מבוסס נייר Colorimetric איתור של<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt;,<em&gt; סלמונלה</em&gt; Spp., ו<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; מכמויות גדולות של מים לחקלאות

Summary

A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (µPAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר זיהוי מהיר של חיידקי colorimetric Escherichia coli, סלמונלה spp., ויסטריה מכמויות גדולות (10 L) של מים לחקלאות. כאן, מים מסוננים דרך הטושים השתנה סטרילי מור (MMS), שמורכבים ממסנן גזה פשוט סגור במחסנית פלסטיק, להתרכז חיידקים. לאחר סינון, מוספים להלא סלקטיבי או סלקטיבי לחיידקי היעד מבוצעים ב- MMS. לגילוי colorimetric של חיידקי היעד, ההעשרה מכן assayed באמצעות מכשירים אנליטיים מבוסס נייר (μPADs) משובצים עם מצעי חיידקים אינדיקטיביים. כל מצע מגיב עם אנזימים חיידקיים היעד מעיד, שהניבו מוצרים צבעוניים שיכול להיות מזוהה מבחינה ויזואלית (זיהוי איכותי) בμPAD. לחלופין, תמונות דיגיטליות של μPADs הגיב יכולות להיות שנוצרו עם סריקה משותפת או מכשירי צילום ונותחו באמצעות תוכנת ImageJ, אלגעייה לפרשנות אובייקטיבית וסטנדרטית יותר של תוצאות. למרות נהלי ההקרנה ביוכימית נועדו לזהות את החיידקים פתוגנים האמור, במקרים מסוימים המיוצרים על ידי אנזימי חיידקי רקע או השפלה של מצעי colorimetric עשוי לייצר חיובי כוזב. לכן, יש צורך באישור שימוש מפלה יותר לאבחון. יחד עם זאת, פלטפורמת ריכוז וזיהוי חיידקים זה היא זול, רגיש (0.1 CFU / גבול גילוי מיליליטר), קלה לביצוע, ומהירה (ריכוז, העשרה, וזיהוי מבוצעים בתוך כ 24hr), מצדיקים את השימוש בו כשיטת סינון ראשונית לאיכות המיקרוביאלית של מים לחקלאות.

Introduction

חשוב שסוכני מחלה במזון מזוהים במהירות ורצוי בהגדרות המבוסס על שדה במטרה להפחית את הנטל של מחלה במזון. אסטרטגיות נפוצות כדי לזהות חיידקים פתוגנים במזון כוללות אפיון ביוכימי, culturing סלקטיבית והפרש, בידוד וזיהוי של מערכת חיסון, וזיהוי מולקולרי. עם זאת, שיטות אלה הקשו על ידי זיהום סדיר, גודל מדגם קטן נבדק, הריכוזים נמוכים לעתים קרובות של החיידקים פתוגניים במזון, דורשים זמני עיבוד ארוכים, ו / או אינם ישימים להגדרות שדה. יתר על כן, תרכובות במטריצות מזון רבות מוגבלים לזיהוי ואבחון יישומים. על מנת לשפר את הסיכוי לגילוי חיידקים, ארצות הברית מנהל המזון והתרופות אמריקניות הציעו כי בדיקות מים לחקלאות (כגון מים מים לשטוף והשקיה) אשר גם באה במגע עם שטח פנים גדול של תוצרת טרייה או משמשת ככלי עבור pזיהום roduce הוא חלופה לבדיקה ישירה של מזון ^1. למרות זאת, הפתוגן-הנטל הטבעי לעתים קרובות הנמוך בשילוב עם אפקט הדילול של דגימת מים החקלאית הנציג עושה שיטות הכנת מדגם לריכוז הפתוגן חיוניות. שיטה כזו תדרוש דגימה בכמויות גדולות של מים (≥ 10 L), פתוגן ריכוז נאות, ותאימות עם אסטרטגיות זיהוי במורד הזרם.

