro de aproximadamente 24 horas), justificando su uso como un método de cribado inicial de la calidad microbiológica del agua para la agricultura.

Introducción

Es importante que los agentes de enfermedades transmitidas por los alimentos se detectan rápidamente y preferentemente en entornos basados ​​en el terreno con el fin de reducir la carga de enfermedades transmitidas por los alimentos. Las estrategias comunes para detectar bacterias patógenas transmitidas por los alimentos incluyen perfiles bioquímicos, el cultivo selectivo y diferencial, aislamiento inmunológico y detección, y la detección molecular. Sin embargo, estos métodos se ven obstaculizados por la contaminación esporádica, los pequeños tamaños de las muestras analizadas, las concentraciones bajas a menudo de las bacterias patógenas transmitidas por los alimentos, requieren largos tiempos de procesamiento, y / o no son aplicables para la configuración del campo. Además, los compuestos en muchas matrices de alimentos son inhibitorios para la detección y aplicaciones de diagnóstico. Con el fin de mejorar la probabilidad de detección microbiana, la Food and Drug Administration de los Estados Unidos ha sugerido que la prueba del agua agrícola (como el agua de lavado y el agua de riego) que, o bien entra en contacto con una gran superficie de los productos frescos o sirve como un vehículo para pcontaminación laborar es una alternativa viable a la prueba directa de alimentos ^1. Aun así, la frecuencia baja de patógenos y carga física, junto con el efecto de dilución de la muestra representativa del agua agrícola hace que los métodos de preparación de muestras para la concentración de patógenos esencial. Tal un método requeriría el muestreo de grandes volúmenes de agua (≥ 10 L), adecuada concentración de patógenos, y la compatibilidad con las estrategias de detección aguas abajo.

Hisopos de Moore Modificados (MMS) son dispositivos baratos, sencillos y robustos utilizados para concentrar las bacterias de volúmenes grandes (≥ 10 L) de agua ^2-4. El MMS se compone de un casete de plástico llena de gasa, que sirve como un filtro grueso para grandes volúmenes de agua bombeada a través de la cassette mediante una bomba peristáltica. El MMS es un método no discriminatorio de la concentración bacteriana (≥ concentración 10 veces) que captura material particulado orgánico e inorgánico que incluye microorganismos en li procesadomuestras de contrapartidas. Es probable que la excelente eficacia de la concentración de microorganismos diana por el MMS se puede explicar por el hecho de que se espera que los microorganismos que se adjunta a la fracción limo-arcilla o microagregados orgánicos de los sólidos en suspensión ^3. El diseño resistente de la MMS permite la superación de la mayoría de los inconvenientes asociados con otros métodos de filtración para la captura y concentración de bacterias del agua, tales como la obstrucción de los filtros, la incapacidad para procesar grandes volúmenes, muestras de filtros con alta turbidez, y los altos costos. Por estas razones, la FDA recomienda que la MMS se incorporarán a los procedimientos oficiales para los procedimientos de recogida de muestras ambientales y relacionados con la producción de ^5.

Aquí, se describe un método para la concentración, enriquecimiento, y la detección de Escherichia coli, Salmonella spp., Y Listeria monocytogenes de aguas agrícolas. Un MMS se utiliza para la concentración de bactEria, y también sirve como un recipiente para el enriquecimiento bacteriana selectiva o no selectiva. Detección bacteriana se logra bioquímicamente utilizando dispositivos analíticos basados ​​en papel (μPADs) ^6. μPADs pueden ser fabricados como redes de fluidos o pruebas in situ utilizando una variedad de métodos que incluyen la fotolitografía, impresión de chorro de tinta, estampación, y cera de impresión ^7-11. Ejemplos de diseños de fluidos pueden ser patrones de canal dendríticas en donde se deposita la muestra en el centro y, posteriormente, los flujos de depósitos distales o patrones de un solo canal en el que la muestra o sustrato se extraen de los depósitos externos de la canal por la acción capilar en el centro ^12. Para este protocolo, hemos decidido emplear para 7 mm de diámetro de papel encerado arrays manchas incrustadas con sustratos cromogénicos que pueden ser procesados ​​por enzimas indicativas de los microorganismos ensayados aquí: clorofenol rojo β-D-galactopiranósido (CPRG) y 5 - bromo-4-cloro-3-indolil β-D-glucurónido (X-Gluc)para la detección de β-galactosidasa y β-glucuronidasa producida por E. coli; Caprilato de 5-bromo-6-cloro-3-indolilo (caprilato magenta) para la detección de C8-esterasa producida por Salmonella spp.; y fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-mio-inositol (X-InP) para la detección de específica de fosfatidilinositol fosfolipasa C (PI-PLC) producida por L. monocytogenes ^6. Por lo tanto, la presencia de una bacteria en particular puede observarse visualmente sin la necesidad de equipo complejo o interpretación de los datos. La especificidad y la sensibilidad de la detección colorimétrica μPAD a base de enzimas de estas bacterias diana específica se ha explorado previamente ^6. Además, la sensibilidad del método de detección de la concentración integrada para estas bacterias diana se evaluó por spiking de grandes volúmenes de agua con niveles predeterminados de microorganismos (datos no publicados y Bisha et al. ^13).

