Investigando interações proteína-proteína em células vivas usando a transferência de Bioluminescência Resonance Energy

Resumo

As interações entre proteínas são fundamentais para todos os processos celulares. Usando bioluminescência Transferência de Energia de Ressonância, a interacção entre um par de proteínas podem ser monitoradas em células vivas e em tempo real. Além disso, os efeitos das mutações potencialmente patogénicos pode ser avaliada.

Resumo

Ensaios com base na transferência de Bioluminescência Resonance Energy (BRET) fornecer meios sensíveis e confiáveis ​​para monitorar as interações proteína-proteína em células vivas. BRET é a transferência não radiativa de energia a partir de uma enzima luciferase 'dador' para uma proteína fluorescente "aceitadora". Na configuração mais comum deste ensaio, o doador é Renilla reniformis luciferase eo receptor é uma proteína fluorescente amarela (YFP). Devido a eficiência de transferência de energia é fortemente dependente da distância, a observação do fenômeno BRET exige que o doador e receptor estar em estreita proximidade. Para se testar a interacção entre duas proteínas de interesse em células de mamíferos em cultura, uma proteína é expressa como uma fusão com a luciferase e a segunda forma de uma fusão com a YFP. Uma interação entre as duas proteínas de interesse podem levar o doador e receptor suficientemente perto para a transferência de energia para ocorrer. Em comparação com outras técnicas para a investigação de proteína-proteína eminterações, o ensaio BRET é sensível, requer pouca prática em tempo e alguns reagentes, e é capaz de detectar as interações que são fracos, transitórios, ou dependente do ambiente bioquímico encontrado dentro de uma célula viva. É, portanto, uma abordagem ideal para confirmar interacções putativos sugeridos pela proteómica estudos de levedura de dois híbridos ou de espectrometria de massa, e, além disso, é bem apropriado para as regiões de mapeamento interagindo, avaliando o efeito de modificações pós-traducionais sobre as interacções proteína-proteína, e avaliar o impacto das mutações identificadas no DNA do paciente.

Introdução

Ambos ligação clássica e de próxima geração analisa seqüenciamento de doenças humanas estão revelando a relevância clínica de proteínas envolvidas em uma variedade de caminhos biológicos. É muitas vezes o caso de que, antes da sua identificação, em tais estudos, verificou-se pouca ou nenhuma investigação do papel biológico destas proteínas. Uma via proveitosa para começar a explorar a função biológica de uma proteína de interesse é o de identificar quais outras proteínas que interagem com o seu contexto na fisiológico. Caracterizando redes moleculares desta forma fornece insights sobre os caminhos biológicos subjacentes ao fenótipo humano.

A triagem em larga escala mais utilizado abordagens para identificação de parceiros de interação candidatos para proteínas de interesse são fermento de rastreio de dois híbridos ¹ e proteômica baseada em espectrometria de massa ^2. Estes métodos podem ser muito bem sucedido em sugerir potenciais proteínas que interagem, mas arenviar um e vulneráveis ​​a resultados falsos positivos. Portanto, a confirmação de uma interação identificado por levedura híbrida de dois ou screening espectrometria de massa requer a validação da interação com uma segunda técnica. Tipicamente, uma co-imunoprecipitação ou suspenso ensaio é utilizado para este fim ^3. Uma desvantagem do uso de tais técnicas para a validação é o requisito para a lise da célula, que destrói as condições intracelulares que podem ser essenciais para a manutenção de certas interacções proteína. Uma segunda desvantagem é que as interacções proteína fracos ou transiente pode ser interrompida durante a etapa de lavagem. Além disso, estes ensaios exigem mãos no tempo significativos, são limitados no número de amostras que podem ser processadas ao mesmo tempo, e frequentemente requerem optimização demorado de reagentes e protocolos.

