Étudier les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes en utilisant le transfert d'énergie de résonance de bioluminescence

Résumé

Les interactions entre protéines sont essentielles à tous les processus cellulaires. Utilisation Bioluminescence Resonance Energy Transfer, l'interaction entre une paire de protéines peut être surveillée dans des cellules vivantes et en temps réel. En outre, les effets des mutations potentiellement pathogènes peuvent être évaluées.

Résumé

Essais basés sur le transfert d'énergie de résonance de bioluminescence (BRET) fournissent un moyen sensibles et fiables pour surveiller les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes. BRET est le transfert non radiatif de l'énergie à partir d'un "donneur" à une enzyme luciférase "accepteur" protéine fluorescente. Dans la configuration la plus courante de ce dosage, le donneur est la luciférase de Renilla et l'accepteur est une protéine fluorescente jaune (YFP). Parce que l'efficacité du transfert d'énergie est fortement dépendant de la distance, de l'observation du phénomène BRET exige que le donneur et l'accepteur se trouver à proximité. Pour tester une interaction entre deux protéines d'intérêt dans des cellules de mammifères en culture, une protéine est exprimée comme une fusion avec la luciférase et la seconde comme une fusion avec YFP. Une interaction entre les deux protéines d'intérêt peut apporter le donneur et accepteur suffisamment proche pour le transfert de l'énergie de se produire. Par rapport à d'autres techniques d'investigation protéine-protéine dansinteractions, l'essai BRET est sensible, nécessite peu de mains sur le temps et quelques réactifs, et est capable de détecter les interactions qui sont faibles et transitoires, ou dépendant de l'environnement biochimique trouvé dans une cellule vivante. Il s'agit donc d'une approche idéale pour confirmer les interactions putatives ont été proposées par les deux hybrides de levure ou des études de protéomique par spectrométrie de masse, et en outre, il est bien adaptée pour les régions de cartographie interagissant, l'évaluation de l'effet de modifications post-traductionnelles sur les interactions protéine-protéine, et évaluer l'impact des mutations identifiées dans l'ADN du patient.

Introduction

Tant liaison classique et nouvelle génération analyses séquençage de troubles humains sont révélateurs de la pertinence clinique de protéines impliquées dans une gamme de voies biologiques. Il est souvent le cas que, préalablement à leur identification dans de telles études, on a observé peu ou pas d'investigation du rôle biologique de ces protéines. Une piste intéressante pour commencer à explorer la fonction biologique d'une protéine d'intérêt est d'identifier d'autres protéines interagit avec dans son contexte physiologique. Caractérisant les réseaux moléculaires de cette façon permet de mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents du phénotype humain.

Le dépistage à grande échelle le plus fréquemment utilisé des approches pour identifier les partenaires d'interaction de candidats pour des protéines d'intérêt sont la levure dépistage double-hybride ¹ et protéomique basée sur la spectrométrie de masse ^2. Ces méthodes peuvent être très réussie en proposant des protéines interagissant potentiels, mais are vulnérables à des résultats faussement positifs. Par conséquent, la confirmation d'une interaction identifié par deux hybrides de levure ou de dépistage de la spectrométrie de masse nécessite l'interaction de validation en utilisant une seconde technique. Généralement, une co-immunoprécipitation ou dosage déroulant est utilisé à cet effet ^3. Un inconvénient de l'utilisation de telles techniques de validation est la condition pour la lyse des cellules, ce qui détruit les conditions intracellulaires qui peuvent être essentielles pour le maintien de certaines interactions protéiques. Un deuxième inconvénient est que les interactions entre protéines faibles ou transitoires peuvent être perturbées lors des étapes de lavage. En outre, ces dosages demandent significatives le temps de manipulation, sont limités dans le nombre d'échantillons qui peuvent être traités en même temps, et nécessitent souvent l'optimisation des temps de réactifs et de protocoles.