Protocolo

1. Concentración de bacterias a partir de grandes volúmenes de agua en la agricultura mediante MMS

1. Preparación MMS
   1. Cortar una sección rectangular de una gasa de 4 capas de medición de 40 x 12 cm.
   2. Doble la estopilla en ambos ejes para obtener un rectángulo de 20 x 6 cm.
   3. Rollo de la gasa firmemente a lo largo de su eje largo para formar un bastoncillo cilíndrico de aproximadamente 6 cm de altura y 3 cm de diámetro.
   4. Autoclave el hisopo una gasa en papel de aluminio, no autoclave del cassette. Descontaminar el casete por remojo durante 30 minutos en 10% de lejía doméstica, y desactivar el cloro residual remojando el casete durante 15 min en un pentahidrato de tiosulfato de sodio (Na ₂ S ₂ O ₃ · 5H ₂ O) solución (50 mg / L preparado en agua estéril).
   5. Inserte el hisopo en el cassette de MMS.
      NOTA: Si se utiliza la versión no desechable del casete MMS, comenzar con una hoja de 4 capas de estopilla míasuring 80 x 22 cm, doble a 40 x 11 cm y rodar para formar un cilindro de aproximadamente 11 cm de alto y 6 cm de diámetro.
   6. Montar el MMS.
   7. Fije el tubo de vinilo a espigas en ambos lados de los MMS, asegurando el tubo se adhiere completamente a las espigas, y fijar el tubo en la bomba peristáltica. Asegúrese de que el tubo de aguas arriba de la bomba peristáltica es de longitud suficiente para el muestreo.
2. La concentración de bacterias
   1. Muestra por lo menos 10 litros de agua para la agricultura mediante la ejecución de la bomba peristáltica a alta velocidad.
   2. Después del muestreo es completa, retirar la entrada de la bomba peristáltica de la muestra de agua y continuar funcionando la bomba hasta que no se observe agua efluente que sale del MMS.
   3. Si un colector se utiliza para ejecutar varias muestras al mismo tiempo, recoger el efluente de cada MMS, y cuando 10 L se filtra a través de un solo MMS cerrar la válvula para que el MMS particulares y continuar ejecutando la bomba.
      1. Cuando el muestreo is terminado, retirar la entrada de la bomba peristáltica del agua en la agricultura, abra todas las válvulas del colector, y continuar funcionando la bomba hasta que no se observe agua efluente que sale del MMSs.
3. Cuando la concentración se ha completado para todos los mensajes MMS, retire con cuidado el tubo de vinilo de los grifos de MMS y tape las espigas a ambos lados de la MMS. MMS herméticamente cerrados se pueden almacenar durante un máximo de 12 horas antes de la adición de medios de enriquecimiento.