Para ultrapassar alguns dos problemas associados com as experiências de co-imunoprecipitação, vários ensaios foram desenvolvidos com base na fluorescência e bioluminescent proteínas que podem ser utilizados em células vivas. Os primeiros desses ensaios foram baseados em fluorescência (ou Förster) Resonance Energy Transfer (FRET), a transferência não radiativa de energia entre duas proteínas fluorescentes com sobreposição de espectros de emissão e excitação ^4. A eficiência de transferência de energia é fortemente dependente da distância, por conseguinte, a observação do fenómeno FRET requer que os doadores e aceitadores de fluoróforos estar em estreita proximidade. Para se testar a interacção entre duas proteínas de interesse, uma proteína é expressa como uma fusão com o fluoróforo dador (proteína fluorescente vulgarmente ciano; PCP) e a segunda, como uma fusão com o fluoróforo aceitador (proteína fluorescente vulgarmente amarelo; YFP). Uma interacção entre as duas proteínas de interesse podem trazer os doadores e aceitadores de fluoróforos suficientemente estreitas para a transferência de energia para ocorrer, o que vai resultar num aumento mensurável na emissão de luz a partir do aceitador YFP em relação ao dador PCP. FRET tem sido bem sucedido na detecção de interacções proteína-proteína em células vivas ^4. A principal desvantagem do uso de FRET para detectar interacções proteína-proteína é o requisito para uma iluminação externa para a excitação do fluoróforo dador. Iluminação resultados externas no alto de fundo no sinal de emissão, excitação indesejável do receptor, e fotodegradação do dador e do fluorophores aceitador. Estes efeitos reduzem a sensibilidade do ensaio para a detecção de interacções proteína-proteína.

Uma modificação do ensaio de FRET, que ultrapassa o problema do elevado fundo de iluminação externa é a transferência de bioluminescência Resonance Energy (BRET) ensaio de ^5,6. No sistema BRET o fluoróforo dador está substituído por um enzima luciferase. Assim, a energia de excitação do fluoróforo aceitador é gerado dentro do sistema através da oxidação de um substrato da luciferase, tornando desnecessário iluminação exterior. Na maioriaconfiguração comum deste ensaio, o dador é de Renilla reniformis luciferase e o aceitador é YFP (para uma discussão de dador alternativa e proteínas aceitadoras ver Pfleger et al. ^5). Assim, neste sistema, uma proteína de interesse é fundida a uma proteína de luciferase e potencialmente interagindo com YFP, ou vice-versa. O ensaio BRET requer a adição de celenterazina como um substrato para a luciferase. Porque coelenterazina é célula-permeável, que é possível realizar ensaios de BRET em células vivas. No entanto, a coelenterazina nativa é instável em solução aquosa, e a desagregação independente de enzima de coelenterazina tanto reduz a concentração do substrato disponível para o ensaio e gera autoluminescence, o que reduz a sensibilidade das medições da actividade da luciferase. O uso de BRET em células vivas tem sido facilitada pelo desenvolvimento de coelenterazines protegidas, as quais são estáveis ​​em solução aquosa mas são clivadas por esterase citosólicas após difusão através da membrana celular para gerar coelenterazina activo dentro da câmara ^7.

Após a adição de substrato para as células que expressam as proteínas de fusão de luciferase-YFP-e, a transferência de energia resultante de interacções proteína-proteína é quantificada através da monitorização da emissão de luciferase e YFP. Como as interações protéicas podem ser monitorados diretamente em células vivas em placas multi-bem, o ensaio BRET constitui um método simples e escalável, para validar as interações putativos que é custo-eficiente e em tempo.

Além de validar interactores putativas identificadas em estudos de rastreio proteomic, o sistema BRET também pode ser usado para testar candidatos interactores provenientes de estudos bioquímicos e estruturais anteriores sobre a proteína de interesse. Uma vez que a existência de uma interacção proteína-proteína foi estabelecido (ou usando o ensaio BRET ou por outras técnicas), existe potencial para o ensaio BRET ser employed para caracterizar a interação. Por exemplo, as regiões que interagem podem ser mapeadas através da geração de versões truncadas de proteínas, e a participação de resíduos específicos na interacção pode ser demonstrada através da criação de mutações pontuais. Além disso, o efeito modulador de modificações pós-tradução ou moléculas pequenas (tais como drogas ou ligandos) em interacções proteína-proteína podem ser investigadas ^8-10.

O ensaio BRET também tem um grande potencial para a investigação de mutações identificadas no DNA do paciente. Nos casos em que um papel causal para uma mutação tenha sido estabelecida, a estudar o efeito da mutação sobre as interacções proteína-proteína utilizando BRET pode revelar mais sobre a etiologia molecular do fenótipo ^11. Desde o advento de metodologias de sequenciamento de próxima geração, que é cada vez mais comum para várias mutações potencialmente prejudiciais para ser identificado dentro de um indivíduo, caso em que não está claro quais são relevante para o fenótipo ^12. Nesta situação, o ensaio BRET pode ser valiosa na avaliação do impacto das mutações na função de proteínas e, consequentemente, a sua relevância para o transtorno.