Pour surmonter certains des problèmes associés à des expériences de co-immunoprécipitation, plusieurs dosages ont été développés sur la base de fluorescence et bioluminescent protéines qui peuvent être utilisées dans des cellules vivantes. Les premiers essais ont été basés sur la fluorescence (ou Förster) de transfert d'énergie par résonance (FRET), le transfert non radiatif de l'énergie entre deux protéines fluorescentes avec chevauchement spectres d'émission et d'excitation ^4. L'efficacité du transfert d'énergie est fortement dépendant de la distance, par conséquent, l'observation du phénomène de FRET nécessite que les fluorophores donneurs et accepteurs d'être en étroite proximité. Pour tester une interaction entre deux protéines d'intérêt, une protéine est exprimée comme une fusion avec le fluorophore donneur (protéine fluorescente communément cyan; PCP) et le second en tant que fusion avec le fluorophore accepteur (protéine fluorescente communément jaune; YFP). Une interaction entre les deux protéines d'intérêt peut apporter les fluorophores donneur et accepteur suffisamment proches pour le transfert de l'énergie de se produire, ce qui se traduira par une augmentation mesurable de l'émission de lumière de l'accepteur YFP par rapport au donneur PCP. FRET a été couronnée de succès dans la détection des interactions protéine-protéine dans des cellules vivantes ^4. Le principal inconvénient de l'utilisation de FRET pour la détection des interactions protéine-protéine est la condition pour l'éclairage extérieur pour l'excitation du fluorophore donneur. Les résultats de l'éclairage extérieur à haute fond dans le signal d'émission, non désirée excitation de l'accepteur, et photoblanchiment des fluorophores donneur et accepteur. Ces effets réduisent la sensibilité du dosage pour la détection des interactions protéine-protéine.

Une modification de l'essai de FRET qui résout le problème de fond élevé de l'éclairage extérieur est le transfert d'énergie de résonance de bioluminescence (BRET) dosage ^5,6. Dans le système de BRET du fluorophore donneur est remplacée par une enzyme luciférase. Ainsi, l'énergie pour l'excitation du fluorophore accepteur est générée au sein du système par l'oxydation d'un substrat de la luciférase, ce qui rend inutile l'éclairage extérieur. Dans la plupartla configuration courante de ce test, le donneur est luciférase de Renilla reniformis et l'accepteur est la YFP (pour une discussion sur les protéines donneur alternatif et accepteurs voir Pfleger et al. ^5). En conséquence, dans ce système, une protéine d'intérêt est fusionnée à la luciférase et une protéine interagissant potentiellement à YFP, ou vice versa. L'essai BRET nécessite l'addition de coelentérazine en tant que substrat pour la luciférase. Parce que la coelentérazine est perméable aux cellules, il est possible d'effectuer des dosages de BRET dans les cellules vivantes. Cependant, la coelentérazine native est instable en solution aqueuse, et la décomposition d'enzyme indépendant de la coelentérazine la fois de réduire la concentration de substrat disponible pour le test et génère autoluminescence, ce qui réduit la sensibilité des mesures de l'activité de la luciférase. L'utilisation de BRET dans les cellules vivantes a été facilitée par le développement de cœlentérazines protégées, qui sont stables en solution aqueuse mais sont clivés par estérase cytosoliques après diffusion à travers la membrane de la cellule pour générer coelentérazine actif à l'intérieur de la cellule ^7.

Après l'addition du substrat à des cellules exprimant la luciférase et la YFP protéines de fusion, le transfert d'énergie résultant d'interactions protéine-protéine est quantifiée en contrôlant l'émission de la luciférase et la YFP. Parce que les interactions protéine peuvent être contrôlées directement dans les cellules vivantes dans des plaques multi-puits, l'essai BRET constitue une méthode simple et évolutive pour valider les interactions putatifs qui est le coût en temps et en efficacité.

En plus de valider interacteurs putatifs identifiés dans les études de dépistage de la protéomique, le système BRET peut également être utilisé pour interacteurs candidats de test découlant des études biochimiques et structurales antérieures sur la protéine d'intérêt. Une fois que l'existence d'une interaction protéine-protéine a été établie (soit en utilisant l'essai de BRET ou par d'autres techniques), il existe un potentiel pour l'essai de BRET pour être empLoyed en outre de caractériser l'interaction. Par exemple, les régions qui interagissent peuvent être mappés en générant des versions tronquées des protéines, et l'implication de résidus spécifiques de l'interaction peuvent être démontrés en créant des mutations ponctuelles. En outre, l'effet modulateur de modifications post-traductionnelles ou de petites molécules (telles que des médicaments ou des ligands) sur les interactions protéine-protéine peut être étudiée ^8-10.

L'essai BRET a aussi un grand potentiel pour l'étude des mutations identifiées dans l'ADN du patient. Dans les cas où un rôle causal pour une mutation a été établie, l'étude de l'effet de la mutation sur les interactions protéine-protéine à l'aide de BRET peut révéler plus sur l'étiologie moléculaire du phénotype ^11. Depuis l'avènement de méthodes de séquençage de prochaine génération, il est de plus en plus commun pour plusieurs mutations potentiellement nuisibles à être identifiés dans un individu, dans ce cas, on ne sait pas qui sont pertiVant au phénotype ^12. Dans cette situation, l'essai BRET peut être utile dans l'évaluation de l'impact des mutations sur la fonction des protéines et donc leur pertinence à la maladie.

