Colorimetrico carta a base di rilevamento di<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp., E<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Da grandi volumi di acqua agricolo

Riepilogo

A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (µPAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.

Abstract

Questo protocollo descrive rapida individuazione colorimetrica di Escherichia coli, Salmonella spp., Listeria monocytogenes e dai grandi volumi (10 L) delle acque agricole. Qui, l'acqua viene filtrata attraverso sterile Modificati Moore Tamponi (MMS), che consistono in un semplice filtro di garza racchiuso in una cartuccia di plastica, per concentrare i batteri. Dopo filtraggio, arricchimenti non selettivi o selettivi per i batteri bersaglio sono eseguiti nel MMS. Per il rilevamento colorimetrico dei batteri bersaglio, i arricchimenti vengono poi analizzati utilizzando dispositivi analitici basati su carta (μPADs) integrati con batteri indicative substrati. Ogni substrato reagisce con enzimi batterici bersaglio-indicativo, generando prodotti colorati rilevabili visivamente (determinazione qualitativa) sul μPAD. In alternativa, le immagini digitali dei μPADs reagito possono essere generati con la scansione comune o dispositivi fotografici e analizzati utilizzando il software ImageJ, alsivo per l'interpretazione più oggettiva e standardizzata dei risultati. Sebbene le procedure di screening biochimici sono progettati per identificare i batteri patogeni di cui sopra, in alcuni casi enzimi prodotti da uno sfondo microbiota o la degradazione dei substrati colorimetrici può produrre un falso positivo. Pertanto, è necessaria una conferma tramite una diagnostica più discriminatorie. Tuttavia, questa concentrazione e rilevazione piattaforma batterica è poco costoso, sensibile (0,1 CFU / ml limite di rivelazione), facile da eseguire, e rapida (concentrazione, arricchimento, e la rilevazione viene effettuata entro circa 24 ore), giustificando il suo uso come metodo di screening iniziale per la qualità microbiologica dell'acqua agricola.

Introduzione

E 'importante che gli agenti di malattie di origine alimentare vengono rilevati rapidamente e preferibilmente in contesti sul campo, al fine di ridurre l'onere delle malattie di origine alimentare. Strategie comuni per rilevare batteri patogeni di origine alimentare comprendono profili biochimici, coltura selettivo e differenziale, isolamento immunologica e rilevazione, e la diagnosi molecolare. Tuttavia, questi metodi sono ostacolati dalla sporadica contaminazione, campioni di piccole dimensioni testate, le basse concentrazioni spesso dei batteri patogeni di origine alimentare, richiedono tempi di lavorazione lunghi, e / o non sono applicabili per le impostazioni dei campi. Inoltre, composti in molte matrici alimentari inibiscono l'individuazione e applicazioni diagnostiche. Per migliorare la probabilità di rilevamento microbica, la Food and Drug Administration ha suggerito che il test acqua agricola (quali acqua acqua di lavaggio e irrigazione) delle quali viene a contatto con una grande superficie di prodotti freschi o serve come veicolo per pcontaminazione roduce è una valida alternativa alla sperimentazione diretta di prodotti alimentari ^1. Anche così, la spesso bassa patogeno-carico naturale, accoppiato con l'effetto di diluizione del campione rappresentativo dell'acqua in agricoltura rende preparazione del campione metodi per la concentrazione di patogeni essenziale. Tale metodo richiederebbe campionamento grandi volumi di acqua (≥ 10 L), adeguata patogeno-concentrazione, e la compatibilità con le strategie di rilevamento a valle.