Protocolo

1. Criação de plasmídeos

1. Subclonar os ADNc para cada uma das proteínas de interesse em ambos os vectores płuc e pYFP, ​​utilizando técnicas de biologia molecular convencionais (Figura 1). Para protocolos detalhados ver Green et al ^13.
2. Sequência de todas as construções para verificar que as proteínas de interesse são em moldura com a sequência de Luc / YFP sem intervenientes codões de paragem.
3. Realizar ensaios funcionais, tal como desejado para confirmar que as proteínas de fusão retêm a actividade biológica. No caso apresentado a localização subcelular de proteínas de fusão YFP foi determinado por microscopia de fluorescência.
4. Adicione os plasmídeos de expressão para as proteínas de controlo Luc e YFP adequadas, projetando os sinais de segmentação relevantes para os vectores de expressão e płuc pYFP. No caso apresentado, gerar Luc e YFP construções nucleares-alvo através da inserção de um sinal de localização nuclear em vetores pluc e pYFP.
5. Fazeruma construção controle positivo em que Luc e YFP são fundidos em um único polipeptídeo. No caso aqui apresentado, gerar um controlo positivo, em que a sequência de codificação de YFP é inserido no vector płuc.
6. Seleccionar um plasmídeo de enchimento neutro a ser utilizada para equalizar a massa de ADN nas misturas de transfecção. Usar um plasmídeo que não tem o promotor eucariótico e, por conseguinte, será transcricionalmente inactivo em células de mamíferos, como por exemplo um vector de clonagem bacteriana.

2. Preparação de ADN Misturas

1. Estimar a concentração de todos os plasmídeos descritos na secção 1 com base na absorvância a 260 nm (1 unidade de absorvância é equivalente a 50 ug / ml de DNA). Determinar a massa molecular de cada um dos plasmídeos através da multiplicação do número de pares de bases de 650 Da. Utilizar a concentração e da massa molecular para calcular a concentração molar de cada preparação de plasmídeo. Dilui-se as preparações de DNA de plasmídeo a uma concentração de 36 nM. Estas serão as ações de trabalhoque irão ser usadas para preparar as misturas de ADN para transfecção.
2. Prepara-se uma mistura de ADN de controlo que contém 1.800 ng de plasmídeo de enchimento em um volume final de 20 ul de água.
3. Prepara-se uma mistura de ADN de controlo contendo 5 ul da construção płuc-controlo. Adicionar plasmídeo enchimento para levar a massa total de ADN de 1800 ng. Adicionar água para levar o volume final a 20 ul.
4. Prepare uma mistura de DNA controle contendo 5 mL de pluc de controle de construção e 5 mL de pYFP de controle de construção. Adicionar plasmídeo enchimento para levar a massa total de ADN de 1800 ng. Adicionar água para levar o volume final a 20 ul.
5. Prepara-se uma mistura de ADN de controlo contendo 5 ul de construção de controle positivo. Adicionar plasmídeo enchimento para levar a massa total de ADN de 1800 ng. Adicionar água para levar o volume final a 20 ul.
6. Preparar a seguinte mistura de ADN para testar a homodimerização de uma proteína de interesse, X. Para cada mistura de ADN combinar 5 ul da płuc relevante construir e 5 ul do pYFP construir. Adicionar plasmídeo enchimento para levar a massa total de ADN de 1800 ng. Adicionar água para levar o volume final a 20 ul.
   A) płuc-controlo e pYFP-X
   B) płuc-X e pYFP controle
   C) płuc-X e X-pYFP
7. Preparar a seguinte mistura de ADN para testar a interacção entre um par de proteínas de interesse, X e Y. Para cada mistura de ADN combinar 5 ul da płuc relevante construir e 5 ul da pYFP construir. Adicionar plasmídeo enchimento para levar a massa total de ADN de 1800 ng. Adicionar água para levar o volume final a 20 ul.
   A) płuc-controlo e pYFP-X
   B) płuc-X e pYFP controle
   C) płuc-controlo e pYFP-Y
   D) pluc-Y e pYFP-controle
   E) płuc-X e Y-pYFP
   F) płuc-Y e X-pYFP