Protocole

Une. Création de plasmides

1. Sous-cloner les ADNc pour chacune des protéines d'intérêt dans les deux vecteurs Pluc et pYFP, ​​en utilisant des techniques standards de biologie moléculaire (figure 1). Pour les protocoles détaillés voir Green et al ^13.
2. Toutes les constructions de séquence pour vérifier que les protéines d'intérêt sont en phase avec la séquence Luc / YFP, sans codons d'arrêt intermédiaires.
3. Effectuer des essais fonctionnels comme souhaité afin de confirmer que les protéines de fusion conservent une activité biologique. Dans le cas présenté ici, la localisation subcellulaire des protéines de fusion YFP a été déterminée par microscopie à fluorescence.
4. Faire des plasmides d'expression pour les protéines de contrôle Luc et YFP appropriées par l'ingénierie des signaux de ciblage appropriées dans les vecteurs d'expression et Pluc pYFP. Dans le cas présenté ici, générer des constructions Luc et YFP nucléaires ciblées par l'insertion d'un signal de localisation nucléaire dans les vecteurs pLuc et pYFP.
5. Faireune construction de contrôle positif dans lequel Luc et YFP sont fusionnés en un seul polypeptide. Dans le cas présenté ici, de générer un témoin positif dans lequel la séquence codante de la YFP est inséré dans le vecteur pLuc.
6. Sélectionner un plasmide de remplissage neutre à utiliser pour égaliser la masse d'ADN dans les mélanges de transfection. Utilisation d'un plasmide qui n'a pas de promoteur eucaryote et sera donc transcriptionnellement inactif dans les cellules de mammifères, par exemple un vecteur de clonage bactérien.

2. Préparation de l'ADN Mixes

1. Estimer la concentration de tous les plasmides décrits dans la section 1 sur la base de l'absorbance à 260 nm (1 unité d'absorbance est équivalente à 50 pg / ml d'ADN). Déterminer la masse moléculaire de chaque plasmide en multipliant le nombre de paires de bases par 650 Da. Utilisation de la concentration et de la masse moléculaire pour calculer la concentration molaire de chaque préparation de plasmide. Diluer les préparations d'ADN de plasmide à une concentration de 36 nM. Ce seront les stocks de roulementqui seront utilisés pour préparer les mélanges d'ADN pour la transfection.
2. Préparer un mélange d'ADN de contrôle contenant 1800 ng de plasmide de remplissage dans un volume final de 20 ul d'eau.
3. Préparer un mélange d'ADN témoin contenant 5 ul du produit d'assemblage pLuc-contrôle. Ajouter charge plasmide pour amener la masse de l'ADN total de 1 800 ng. Ajouter de l'eau pour amener le volume final à 20 pi.
4. Préparer un mélange d'ADN de contrôle contenant 5 pi de pLuc contrôle construction et 5 pi de pYFP contrôle construction. Ajouter charge plasmide pour amener la masse de l'ADN total de 1 800 ng. Ajouter de l'eau pour amener le volume final à 20 pi.
5. Préparer un mélange d'ADN témoin contenant 5 ul de construction témoin positif. Ajouter charge plasmide pour amener la masse de l'ADN total de 1 800 ng. Ajouter de l'eau pour amener le volume final à 20 pi.
6. Préparez le mélange ADN suivante pour tester homodimérisation d'une protéine d'intérêt, X. Pour chaque mélange d'ADN combiner 5 pi de la pLuc pertinent construire et 5 pi de la pYFP construire. Ajouter charge plasmide pour amener la masse de l'ADN total de 1 800 ng. Ajouter de l'eau pour amener le volume final à 20 pi.
   A) pLuc-contrôle et pYFP-X
   B) pLuc-X et pYFP-contrôle
   C) pLuc-X et pYFP-X
7. Préparer le mélange d'ADN suivant pour tester une interaction entre une paire de protéines d'intérêt, X et Y. Pour chaque mélange d'ADN combinent 5 ul de la pLuc pertinent construire et 5 ul de la pYFP construisent. Ajouter charge plasmide pour amener la masse de l'ADN total de 1 800 ng. Ajouter de l'eau pour amener le volume final à 20 pi.
   A) pLuc-contrôle et pYFP-X
   B) pLuc-X et pYFP-contrôle
   C) pLuc-contrôle et pYFP-Y
   D) pLuc-Y et pYFP-contrôle
   E) pLuc-X et Y-pYFP
   F) pLuc-Y et X-pYFP