2. MMS Enriquecimiento y Preparación de la Muestra

1. Enriquecimiento
   1. Desenrosque la tapa de los MMS y añadir asépticamente 20 ml del caldo de enriquecimiento estéril apropiado. Utilice uno MMS para cada enriquecimiento selectivo. Alternativamente, realizar un enriquecimiento no selectivo para propagar todos los tres bacterias diana en la misma muestra.
      NOTA: Si se utiliza la versión no desechable del casete MMS, retire el filtro de una gasa aséptica desde el casete y colóquelo en una bolsa estéril antes de adding 225 ml de los medios de comunicación, convenientemente enriquecidos.
      1. Para el enriquecimiento de E. coli, agregar 20 ml de agua de peptona tamponada (BPW) suplementado con 8 mg / l de hidrocloruro de vancomicina.
      2. Para el enriquecimiento de Salmonella spp., Añadir 20 ml de agua de peptona tamponada suplementada con el suplemento de Salmonella (4 ml / L).
      3. Para el enriquecimiento de L. monocytogenes, añadir 20 ml de VIDAS HASTA Listeria (LPT) de caldo.
      4. Para el enriquecimiento no selectivo simultánea para los tres microorganismos utilizando una sola MMS, utilice caldo preenrichment universales (UPB).
   2. Tornillo de la tapa de la MMS volver con fuerza. Asegúrese de que los grifos están bien cerradas para evitar derrames y una posible contaminación durante el enriquecimiento.
   3. Incubar los MMS para un máximo de 18 a 24 horas en una incubadora de agitación a 200 rpm. Utilice 42 ° C para E. coli y Salmonella spp. enriquecimientos selectivos. Utilice 30 ° C para L. monocytogenes enriquecimiento selectivo, y utilizar 37 & #176; C para el enriquecimiento no selectivo.
2. Preparación de la muestra
   1. Después de la incubación, retirar el MMS de la incubadora, destapar uno de los grifos, y dispensar suavemente alrededor de 0,5 ml en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Alternativamente, desenroscar los MMS y pipeta fuera 0,5 ml del enriquecimiento durante la noche.
      NOTA: Si se utiliza la versión no-desechable del casete MMS, pipetear 0,5 ml del enriquecimiento de la bolsa.
   2. Para el análisis colorimétrico de E. enriquecimiento selectivo coli, o para el análisis de los enriquecimientos no selectivos, se somete a ultrasonidos 0,5 ml de enriquecimiento a 5 W, 22 kHz durante 20 segundos utilizando un sonicador de sonda.

3. Preparación e incrustación de colorimétricos Sustratos en μPADs

1. Preparar suficientes μPADs para cada muestra y de destino probado. Para detectar E. coli preparar CPRG y X-Gluc μPADs, para Salmonella spp. detección preparar μPADs MC, y para L. monocytdetección ogenes preparar μPADs X-INP.
   1. Preparar tampón HEPES [HEPES 0,1 M con 0,1% albúmina de suero bovino (BSA)] para los sustratos colorimétricos y ajustar el pH del tampón de acuerdo con el sustrato que se va a utilizar: pH 7.5 para la preparación de CPRG o X-Gluc, pH 9 para MC y pH 7 para X-InP.
   2. Preparar las soluciones madre de los sustratos en el pH se ajustó tampón HEPES a concentraciones de 3 mM (CPRG), 62,5 mM (X-Gluc), 15 mM (MC), 100 mM de (X-InP). Proteja las soluciones de reserva de la luz.
   3. Coloca los μPADs dentro de una placa de Petri estéril, luego incrustar el microspot μPAD con 24 l de cada solución madre de sustrato.

4. Detección y Análisis de Datos

1. Detección
   1. Añadir 6 l de la muestra enriquecida a cada micropunto μPAD apropiada contenida en una placa de Petri.
   2. Coloque la tapa en la placa de Petri y sellarlo con Parafilm.
   3. Incubar la muestracon el μPAD a 37 ° C durante un máximo de 3 horas para permitir el desarrollo del color y el secado de los micropuntos.
2. El examen visual de los resultados
   1. Realizar la detección mediante la simple inspección visual de los cambios de color de los μPADs.
      NOTA: Por lo general, se espera que los fuertes reacciones que producen cambios en el color definitivo tras 18-24 h de enriquecimiento, que debe obviar la necesidad de una mayor clarificación y debe ser considerado positivo.
   2. Determinar la presencia de una E. coli muestra positiva mediante la observación de micropuntos incrustados con el cambio CPRG de amarillo a rojo-violeta y micropuntos incrustados con X-Gluc cambio de incoloro a azul-verde.
   3. Determinar la presencia de una L. monocytogenes muestra positiva mediante la observación de micropuntos incrustados con X-InP cambio de incoloro a índigo.
   4. Determinar la presencia de una Salmonella spp. muestra positiva por micropuntos observación incrustadas con MC cambio de colorless a morado-malva.
3. Software Asistida por Análisis de Datos
   NOTA: Se realiza para determinar claramente si las reacciones débiles son positivas o negativas y permitir un análisis semi-cuantitativo de los resultados.
   1. Permitir las μPADs se seque completamente.
   2. Busque en la μPAD utilizando un escáner plano.
   3. Utilice el software ImageJ para procesar la imagen.
      1. "Abrir" imagen escaneada a ser analizados en ImageJ encuentra en la pestaña "Archivo" en el menú principal (o pulse "Clt + O").
      2. Invierta la imagen seleccionando la opción "Invertir" situado en la pestaña "Editar" en el menú principal (o pulse "Clt + Shift + I").
      3. Utilice la opción "Analizar" en el menú principal y seleccione "Mediciones Set ..." para seleccionar las mediciones reportadas analizados.
      4. Asegúrese de que la "intensidad de gris medio", "Límite de umbral", y "cajas de etiquetas Pantalla" sonmarcada, y pulse "Aceptar". Esto establece la forma en que el software analiza cada área seleccionada y cómo se informa de ello.
      5. Utilice la herramienta de "Oval" para dibujar un círculo que describe el área que se desea medir dentro.
      6. Bajo la pestaña "Analizar" seleccionar "Measure" (o pulse "Clt + M"). El software mide la intensidad de color gris medio dentro de la zona definida e informar de ello en una pantalla pop-up que se puede copiar y pegar a Excel para su posterior análisis.
         NOTA: Para los análisis más precisos, se debe realizar por lo menos dos técnicos repeticiones de cada muestra.