3. Transfecção

1. Colheita confluentes células HEK293 de um frasco de 75 cm ^2. Dilui-se 10% do total de células em 13 ml de meio de cultura. Dispensar 130 ul de suspensão celular em cada poço de um brancode fundo transparente de 96 cavidades da placa de cultura de tecidos. Células de cultura para 24 horas.
2. Calcular o número de poços para ser transfectada, multiplicando o número de combinações de DNA de 3. Traga meio de cultura isento de soro até à temperatura ambiente. Prepara-se uma mistura principal contendo 6,3 mL de meio isento de soro e reagente de transfecção 0,18 mL por poço. Misturar em vortex e incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
3. Prepare a mistura de transfecção por adição de 2 ul de mistura de ADN para 20 mL de meio / transfecção mistura principal reagente livre de soro. Não vórtice. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
4. Transfecção três poços com cada mistura de transfecção dispensar 6,5 ul de mistura de transfecção por poço. Cultura das células por mais um 36-48 hr.

4. Medição de BRET sinal

1. Dissolver substrato luciferase em células vivas em 34 mg / ml em DMSO por vórtex.
2. Diluir substrato luciferase em células vivas reconstituído em 1:1.000 em substrato de diluição médio pre-aquecida a 37 ° C. Permitir 50 mL de meio de diluição de substrato por poço. Vortex para misturar. Um precipitado pode formar, mas não irá interferir com o ensaio.
3. Aspirar o meio de cultura da placa de 96 poços. Dispensar 50 ul de substrato de luciferase em células vivas diluída para cada poço. Células de cultura durante pelo menos 2 horas (até 24 horas).
4. Remover a tampa da placa de 96 poços e incuba-se a placa durante 10 minutos a temperatura ambiente no interior do luminómetro.
5. Medir emissão de Luc e YFP um poço de cada vez. Medir emissão de Luc utilizando um filtro de bloqueio de comprimentos de onda mais longo do que 470 nm. Medir emissão de YFP utilizando um filtro passa-banda de 500-600 nm. Integrar sinais de emissão ao longo de 10 sec.

5. Análise de Dados

1. Calcule a média das leituras de emissões Luc dos três poços que receberam apenas o plasmídeo de enchimento. Subtraia este valor de todas as outras leituras de emissão Luc para produzir os valores de emissão de Luc subtraído-fundo.
2. Calcule a média das leituras de emissões YFP dos três poços que receberam apenas o plasmídeo de enchimento. Subtraia este valor de todas as outras leituras de emissão YFP para produzir os valores de emissão YFP subtraído-fundo.
3. Para cada bem, divida o valor de emissão YFP subtraído-fundo pelo valor de emissão de Luc subtraído-fundo para dar a razão BRET sem correção.
4. Calcule a média dos índices de BRET não corrigidas dos três poços que foram transfectadas apenas com o plasmídeo płuc-controlo. Subtrair esse valor a partir de todas as outras proporções BRET não corrigidos para dar as proporções BRET corrigidos.
5. Para cada um dos conjuntos restantes de rácios BRET corrigidos, a média dos valores dos três poços transfectadas para obter uma razão final de BRET.

Resultados

O princípio do ensaio BRET é ilustrada na Figura 2. A configuração do ensaio usado ao longo das experiências aqui apresentadas é descrito na Figura 3. A detecção de um sinal de BRET forte a partir de células transfectadas com uma proteína de fusão de luciferase-YFP confirmou que a transferência de energia foi observável nesta configuração experimental (Figura 4).

Nossa pesquisa centra-se no papel da família FOXP de repressore...

Discussão

O design das construções de expressão de proteínas de fusão é um passo crítico na criação do ensaio BRET. Nas experiências aqui apresentadas, as proteínas de interesse foram fundidos com o terminal C da luciferase ou YFP. Também é possível, e pode ser necessário, para fundir as proteínas para o N-terminal de luciferase / YFP. Para algumas proteínas, fusões só podem ser aceites em qualquer N-ou C-terminal, a fim de evitar a ruptura da estrutura e função de proteínas. Além disso, para as proteínas ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanodrop 8000	Nanodrop		Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96-microwell plates, flat bottom, white	Greiner Bio One	655098	White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software	TECAN		Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.
pLuc, pYFP, positive control plasmid	N/A	N/A	Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells	ECACC	85120602	Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red	Gibco	41966	This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)	Gibco	21063	This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum	Gibco	10270	For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent	Novagen	70967	If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO	Sigma	D2650	Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.
EnduRen live-cell substrate	Promega	E6481	Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.