מטליות הותאמו מור (MMS) הם מכשירים זולים, פשוט, ומחוספסים המשמשים לריכוז חיידקים מכמויות גדולות (≥ 10 L) של המים ^2-4. MMS מורכב מקלטת פלסטיק מלאה עם גזה, המשמשת כמסנן גס לכמויות גדולות של מים נשאבות באמצעות הקלטת באמצעות משאבת peristaltic. MMS הוא שיטה בלתי מפלה של ריכוז חיידקים (≥ ריכוז 10 פי) הלוכדת חלקיקי חומר אורגני ולא אורגני, כולל מיקרואורגניזמים בli מעובדדגימות פאונד. סביר להניח כי את היעילות מצוינת של ריכוז של מיקרואורגניזמים המטרה על ידי MMS יכולה להיות מוסברת על ידי העובדה כי מיקרואורגניזמים צפויים להיות מחובר לשבריר סחף החימר או מיקרו אגרגטים האורגניים של המוצקים מרחפים ^3. העיצוב המחוספס של MMS מאפשר להתגבר על מרבית הליקויים הקשורים לשיטות סינון אחרות עבור לכידה וריכוז של חיידקים ממים, כגון סתימה של מסננים, חוסר יכולת לעבד כמויות גדולות, דגימות עם מסנן גבוה עכירות, ועלויות גבוהות. מסיבות אלה, ה-FDA ממליצה שMMS של ישולב נהלים רשמיים לנהלי איסוף דגימה סביבתיים וקשורות לייצר ^5.

הנה, שיטה מתוארת לריכוז, להעשרה, וזיהוי של Escherichia coli, סלמונלה spp., וחיידקים ליסטריה ממים חקלאיים. MMS משמש לריכוז של bacteria, ומשמש גם ככלי להעשרת חיידקים סלקטיבית או לא סלקטיבית. גילוי חיידקים מושגת ביוכימית באמצעות מכשירים אנליטיים מבוסס נייר (μPADs) ^6. יכול להיות מיוצר μPADs כרשתות fluidic או בדיקות מקום באמצעות מגוון של שיטות, כולל photolithography, הדפסת דיו, הטבעה, ושעוות הדפסת ^7-11. דוגמאות של עיצובי fluidic יכולות להיות דפוסי ערוץ הדנדריטים בי המדגם מופקד במרכז ובהמשך זורם למאגרי דיסטלי או דפוסי ערוץ אחד שבו המדגם או המצע הם משכו מהמאגרים החיצוניים של הערוץ על ידי פעולת נימים למרכז ^12. עבור פרוטוקול זה, בחרנו להעסיק למערכי 7 מ"מ בקוטר נייר שעוות מקום שנעוצים עם מצעי chromogenic שיכול להיות מעובד על ידי אנזימים מעידים על מיקרואורגניזמים נבדקו כאן: β-D-galactopyranoside האדום Chlorophenol (CPRG) ו 5 - bromo-4-כלורו-3-indolyl β-D-glucuronide (X-Gluc)לצורך זיהוי של β-galactosidase וβ-glucuronidase הופק על ידי א coli; caprylate 5-bromo-6-כלורו-3-indolyl (caprylate מגנטה) לצורך זיהוי של C8-esterase מיוצר על ידי spp סלמונלה.; ופוספט 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl-מיו-אינוסיטול (X-InP) לצורך זיהוי של C פוספוליפאז phosphatidylinositol הספציפי (PI-PLC) המיוצר על ידי ל ' חיידקי ^6. לפיכך, נוכחותו של חיידק מסוים ניתן להבחין באופן חזותי ללא הצורך בציוד מורכב או נתונים לפרשנות. הסגוליות והרגישות של זיהוי μPAD colorimetric מבוסס אנזים של חיידקי היעד הספציפיים אלה כבר נחקרו בעבר ^6. בנוסף, הרגישות של שיטת ריכוז איתור המשולבת עבור חיידקי היעד אלה הוערכה על ידי יוצרות עלייה חדה של כמויות גדולות של מים עם רמות שנקבעו מראש של מיקרואורגניזמים (נתונים שלא פורסם וBisha et al. ^13).

