التحقيق البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة

Summary

التفاعلات بين البروتينات الأساسية لجميع العمليات الخلوية. باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة، والتفاعل بين زوج من البروتينات يمكن رصدها في الخلايا الحية وفي الوقت الحقيقي. وعلاوة على ذلك، فإن آثار الطفرات المحرضة يمكن تقييمها.

Abstract

فحوصات على أساس نقل الطاقة الرنين ضوء بارد (بريت) توفر وسيلة حساسة وموثوق بها لرصد تفاعلات البروتين البروتين في الخلايا الحية. بريت هو نقل غير الإشعاعي للطاقة من 'المانحة' انزيم luciferase المراسل إلى "متقبل" بروتين فلوري. في التكوين الأكثر شيوعا من هذا الاختبار، هو الجهة المانحة Renilla كلوية الشكل luciferase المراسل ومتقبل هو بروتين فلوري أصفر (YFP). لأن كفاءة نقل الطاقة هو بقوة تعتمد على المسافة، ومراقبة ظاهرة بريت يتطلب أن الجهات المانحة ومتقبل يكون على مقربة. لاختبار تفاعل بين اثنين من البروتينات ذات الأهمية في خلايا الثدييات مثقف، يتم التعبير عن بروتين واحد كما التحام مع luciferase المراسل والثانية باعتبارها الانصهار مع YFP. التفاعل بين اثنين من البروتينات ذات الاهتمام قد جعل المانحين ومتقبل قريبة بما فيه الكفاية لنقل الطاقة تحدث. مقارنة مع تقنيات أخرى للتحقيق في البروتين البروتين فيteractions، مقايسة بريت حساس، يتطلب القليل التدريب العملي على الوقت وقليل من الكواشف، وغير قادرة على الكشف عن التفاعلات التي هي ضعيفة، عابرة، أو تعتمد على البيئة البيوكيميائية وجدت داخل الخلية الحية. ولذلك هو النهج المثالي لتأكيد التفاعلات المفترضة التي اقترحها الخميرة اثنين الهجين أو مطياف الكتلة البروتيوميات الدراسات، وبالإضافة إلى ذلك فمن مناسبة تماما لرسم الخرائط المناطق التفاعل، وتقييم تأثير التعديلات بعد متعدية على البروتين البروتين التفاعلات، و تقييم أثر الطفرات في الحمض النووي التي تم تحديدها المريض.

Introduction

كلا الربط الكلاسيكية والجيل المقبل من يحلل التسلسل من اضطرابات الإنسان والكشف عن أهميتها السريرية من البروتينات المشاركة في مجموعة من المسارات البيولوجية. غالبا ما يكون الحال أنه قبل التعرف عليهم في مثل هذه الدراسات، كان هناك تحقيق ضئيلة أو معدومة للدور البيولوجي لهذه البروتينات. واحد السبل المثمرة لبدء استكشاف الوظيفة البيولوجية للبروتين من الفائدة هو تحديد البروتينات الأخرى التي تتفاعل مع في سياقها الفسيولوجية. تميز الشبكات الجزيئية في هذا الشكل يوفر نظرة ثاقبة المسارات البيولوجية الكامنة وراء النمط الظاهري الإنسان.

النهج الأكثر استخداما فحص واسعة النطاق لتحديد الشركاء التفاعل مرشح للبروتينات ذات الاهتمام هي الخميرة فحص اثنين من الهجين ¹ والبروتينات القائم على قياس الطيف الكتلي ^2. ويمكن لهذه الأساليب أن تكون ناجحة جدا في اقتراح البروتينات التفاعل المحتملة، ولكن عالبريد عرضة لنتائج إيجابية كاذبة. لذلك، تأكيدا لتفاعل حددها الخميرة اثنين الهجين أو فحص قياس الطيف الكتلي يتطلب المصادقة على التفاعل باستخدام تقنية الثانية. وعادة ما يتم استخدام مناعي المشترك أو المنسدلة فحص لهذا الغرض ^3. عيب واحد من استخدام هذه التقنيات من أجل التحقق هو شرط لتحلل الخلية، التي تقضي على الظروف داخل الخلايا التي قد تكون ضرورية للحفاظ على بعض التفاعلات البروتين. والعيب الثاني هو أن ضعف أو عابرة تفاعلات البروتين يمكن أن تتعطل أثناء الغسيل الخطوات. وعلاوة على ذلك، فإن هذه المقايسات مطالبة التدريب العملي على هامة الزمن، محدودة في عدد العينات التي يمكن معالجتها في وقت واحد، وغالبا ما تتطلب وقتا طويلا الأمثل من الكواشف والبروتوكولات.