3. Transfection

1. Récolte subconfluentes cellules HEK293 à partir d'un flacon de 75 cm ^2. Diluer à 10% des cellules totales dans 13 ml de milieu de culture. Distribuer 130 l de suspension cellulaire dans chaque puits d'une blancheclair à fond plaque de 96 puits de culture de tissu. Culture des cellules pendant 24 heures.
2. Calculer le nombre de puits à transfecter en multipliant le nombre de mélanges d'ADN en 3. Porter le milieu de culture exempt de sérum à température ambiante. Préparer un mélange maître contenant 6,3 ul de milieu sans sérum et 0,18 ul réactif de transfection par puits. Mélanger au vortex et incuber à température ambiante pendant 5 min.
3. Préparez des mélanges de transfection en ajoutant 2 ul d'ADN mélange à 20 pi de milieu / réactif de transfection master mix sans sérum. Ne pas vortex. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
4. Transfecter trois puits avec chaque mélange de transfection de distribution de 6,5 pi de mélange de transfection par puits. Culture des cellules pour un autre 36-48 h.

4. Mesure de BRET Signal

1. Dissoudre le substrat de la luciférase des cellules vivantes à 34 mg / ml dans le DMSO par vortex.
2. Diluer substrat de la luciférase des cellules vivantes reconstitué à 1:1000 dans le substrat dilution moyen pre-chauffé à 37 ° C. Laisser 50 ul de milieu de dilution du substrat par puits. Vortex à mélanger. Un précipité peut se former, mais ne va pas interférer avec le dosage.
3. Aspirer le milieu de culture à partir de la plaque à 96 puits. Distribuer 50 ul de substrat de la luciférase des cellules vivantes dilué dans chaque puits. Culture de cellules pendant au moins 2 h (jusqu'à 24 h).
4. Enlever le couvercle de la plaque à 96 puits et incuber la plaque pendant 10 min à température ambiante à l'intérieur du luminomètre.
5. Mesurer les émissions de Luc et YFP un bien à la fois. Mesurer les émissions de Luc en utilisant un filtre de blocage des longueurs d'onde de 470 nm. Mesurer l'émission à partir de la YFP en utilisant un filtre passe-bande de 500 à 600 nm. Intégrer des signaux d'émission de plus de 10 sec.

5. Analyse des données

1. La moyenne des lectures d'émission Luc des 3 puits n'ayant reçu que le plasmide de remplissage. Soustraire cette valeur de toutes les autres lectures d'émission Luc à produire des valeurs d'émission Luc fond soustrait.
2. La moyenne des lectures d'émission YFP des 3 puits n'ayant reçu que le plasmide de remplissage. Soustraire cette valeur de toutes les autres lectures d'émission YFP pour produire des valeurs d'émission YFP fond soustrait.
3. Pour chaque puits, il faut diviser la valeur d'émission YFP fond soustrait de la valeur d'émission Luc fond soustrait pour donner le rapport de BRET non corrigée.
4. La moyenne des ratios de BRET non corrigées des trois puits qui ont été transfectées avec seulement le plasmide pLuc-contrôle. Soustraire cette valeur à partir de tous les autres rapports de BRET non corrigées pour donner les rapports de BRET corrigé.
5. Pour chacun des ensembles restants de rapports de BRET corrigé, la moyenne des valeurs des trois puits transfectés pour obtenir un rapport final BRET.

Résultats

Le principe de l'essai de BRET est illustré sur la figure 2. L'installation de dosage utilisée dans les expériences présentées ici est représenté sur la figure 3. La détection d'un signal de BRET solide à partir de cellules transfectées avec une protéine de fusion luciférase-YFP a confirmé que le transfert d'énergie était observable dans ce dispositif expérimental (figure 4).

Notre recherche se concentre sur l...

Discussion

La conception des produits d'assemblage d'expression de protéines de fusion est une étape critique dans la mise en place de l'essai de BRET. Dans les expériences présentées ici, les protéines d'intérêt ont été fusionnées à l'extrémité C-terminale de la luciférase ou de la YFP. Il est également possible, et peut être nécessaire, pour faire fondre les protéines à l'extrémité N-terminale de la luciférase / YFP. Pour certaines protéines, les fusions ne peuvent être acceptées...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanodrop 8000	Nanodrop		Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96-microwell plates, flat bottom, white	Greiner Bio One	655098	White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software	TECAN		Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.
pLuc, pYFP, positive control plasmid	N/A	N/A	Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells	ECACC	85120602	Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red	Gibco	41966	This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)	Gibco	21063	This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum	Gibco	10270	For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent	Novagen	70967	If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO	Sigma	D2650	Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.
EnduRen live-cell substrate	Promega	E6481	Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.