Protocol

1. ריכוז חיידקים מכמויות גדולות של מים לחקלאות באמצעות MMS

1. MMS הכנה
   1. לחתוך קטע מלבני של אריג 4 רובדי מדידת 40 x 12 סנטימטר.
   2. מקפלים את הגזה לאורך שני הצירים כדי להשיג מלבן 20 x 6 סנטימטר.
   3. מגלגל את הגזה בחוזקה לאורך הציר הארוך שלה כדי ליצור ספוגית גלילית של כ 6 סנטימטר ו -3 ס"מ קוטר.
   4. החיטוי ספוגית הגזה ברדיד אלומיניום, לא חיטוי את הקלטת. לטהר את הקלטת על ידי השריית אותו ל30 דקות ב10% אקונומיקה משק בית, ולבטל את הכלור השיורי על ידי השריית את הקלטת ל15 דקות בpentahydrate thiosulfate נתרן (Na ₂ S ₂ O ₃ · 5H ₂ O) פתרון (50 מ"ג / ליטר הכין במים סטריליים).
   5. הכנס את ספוגית לקלטת-MMS.
      הערה: אם הגרסה שאינה חד פעמית של קלטת MMS משמשת, להתחיל עם גיליון 4 הרובד של אריגיasuring 80 x 22 סנטימטר, לקפל אותו ל40 x 11 ס"מ ומגלגלים אותו לצורת גליל כ 11 סנטימטר ו -6 ס"מ קוטר.
   6. להרכיב-MMS.
   7. צרף צינורות ויניל לברזים משני צידי MMS, כדי להבטיח את צינורות שומרת באופן מלא לברזים, ולתקן את הצינור לתוך משאבת peristaltic. ודא כי במעלה הזרם בצינור של משאבת peristaltic הוא באורך מספיק לדגימה.
2. ריכוז של חיידקים
   1. לדוגמא לפחות 10 L של מים לחקלאות על ידי הפעלת משאבת peristaltic במהירות גבוהה.
   2. לאחר הדגימה היא שלמה, למשוך את מפרצון משאבת peristaltic מדגימת המים ולהמשיך להפעיל את המשאבה עד שאין מים בשפכים הוא ציין יציאת MMS.
   3. אם סעפת משמשת להפעלה כמה דגימות באותו הזמן, לאסוף את השפכים של כל-MMS, וכאשר 10 L מסונן דרך MMS אחת לסגור את הברז לMMS מסוים ולהמשיך להפעיל את המשאבה.
      1. כאשר דגימת is הושלם, למשוך את מפרצון משאבת peristaltic מהמים לחקלאות, לפתוח את כל השסתומים של הסעפת, ולהמשיך להפעיל את המשאבה עד שאין מים בשפכים הוא ציין יציאת MMSs.
3. כאשר ריכוז הושלם עבור כל MMSs, להסיר בזהירות את הצינור ויניל מברזי MMS ומכסה את הברזים משני צידי ב-MMS. MMS כתרים בחוזקה יכול להיות מאוחסן במשך שעות עד 12 לפני הוספת מדיה העשרה.

2. MMS העשרה והכנת דוגמאות

1. העשרה
   1. הברג החוצה את המכסה של MMS, וסביבה נקיה מחיידקים להוסיף 20 מיליליטר של מרק העשרת סטרילי המתאים. השתמש באחת MMS לכל העשרה סלקטיבית. לחלופין, לבצע העשרה הלא סלקטיבי להפיץ כל שלושת חיידקי היעד במדגם זהה.
      הערה: אם הגרסה שאינה חד פעמית של קלטת MMS משמשת, סביבה נקיה מחיידקים להסיר את מסנן גזה מהקלטת ומניח בשקית סטרילית לפני המודעהדינג 225 מיליליטר של התקשורת להעשרה המתאימה.
      1. להעשרתו של ע ' coli, להוסיף 20 מיליליטר של מים שנאגרו peptone (BPW) בתוספת 8 מ"ג / ליטר של hydrochloride vancomycin.
      2. להעשרה של spp סלמונלה., להוסיף 20 מיליליטר של BPW בתוספת תוסף סלמונלה (4 מיליליטר / L).
      3. להעשרתו של ל ' חיידקי, להוסיף 20 מיליליטר של מרק Vidas UP ליסטריה (LPT).
      4. להעשרה הלא סלקטיבי בו זמנית לכל שלושת מיקרואורגניזמים באמצעות MMS יחיד, השתמש מרק preenrichment אוניברסלי (UPB).
   2. הברג את המכסה של MMS על גב בחוזקה. ודא שברזיהם בחוזקה כתרים כדי שלא יישפכו וזיהום אפשרי בהעשרה.
   3. דגירה MMS לתקופה של עד 18-24 שעות בחממה רועדת בסל"ד 200. השתמש 42 מעלות צלזיוס למשך E. spp coli וסלמונלה. העשרה סלקטיבית. השתמש ב-C ° 30 לL. העשרה סלקטיבית חיידקי, ולהשתמש 37 & #176; C להעשרה הלא סלקטיבי.
2. לדוגמא הכנה
   1. כאשר דגירה הושלמה, להסיר את MMS מהחממה, uncap אחד מהברזים, ועדינות לוותר על 0.5 מיליליטר לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge. לחלופין, להתיר MMS וטפטף החוצה 0.5 מיליליטר של העשרת הלילה.
      הערה: אם לא הגרסה חד פעמית של קלטת MMS משמשת, פיפטה 0.5 מיליליטר של העשרה מהשקית.
   2. לניתוח colorimetric של E. העשרה סלקטיבית coli, או לניתוח של המוספים להלא סלקטיבי, sonicate 0.5 מיליליטר של העשרה בW 5, 22 קילוהרץ ל20 שניות באמצעות sonicator בדיקה.