للتغلب على بعض المشاكل المرتبطة التجارب المشتركة مناعي، وقد وضعت عدة فحوصات على أساس الفلورسنت وbiolumالبروتينات inescent التي يمكن استخدامها في الخلايا الحية. استندت أول هذه المقايسات على الإسفار (أو فورستر) نقل الطاقة الرنين (الحنق)، ونقل غير الإشعاعي للطاقة بين اثنين من البروتينات الفلورية مع تداخل الانبعاثات والإثارة أطياف ^4. كفاءة نقل الطاقة هو بقوة تعتمد على المسافة، وبالتالي رصد ظاهرة الحنق يتطلب أن fluorophores المانحة ومتقبل يكون على مقربة. لاختبار تفاعل بين اثنين من البروتينات من الفائدة، يتم التعبير عن بروتين واحد كما التحام مع fluorophore المانحة (بروتين فلوري سماوي عادة؛ CFP)، والثاني باعتباره الانصهار مع fluorophore متقبل (بروتين فلوري الصفراء عادة؛ YFP). التفاعل بين اثنين من البروتينات ذات الاهتمام قد جعل fluorophores المانحة ومتقبل قريبة بما فيه الكفاية لنقل الطاقة لتحدث، الأمر الذي سيؤدي إلى زيادة يمكن قياسها في انبعاث الضوء من YFP متقبل بالنسبة إلى الجهات المانحة CFP. FRوقد ET الناجحة في الكشف عن البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية ^4. العيب الرئيسي من استخدام الحنق للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات هو شرط لإضاءة في الهواء الطلق لالإثارة من fluorophore المانحة. النتائج إضاءة في الهواء الطلق في خلفية عالية في إشارة الانبعاثات، الإثارة غير المرغوب فيها من متقبل، وphotobleaching من كل من الجهات المانحة وfluorophores المتقبلة. هذه الآثار تقلل من حساسية من فحص للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات.

وهناك تعديل للمقايسة الحنق الذي يتغلب على مشكلة خلفية عالية من الإضاءة الخارجية هو ضوء بارد نقل الطاقة الرنين (بريت) مقايسة ^5،6. في النظام بريت يتم استبدال fluorophore المانحة بواسطة انزيم luciferase المراسل. وبالتالي يتم إنشاء الطاقة من أجل الإثارة من fluorophore متقبل داخل النظام عن طريق أكسدة الركيزة luciferase المراسل، مما يجعل إضاءة في الهواء الطلق لا لزوم لها. في معظمالتكوين شيوعا من هذا الاختبار، هو الجهة المانحة Renilla كلوية الشكل luciferase المراسل ومتقبل هو YFP (لمناقشة المانحة البديلة والبروتينات المتقبلة نرى Pfleger آخرون ^5). وفقا لذلك، في هذا النظام، وتنصهر بروتين من الفائدة لو luciferase بروتين التفاعل المحتمل لYFP، أو العكس بالعكس. مقايسة بريت يتطلب إضافة coelenterazine باعتبارها الركيزة لluciferase المراسل. لأن coelenterazine هي خلايا قابلة للاختراق، فمن الممكن لتنفيذ المقايسات بريت في الخلايا الحية. ومع ذلك، coelenterazine الأم غير مستقرة في محلول مائي، وانهيار انزيم مستقلة عن coelenterazine على حد سواء يقلل من تركيز الركيزة المتاحة للفحص ويولد autoluminescence، مما يقلل من حساسية قياسات luciferase النشاط. وقد تيسر استخدام بريت في الخلايا الحية من خلال تطوير coelenterazines المحمية، التي هي مستقرة في محلول مائي ولكن المشقوق بواسطة استريز عصاري خلويو بعد نشرها عبر غشاء الخلية لتوليد coelenterazine نشطة داخل الخلية ^7.