Tamponi Moore modificati (MMS) sono dispositivi a basso costo, semplici e robusti utilizzati per concentrare i batteri dai grandi volumi (≥ 10 L) di acqua ^2-4. L'MMS è composto da una cassetta di plastica riempito di garza, che serve come un filtro grossolano per grandi volumi di acqua pompata attraverso il cassetto utilizzando una pompa peristaltica. L'MMS è un metodo non discriminatoria della concentrazione batterica (≥ concentrazione 10 volte) che cattura il materiale particolato organico e inorganico, tra cui i microrganismi in li trasformaticampioni di sterline. E 'probabile che l'eccellente efficacia di concentrazione di microrganismi bersaglio, entro il MMS può essere spiegato dal fatto che i microrganismi dovrebbero essere attaccato alla frazione limo-argilla o organici microaggregati dei solidi sospesi ^3. Il design robusto di MMS consente di superare la maggior parte dei difetti associati con altri metodi di filtrazione per la cattura e la concentrazione dei batteri dall'acqua, come l'intasamento dei filtri, l'incapacità di elaborare grandi volumi, i campioni del filtro con elevata torbidità e costi elevati. Per questi motivi, la FDA raccomanda che MMS di essere incorporati nelle procedure ufficiali per le procedure di raccolta dei campioni ambientali e produrre correlati ^5.

Qui, è descritto un metodo per la concentrazione, arricchimento, e la rilevazione di Escherichia coli, Salmonella spp., E Listeria monocytogenes dalle acque agricole. Un MMS è utilizzato per la concentrazione di bacteria, e serve anche come vaso per arricchimento batterica selettiva o non selettiva. Rilevazione batterica si ottiene biochimicamente utilizzando dispositivi analitici basati su carta (μPADs) ^6. μPADs possono essere prodotte come reti fluidici o spot test utilizzando una varietà di metodi tra cui fotolitografia, la stampa a getto d'inchiostro, stampaggio, e la stampa a cera ^7-11. Esempi di disegni fluidici possono essere modelli di canale dendritiche in cui il campione viene depositato al centro e successivamente flussi di serbatoi distali o modelli a singolo canale in cui il campione o substrato vengono tirati dai serbatoi esterni del canale per azione capillare verso il centro ^12. Per questo protocollo, abbiamo scelto di utilizzare per 7 mm di diametro cera carta array loco incastonate con i substrati cromogeni che possono essere elaborati dagli enzimi indicativi dei microrganismi testati qui: Chlorophenol rosso β-D-galattopiranoside (CPRG) e 5 - bromo-4-cloro-3-indolil β-D-glucuronide (X-Gluc)per il rilevamento di β-galattosidasi e β-glucuronidasi prodotta da E. coli; 5-bromo-6-cloro-3-indolil caprilato (magenta caprilato) per la rilevazione di C8-esterasi prodotta da Salmonella spp.; e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-myo-inositolo fosfato (X-InP) per il rilevamento di specifici fosfatidilinositolo-fosfolipasi C (PI-PLC) prodotto da L. monocytogenes ^6. Pertanto, la presenza di un particolare batterio può essere osservato visivamente, senza la necessità di attrezzature complesse o l'interpretazione dei dati. La specificità e la sensibilità della rilevazione colorimetrica μPAD a base di enzimi di questi specifici batteri bersaglio è stato esplorato in precedenza ^6. Inoltre, la sensibilità del metodo di concentrazione di rilevamento integrato per questi batteri bersaglio è stata valutata da chiodare di grandi volumi di acqua con livelli predeterminati di microrganismi (dati non pubblicati e Bisha et al. ^13).