3. הכנה והטבעה של מצעי Colorimetric בμPADs

1. הכן מספיק μPADs עבור כל דגימה ויעד שנבדק. כדי לזהות E. coli להכין μPADs CPRG ו-X-Gluc, לspp סלמונלה. איתור להכין μPADs MC, ועבור ל ' monocytאיתור ogenes להכין μPADs X-InP.
   1. הכן את חיץ HEPES [M 0.1 HEPES עם 0.1% הסרום אלבומין שור (BSA)] למצעי colorimetric ולהתאים את ה-pH של למאגר על פי המצע שהוא הולך להיות בשימוש: pH 7.5 להכנת CPRG או X-Gluc, pH 9 לMC, ו-pH 7 לX-InP.
   2. הכן פתרונות מניות של מצעים בpH מותאם חיץ HEPES בריכוזים של 3 מ"מ (CPRG), 62.5 מ"מ (X-Gluc), 15 מ"מ (MC), 100 מ"מ (X-InP). הגן על פתרונות המניות מהאור.
   3. הנח את μPADs בתוך צלחת פטרי סטרילית, ולאחר מכן להשתיל microspot μPAD עם 24 μl של כל פתרון מניות מצע.

4. באיתור ובניתוח נתונים

1. איתור
   1. הוסף 6 μl של המדגם המועשר לכל microspot μPAD המתאים כלול בצלחת פטרי.
   2. הנח את הכיסוי אחורי על צלחת פטרי ולאטום אותו עם Parafilm.
   3. דגירה מדגםעם μPAD ב37 מעלות צלזיוס למשך עד 3 שעות, כדי לאפשר פיתוח צבע וייבוש של microspots.
2. בדיקה ויזואלית של התוצאות
   1. לבצע זיהוי על ידי בדיקה ויזואלית פשוטה של ​​השינויים בצבע של μPADs.
      הערה: בדרך כלל, תגובות חריפות המייצרות שינויי צבע סופיים צפויות הבא 18-24 שעות של העשרה, שאמור לייתר את הצורך בהמשך הבירור וצריך להיחשב חיובי.
   2. לקבוע את קיומו של א מדגם חיובי coli על ידי התבוננות microspots נעוץ בשינוי CPRG מצהוב לאדום סגול וmicrospots נעוץ בשינוי X-Gluc בין חסר צבע לכחול ירוק.
   3. לקבוע את נוכחותם של ל ' חיידקי לדגימה חיובית על ידי התבוננות microspots המוטבעת עם שינוי X-InP בין חסר צבע לכחול כהה.
   4. לקבוע את הנוכחות של spp סלמונלה. מדגם חיובי על ידי microspots התבוננות שנעוצים בשינוי MC מcolorless לסגול סגול.
3. תוכנת ניתוח נתונים בעזרת
   הערה: נערך על מנת לקבוע באופן ברור אם תגובות חלשות הן חיוביות או שליליות ולאפשר ניתוח חצי כמותית של התוצאות.
   1. לאפשר μPADs לייבוש באופן מלא.
   2. סרוק את μPAD באמצעות סורק שטוח מיטה.
   3. השתמש בתוכנת ImageJ לעבד את התמונה.
      1. "פתח את" תמונה סרוקה להיות מנותח בImageJ נמצא תחת לשונית "קובץ" בתפריט הראשי (או העיתונות "CLT + O").
      2. היפוך צבעים בתמונת בחירה "מרחב" הממוקם תחת הלשונית "ערוך" בתפריט הראשי (או העיתונות "CLT + Shift + I").
      3. השתמש בכרטיסייה "נתח" בתפריט הראשי ובחר "מדידות הגדר ..." כדי לבחור את המדידות דיווחו מנותחות.
      4. ודא כי "עוצמת הממוצעת האפורה", "לימיט לסף," ואת "קופסות תווית תצוגה" הןבדק, ולחץ על "אישור". זה מגדיר את אופן התוכנה מנתח כל אזור שנבחר וכיצד היא מדווחת עליו.
      5. השתמש בכלי "הסגלגל" לצייר מעגל שמתאר את האזור שברצונך למדוד בתוך.
      6. תחת הלשונית "נתח" בחר "מדוד", (או לחץ "CLT + M"). התוכנה תהיה למדוד את עוצמת האפורה הממוצעת באזור המוגדר ולדווח על כך במסך מוקפץ שניתן להעתיק ולהדביק להצטיין לניתוח נוסף.
         הערה: לניתוח מדויק יותר, לפחות שתי חזרות טכניות של כל דגימה צריכה להתבצע.