Resultados

Tal como se describe en este protocolo, la concentración de bacterias utilizando los MMS (Figura 1) se puede realizar en un plazo aproximado de 15-20 min. Los MMS en construidas a partir de acrilonitrilo butadieno estireno (ABS) en dos componentes separados; una tapa y un cartucho de ambos con un conjunto de espiga integrado en el que se inserta un hisopo de gasa cilíndrica (Figura 1A). Ambos componentes se atornillan entre sí formando los MMS (Figura 1B). Procesamie...

Discusión

Este protocolo describe un método integrado para la detección de E. coli, Salmonella spp., y L. monocytogenes en agua para la agricultura. Aquí, la concentración de MMS de bacterias a partir de grandes volúmenes (10 L) de agua para la agricultura, se acopla con el enriquecimiento bacteriana, y la detección colorimétrica-bacteriana indicativa utilizando μPADs. El procedimiento de MMS puede hacer frente a un alto contenido de partículas en las muestras de agua, mientras que la concentración de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agricultural water			Irrigation water, produce wash water, well water, etc.
Vinyl tubing	Wilmar	BN-CVT1005	1/4" inner diameter,  3/8" outer diameter, available at:  http://www.wilmar.com
Modified Moore Swab cartridge	Lumiere Diagnostics		11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at:  http://www.lumierediagnostics.com.  Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text)
Cheesecloth	Chesapeake Wiper & Supply, Inc.	CC90	Grade #90, 44 x 36 weave, available at:  www.raglady.com
Household Bleach	Various		Sodium hypochlorite concentration approx. 6%
Sodium thiosulphate 5-hydrate	Mallinckrodt Baker Inc	8100-04
Manifold	Built in-house		Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings
Peristaltic pump	Micron Meters	RPP1300	Available at:  http://www.micronmeters.com
Serological pipette	Various		Disposable, 10 ml
Universal preenrichment broth	Difco	223510
Buffered peptone water	Difco	218105
Salmonella supplement	Biomérieux Industry	42650	http://www.biomerieux-usa.com
VIDAS UP Listeria (LPT) Broth	Biomérieux Industry	410848	http://www.biomerieux-usa.com
Vancomycin	Sigma-Aldrich	861987	http://www.sigmaaldrich.com
Pipet-Aid	Various		Drummond DP-110 used here
Shaking incubator	Various		Excella E25, New Brunswick Scientific used here
Micropipette	Various		10 μl, 1 ml
Micropipette tips	Various		Barrier, 10 μl, 1 ml
1.5 microcentrifuge tubes	Various		RNase- and DNase-free
Probe sonicator	Q Sonica LLC	XL-2000 series
µPADs	Avant		Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid]	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A8022
Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG)	Sigma-Aldrich	59767
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc)	Sigma-Aldrich	B8174
5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate)	Sigma-Aldrich	53451
5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP)	Sigma-Aldrich	38896
Petri dishes, polystyrene 100 mm by 15 mm	Various		Sterile
Flat bed scanner	Various		Xerox USB scanner
ImageJ software	National Institutes of Health		http://rsb.info.nih.gov/ij/