بعد إضافة الركيزة لالخلايا معربا عن luciferase المراسل والبروتينات YFP الانصهار، وكميا نقل الطاقة الناتجة عن التفاعلات البروتين البروتين من خلال مراقبة الانبعاثات من luciferase المراسل وYFP. بسبب تفاعلات البروتين يمكن رصدها مباشرة في الخلايا الحية في لوحات متعددة جيدا، وفحص بريت يشكل، طريقة بسيطة قابلة للتحقق من صحة التفاعلات المفترضة التي هي من حيث التكلفة والوقت فعالة.

بالإضافة إلى التحقق من صحة interactors المفترضة المحددة في دراسات فرز البروتين، يمكن للنظام بريت أن تستخدم أيضا لinteractors مرشح اختبار الناشئة عن الدراسات البيوكيميائية والهيكلية السابقة على البروتين من الفائدة. مرة واحدة وقد تم تثبت وجود تفاعل البروتين البروتين (سواء باستخدام مقايسة بريت أو عن طريق تقنيات أخرى)، فإن هناك إمكانية لفحص BRET أن تكون خطة الإدارة البيئيةloyed أخرى لتوصيف التفاعل. على سبيل المثال، المناطق التفاعل يمكن تعيينها عن طريق توليد إصدارات اقتطاع من البروتينات، وإشراك بقايا محددة في التفاعل يمكن البرهنة من خلال خلق الطفرات نقطة. وعلاوة على ذلك، وأثر تغييري من تعديلات ما بعد النقل أو الجزيئات الصغيرة (مثل المخدرات أو بروابط) على تفاعلات البروتين البروتين يمكن التحقيق ^8-10.

لديه فحص بريت أيضا إمكانات كبيرة للتحقيق طفرات في الحمض النووي التي تم تحديدها المريض. في الحالات التي تم فيها إنشاء دور المسبب للطفرة، ودراسة تأثير الطفرة على البروتين البروتين التفاعلات باستخدام BRET قد تكشف المزيد عن المسببات الجزيئية من النمط الظاهري ^11. منذ ظهور منهجيات تسلسل الجيل المقبل، فإنه من الشائع على نحو متزايد لعدة طفرات الإضرار يحتمل الكشف عن هويته داخل الفرد، وفي هذه الحالة فإنه من غير الواضح التي هي RELEVANT إلى النمط الظاهري ^12. في هذه الحالة قد يكون الفحص بريت قيمة في تقييم أثر الطفرات على وظيفة البروتين، وبالتالي أهميتها لهذا الاضطراب.

Protocol

1. إنشاء البلازميدات

1. Subclone على cDNAs لكل بروتين من الفائدة في كل من pLuc وpYFP ناقلات، وذلك باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية (الشكل 1). لبروتوكولات مفصلة نرى الأخضر وآخرون ^13.
2. تسلسل كافة للتحقق من أن يبني البروتينات من الفائدة في الإطار مع تسلسل لوك / YFP مع عدم وجود التدخل الكودونات توقف.
3. تنفيذ المقايسات الفنية كما تريد للتأكد من أن البروتينات الانصهار الاحتفاظ النشاط البيولوجي. في الحالة المعروضة هنا تم التأكد توطين التحت خلوية من البروتينات الانصهار YFP بواسطة المجهر مضان.
4. جعل البلازميدات التعبير عن البروتينات المناسبة السيطرة لوك وYFP عن طريق الهندسة الإشارات الاستهداف ذات الصلة في pLuc وpYFP ناقلات التعبير. في الحالة المعروضة هنا، وتوليد لوك وYFP يبني استهدفت النووية عن طريق إدراج إشارة توطين النووية في pLuc وpYFP ناقلات.
5. جعلوبناء السيطرة الإيجابية التي تنصهر لوك وYFP إلى ببتيد واحد. في الحالة المعروضة هنا، وتوليد تحكم إيجابية والتي يتم إدراج تسلسل الترميز YFP في ناقلات pLuc.
6. اختيار البلازميد حشو محايدة لاستخدامها لتحقيق التعادل كتلة الحمض النووي في يمزج ترنسفكأيشن. استخدام البلازميد التي لا يوجد لديه المروج حقيقية النواة، وبالتالي سيكون غير فعال transcriptionally في خلايا الثدييات، مثل الاستنساخ ناقلات البكتيرية.