תוצאות

כפי שתואר בפרוטוקול זה, ריכוז של חיידקים באמצעות MMS (איור 1) יכול להתבצע בתוך כ 15-20 דקות. MMS בנבנה מאקריל ניטריל אקרילוניטריל (ABS) בשני מרכיבים נפרדים; מיכסה ומחסנית הן עם הרכבה רז שולבה בי ספוגית גזה גלילית מוכנסת (איור 1 א). לאחר מכן שני הרכיבים דפוקים י?...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה משולבת לאיתור E. coli, סלמונלה spp., ול ' חיידקי במים לחקלאות. כאן, ריכוז MMS של חיידקים מכמויות גדולות (10 L) של מים לחקלאות, בשילוב עם העשרה בקטריאלי, וזיהוי colorimetric חיידקים-מעידים באמצעות μPADs. הליך MMS יכול להתמודד עם תוכן גבוה חלקיקים בדגימות ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agricultural water			Irrigation water, produce wash water, well water, etc.
Vinyl tubing	Wilmar	BN-CVT1005	1/4" inner diameter,  3/8" outer diameter, available at:  http://www.wilmar.com
Modified Moore Swab cartridge	Lumiere Diagnostics		11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at:  http://www.lumierediagnostics.com.  Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text)
Cheesecloth	Chesapeake Wiper & Supply, Inc.	CC90	Grade #90, 44 x 36 weave, available at:  www.raglady.com
Household Bleach	Various		Sodium hypochlorite concentration approx. 6%
Sodium thiosulphate 5-hydrate	Mallinckrodt Baker Inc	8100-04
Manifold	Built in-house		Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings
Peristaltic pump	Micron Meters	RPP1300	Available at:  http://www.micronmeters.com
Serological pipette	Various		Disposable, 10 ml
Universal preenrichment broth	Difco	223510
Buffered peptone water	Difco	218105
Salmonella supplement	Biomérieux Industry	42650	http://www.biomerieux-usa.com
VIDAS UP Listeria (LPT) Broth	Biomérieux Industry	410848	http://www.biomerieux-usa.com
Vancomycin	Sigma-Aldrich	861987	http://www.sigmaaldrich.com
Pipet-Aid	Various		Drummond DP-110 used here
Shaking incubator	Various		Excella E25, New Brunswick Scientific used here
Micropipette	Various		10 μl, 1 ml
Micropipette tips	Various		Barrier, 10 μl, 1 ml
1.5 microcentrifuge tubes	Various		RNase- and DNase-free
Probe sonicator	Q Sonica LLC	XL-2000 series
µPADs	Avant		Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid]	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A8022
Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG)	Sigma-Aldrich	59767
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc)	Sigma-Aldrich	B8174
5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate)	Sigma-Aldrich	53451
5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP)	Sigma-Aldrich	38896
Petri dishes, polystyrene 100 mm by 15 mm	Various		Sterile
Flat bed scanner	Various		Xerox USB scanner
ImageJ software	National Institutes of Health		http://rsb.info.nih.gov/ij/