Protocollo

1. Concentrazione di batteri da grandi volumi di acqua agricola tramite MMS

1. MMS Preparazione
   1. Tagliare una sezione rettangolare di 4 strati di garza misura 40 x 12 centimetri.
   2. Piegare la garza lungo entrambi gli assi per ottenere un rettangolo di 20 x 6 cm.
   3. Rotolare la garza ermeticamente lungo il suo asse per formare un tampone cilindrico di circa 6 cm di altezza e 3 cm di diametro.
   4. Sterilizzare il tampone di garza in un foglio di alluminio, non sterilizzare in autoclave la cassetta. Decontaminare la cassetta immergendolo per 30 min in candeggina 10%, e disattivare il cloro residuo immergendo la cassetta per 15 min in una pentaidrato tiosolfato di sodio (Na ₂ S ₂ O ₃ · 5H ₂ O) soluzione (50 mg / L preparato in acqua sterile).
   5. Inserire il tampone nella cassetta MMS.
      NOTA: Se si utilizza la versione non usa e getta della cassetta MMS, iniziare con un foglio 4 strati di garza measuring 80 x 22 centimetri, piegarlo a 40 x 11 cm e rotolare a formare un cilindro alto circa 11 centimetri e 6 cm di diametro.
   6. Montare l'MMS.
   7. Collegare il tubo di vinile perni su entrambi i lati delle MMS, assicurando il tubo aderisce pienamente ai perni, e fissare tubo nella pompa peristaltica. Assicurarsi che la tubazione a monte della pompa peristaltica è di lunghezza sufficiente per il campionamento.
2. Concentrazione di batteri
   1. Esempio di almeno 10 L di acqua agricola eseguendo la pompa peristaltica ad alta velocità.
   2. Dopo il campionamento è completo, ritirare la pompa peristaltica dal campione di acqua e continuare a funzionare la pompa fino a quando non si osserva acque reflue in uscita dal MMS.
   3. Se un collettore viene utilizzato per eseguire diversi campioni allo stesso tempo, raccogliere l'effluente di ciascuna MMS, e quando 10 L viene filtrata attraverso un singolo MMS chiudere la valvola per quel MMS particolari e continuare l'esecuzione della pompa.
      1. Quando il campionamento is completata, ritirare la pompa peristaltica dall'acqua agricolo, aprire tutte le valvole del collettore, e continuare a funzionare la pompa fino a quando non si osserva acque reflue in uscita dal MMS.
3. Quando la concentrazione è stata completata per tutte MMS, rimuovere con cautela il tubo in vinile dai perni MMS e tappare i rubinetti su entrambi i lati del MMS. MMS ben chiuso possono essere conservati fino a 12 ore prima di aggiungere il supporto di arricchimento.

2. MMS arricchimento e di preparazione del campione

1. Arricchimento
   1. Svitare il coperchio delle MMS, e aggiungere asetticamente 20 ml di brodo di arricchimento appropriato sterile. Utilizzare un MMS per ogni arricchimento selettivo. In alternativa, eseguire un arricchimento non selettivo per propagare i tre batteri bersaglio nello stesso campione.
      NOTA: Se si utilizza la versione non usa e getta della cassetta MMS, rimuovere asetticamente il filtro garza dal cassetto e metterli in un sacchetto sterile prima adding 225 ml di mezzi di comunicazione di arricchimenti adeguati.
      1. Per l'arricchimento di E. coli, aggiungere 20 ml di acqua peptonata tamponata (BPW), completata con 8 mg / L di vancomicina cloridrato.
      2. Per l'arricchimento di Salmonella spp., Aggiungere 20 ml di BPW integrate con il supplemento Salmonella (4 ml / L).
      3. Per l'arricchimento di L. monocytogenes, aggiungere 20 ml di VIDAS UP Listeria (LPT) brodo.
      4. Per simultanea di arricchimento non selettivo per tutti e tre i microrganismi che utilizzano un singolo MMS, utilizzare brodo preenrichment universale (UPB).
   2. Avvitare il coperchio del MMS indietro ermeticamente. Assicurarsi che i rubinetti siano ben chiusi per evitare fuoriuscite ed eventuale contaminazione durante arricchimento.
   3. Incubare gli MMS fino a 18-24 ore in un incubatore agitazione a 200 rpm. Utilizzare 42 ° C per E. coli e Salmonella spp. arricchimenti selettivi. Utilizzare 30 ° C per L. monocytogenes arricchimento selettivo, e utilizzare 37 & #176; C per arricchimento non selettivo.
2. Preparazione del campione
   1. Al termine dell'incubazione, rimuovere gli MMS dal termostato, stappando uno dei perni, e delicatamente erogare circa 0,5 ml in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. In alternativa, svitare i MMS e pipetta su 0,5 ml di arricchimento durante la notte.
      NOTA: Se si utilizza la versione non-getta della cassetta MMS, pipettare 0,5 ml di arricchimento dal sacchetto.
   2. Per l'analisi colorimetrica di E. coli arricchimento selettivo, o per l'analisi dei arricchimenti non selettivi, sonicazione 0,5 ml di arricchimento a 5 W, 22 kHz per 20 secondi usando una sonda sonicatore.