2. إعداد الحمض النووي خلطات

1. تقدير تركيز كل البلازميدات وصفها في القسم 1 على أساس الامتصاصية في 260 نانومتر (1 وحدة امتصاص ما يعادل 50 ميكروغرام / مل من الحمض النووي). تحديد الكتلة الجزيئية لكل البلازميد عن طريق ضرب عدد من أزواج قاعدة 650 دا. استخدام التركيز والكتلة الجزيئية لحساب تركيز المولي لكل إعداد البلازميد. تمييع الاستعدادات الحمض النووي البلازميد إلى تركيز من 36 نانومتر. وستكون هذه الأسهم العملالتي سيتم استخدامها لإعداد يمزج الحمض النووي لترنسفكأيشن.
2. إعداد مزيج الحمض النووي تحكم تحتوي على 1،800 نانوغرام من حشو البلازميد في الحجم النهائي من 20 ميكرولتر من الماء.
3. إعداد مزيج الحمض النووي تحكم تحتوي على 5 ميكرولتر من بناء pLuc السيطرة. إضافة حشو البلازميد ليصبح العدد الإجمالي الشامل الحمض النووي إلى 1،800 نانوغرام. إضافة الماء لجلب الحجم النهائي إلى 20 ميكرولتر.
4. إعداد مزيج الحمض النووي تحكم تحتوي على 5 ميكرولتر من pLuc مراقبة بناء و 5 ميكرولتر من pYFP مراقبة بناء. إضافة حشو البلازميد ليصبح العدد الإجمالي الشامل الحمض النووي إلى 1،800 نانوغرام. إضافة الماء لجلب الحجم النهائي إلى 20 ميكرولتر.
5. إعداد مزيج الحمض النووي تحكم تحتوي على 5 ميكرولتر من بناء مراقبة إيجابية. إضافة حشو البلازميد ليصبح العدد الإجمالي الشامل الحمض النووي إلى 1،800 نانوغرام. إضافة الماء لجلب الحجم النهائي إلى 20 ميكرولتر.
6. إعداد DNA التالية يمزج لاختبار homodimerization من البروتين من الفائدة، X. للحصول على كل مزيج الحمض النووي الجمع بين 5 ميكرولتر من pLuc ذات الصلة وبناء 5 ميكرولتر من السنة التحضيريةFP بناء. إضافة حشو البلازميد ليصبح العدد الإجمالي الشامل الحمض النووي إلى 1،800 نانوغرام. إضافة الماء لجلب الحجم النهائي إلى 20 ميكرولتر.
   A) pLuc السيطرة وpYFP-X
   B) pLuc-X وpYFP السيطرة
   C) pLuc-X وpYFP-X
7. إعداد DNA التالية يمزج لاختبار التفاعل بين زوج من البروتينات من الفائدة، X و Y. لكل مزيج الحمض النووي الجمع بين 5 ميكرولتر من pLuc ذات الصلة وبناء 5 ميكرولتر من pYFP بناء. إضافة حشو البلازميد ليصبح العدد الإجمالي الشامل الحمض النووي إلى 1،800 نانوغرام. إضافة الماء لجلب الحجم النهائي إلى 20 ميكرولتر.
   A) pLuc السيطرة وpYFP-X
   B) pLuc-X وpYFP السيطرة
   C) pLuc السيطرة وpYFP-Y
   D) pLuc-Y وpYFP السيطرة
   E) pLuc-X-Y وpYFP
   F) pLuc-Y وpYFP-X

3. ترنسفكأيشن

1. الحصاد subconfluent الخلايا HEK293 من 75 سم ² القارورة. تمييع 10٪ من مجموع الخلايا في 13 مل من مستنبت. الاستغناء 130 ميكرولتر من تعليق خلية في كل بئر من الأبيضواضح القاع 96 جيدا نسيج لوحة الثقافة. الخلايا الثقافة لمدة 24 ساعة.
2. حساب عدد من الآبار لتكون transfected بضرب عدد من يمزج الحمض النووي عن طريق 3. إحضار المصل خالية مستنبت إلى درجة حرارة الغرفة. إعداد مزيج الرئيسي تحتوي على 6.3 ميكرولتر من المصل خالية المتوسطة و 0.18 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن لكل بئر. مزيج من قبل vortexing واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
3. إعداد الخلائط ترنسفكأيشن عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من مزيج الحمض النووي إلى 20 ميكرولتر من المصل خالية المتوسطة / كاشف ترنسفكأيشن مزيج الرئيسي. لا الدوامة. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
4. بالنقل ثلاثة آبار مع كل مزيج ترنسفكأيشن الاستغناء 6.5 ميكرولتر من مزيج ترنسفكأيشن لكل بئر. ثقافة الخلايا ل36-48 ساعة أخرى.

4. قياس بريت الإشارة

1. حل الخلية الحية luciferase المراسل الركيزة في 34 ملغ / مل في DMSO من قبل vortexing.
2. تمييع المعاد الخلية الحية luciferase المراسل الركيزة في 1:1،000 في التخفيف المتوسطة الركيزة عإعادة تحسنت إلى 37 درجة مئوية. سماح 50 ميكرولتر من الركيزة التخفيف المتوسطة لكل بئر. دوامة لخلط. قد تشكل راسب، لكنها لن تتدخل في الفحص.
3. نضح مستنبت من لوحة 96 جيدا. الاستغناء 50 ميكرولتر من المخفف الخلية الحية luciferase المراسل الركيزة في كل بئر. خلايا الثقافة لا يقل عن 2 ساعة (تصل إلى 24 ساعة).
4. إزالة الغطاء عن لوحة 96 جيدا واحتضان لوحة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة داخل luminometer.
5. قياس الانبعاثات من لوك واحد YFP جيدا في كل مرة. قياس الانبعاثات من لوك باستخدام فلتر حجب الموجات الأطول من 470 نانومتر. قياس الانبعاثات من YFP باستخدام 500-600 نانومتر الفرقة تمرير التصفية. دمج إشارات الانبعاثات أكثر من 10 ثانية.

5. تحليل البيانات

1. متوسط ​​قراءات الانبعاثات لوك من 3 الآبار التي لم تتلق سوى البلازميد حشو. طرح هذه القيمة من كل القراءات الأخرى الانبعاثات لوك لإنتاج القيم الانبعاثات لوك، طرح الخلفية.
2. متوسط ​​قراءات الانبعاثات YFP من 3 الآبار التي لم تتلق سوى البلازميد حشو. طرح هذه القيمة من كل القراءات الأخرى الانبعاثات YFP لإنتاج القيم الانبعاثات YFP-تطرح الخلفية.
3. لكل بئر، تقسيم YFP قيمة الانبعاثات طرح الخلفية من قبل لوك قيمة الانبعاثات طرح خلفية لإعطاء نسبة بريت غير المصححة.
4. متوسط ​​نسب بريت غير المصححة من الآبار الثلاث التي تم transfected مع البلازميد فقط pLuc السيطرة. طرح هذه القيمة من سائر النسب بريت غير المصححة لإعطاء نسب بريت تصحيحها.
5. لكل من مجموعات المتبقية من نسب تصحيح بريت، متوسط ​​القيم من الآبار الثلاثة transfected للحصول على نسبة بريت النهائي.

النتائج

ويتضح مبدأ مقايسة بريت في الشكل 2. ويصور الإعداد الفحص المستخدمة في جميع أنحاء التجارب المقدمة هنا في الشكل 3. أكد الكشف عن إشارة بريت قوية من خلايا transfected مع البروتين الانصهار luciferase المراسل-YFP أن نقل الطاقة كان يمكن ملاحظتها في هذا الإعداد التجريبية ...

Discussion

تصميم بنيات التعبير البروتين الانصهار هو خطوة حاسمة في إعداد مقايسة بريت. في التجارب المعروضة هنا، وتنصهر البروتينات التي تهم C-محطة من luciferase المراسل أو YFP. ومن الممكن أيضا، وربما يكون من الضروري، لتلتحم البروتينات إلى N-محطة من luciferase المراسل / YFP. بالنسبة لبعض البروتي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanodrop 8000	Nanodrop		Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96-microwell plates, flat bottom, white	Greiner Bio One	655098	White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software	TECAN		Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.
pLuc, pYFP, positive control plasmid	N/A	N/A	Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells	ECACC	85120602	Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red	Gibco	41966	This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)	Gibco	21063	This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum	Gibco	10270	For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent	Novagen	70967	If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO	Sigma	D2650	Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.
EnduRen live-cell substrate	Promega	E6481	Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.