3. Preparazione e incorporamento di colorimetrici Substrati in μPADs

1. Preparare abbastanza μPADs per ogni campione e di destinazione testato. Per rilevare E. coli preparare CPRG e X-Gluc μPADs, per la Salmonella spp. rilevamento preparare μPADs MC, e L. monocytrilevamento ogenes preparare μPADs X-InP.
   1. Preparare tampone HEPES [0,1 M HEPES con 0,1% di sieroalbumina bovina (BSA)] per i substrati colorimetrici e regolare il pH del tampone secondo i substrati che sta per essere utilizzato: pH 7,5 per la preparazione di CPRG o X-Gluc, pH 9 per MC, e pH 7 per X-InP.
   2. Preparare soluzioni madre dei substrati del pH regolato tampone HEPES a concentrazioni di 3 mm (CPRG), 62,5 mm (X-Gluc), 15 mm (MC), 100 mm (X-InP). Proteggere le soluzioni madre dalla luce.
   3. Posizionare i μPADs all'interno di una piastra di Petri sterile, poi incastonare il microspot μPAD con 24 ml di ogni soluzione stock substrato.

4. Rilevamento e analisi dei dati

1. Rivelazione
   1. Aggiungere 6 ml di campione arricchito di ogni Microspot μPAD appropriata contenuta in una capsula di Petri.
   2. Mettere il coperchio sul piatto di Petri e sigillarlo con Parafilm.
   3. Incubare il campionecon il μPAD a 37 ° C per 3 ore per consentire lo sviluppo del colore e asciugatura dei microspot.
2. Visiva esame dei risultati
   1. Eseguire il rilevamento mediante una semplice ispezione visiva dei cambiamenti di colore dei μPADs.
      NOTA: in genere, forti reazioni che producono cambiamenti di colore definitivi sono attesi a seguito 18-24 ore di arricchimento, che dovrebbe evitare la necessità di ulteriori chiarimenti e dovrebbe essere considerato positivo.
   2. Determinare la presenza di un E. coli campione positivo osservando microspot incorporati con cambio CPRG dal giallo al rosso-viola e microspot incorporati con X-Gluc cambiamento da incolore a blu-verde.
   3. Determinare la presenza di un L. monocytogenes campione positivo osservando microspot incorporati con X-InP cambiamento da incolore a indaco.
   4. Determinare la presenza di una Salmonella spp. campione positivo da microspot osservando incorporati con MC cambiamento da colorless al viola-malva.
3. Software Aided Analisi dei dati
   NOTA: condotto per determinare con chiarezza se le reazioni deboli sono positivi o negativi e per consentire un'analisi semi-quantitativa dei risultati.
   1. Lasciare le μPADs asciugare completamente.
   2. Eseguire la scansione del μPAD utilizzando uno scanner a letto piano.
   3. Utilizzare il software ImageJ per elaborare l'immagine.
      1. "Apri" immagine acquisita da analizzare in ImageJ si trova sotto la scheda "File" nel menu principale (o premere "Clt + O").
      2. Invertire l'immagine selezionando "Inverti" che si trova sotto la scheda "Modifica" nel menu principale (o premere "Clt + Maiusc + I").
      3. Utilizzare la scheda "Analizza" del menu principale e selezionare "Imposta Misure ..." per selezionare le misure riportate analizzati.
      4. Assicurarsi che la "intensità di grigio media", "Limit to soglia" e "scatole etichetta di visualizzazione" sonocontrollato, e premere "OK." Imposta come il software analizza ogni area selezionata e come riporta esso.
      5. Utilizzare lo strumento "Oval" per disegnare un cerchio che delinea l'area che si desidera misurare all'interno.
      6. Nella scheda "Analizza" selezionare "Measure" (o premere "Clt + M"). Il software misurare l'intensità di grigio medio nella zona definita e riportarlo in una schermata pop-up che può essere copiato e incollato in Excel per ulteriori analisi.
         NOTA: per analisi più accurate, almeno due repliche tecniche di ciascun campione deve essere eseguita.

Risultati

Come descritto in questo protocollo, la concentrazione di batteri utilizzando gli MMS (Figura 1) può essere eseguita in circa 15-20 min. Gli MMS in costruite da acrilonitrile-butadiene-stirene (ABS) in due componenti separati; un coperchio e una cartuccia sia con un gruppo perno integrato nel quale viene inserito un tampone di garza cilindrico (Figura 1A). Entrambi i componenti sono quindi avvitati insieme formano gli MMS (Figura 1B). Trasformazione basata MMS è azion...

Discussione

Questo protocollo descrive un metodo integrato per rilevare E. coli, Salmonella spp., e L. monocytogenes in acqua agricoltura. Qui, la concentrazione di batteri MMS da grandi volumi (10 L) di acqua agricola, è accoppiato con l'arricchimento di batteri, e la rilevazione colorimetrica batterico-indicativo utilizzando μPADs. La procedura MMS può far fronte a elevato contenuto di particolato nei campioni di acqua concentrando la batteri 10 volte, è abbastanza robusto e semplice per applicazioni sul...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agricultural water			Irrigation water, produce wash water, well water, etc.
Vinyl tubing	Wilmar	BN-CVT1005	1/4" inner diameter,  3/8" outer diameter, available at:  http://www.wilmar.com
Modified Moore Swab cartridge	Lumiere Diagnostics		11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at:  http://www.lumierediagnostics.com.  Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text)
Cheesecloth	Chesapeake Wiper & Supply, Inc.	CC90	Grade #90, 44 x 36 weave, available at:  www.raglady.com
Household Bleach	Various		Sodium hypochlorite concentration approx. 6%
Sodium thiosulphate 5-hydrate	Mallinckrodt Baker Inc	8100-04
Manifold	Built in-house		Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings
Peristaltic pump	Micron Meters	RPP1300	Available at:  http://www.micronmeters.com
Serological pipette	Various		Disposable, 10 ml
Universal preenrichment broth	Difco	223510
Buffered peptone water	Difco	218105
Salmonella supplement	Biomérieux Industry	42650	http://www.biomerieux-usa.com
VIDAS UP Listeria (LPT) Broth	Biomérieux Industry	410848	http://www.biomerieux-usa.com
Vancomycin	Sigma-Aldrich	861987	http://www.sigmaaldrich.com
Pipet-Aid	Various		Drummond DP-110 used here
Shaking incubator	Various		Excella E25, New Brunswick Scientific used here
Micropipette	Various		10 μl, 1 ml
Micropipette tips	Various		Barrier, 10 μl, 1 ml
1.5 microcentrifuge tubes	Various		RNase- and DNase-free
Probe sonicator	Q Sonica LLC	XL-2000 series
µPADs	Avant		Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid]	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A8022
Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG)	Sigma-Aldrich	59767
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc)	Sigma-Aldrich	B8174
5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate)	Sigma-Aldrich	53451
5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP)	Sigma-Aldrich	38896
Petri dishes, polystyrene 100 mm by 15 mm	Various		Sterile
Flat bed scanner	Various		Xerox USB scanner
ImageJ software	National Institutes of Health		http://rsb.info.nih.gov/ij/