Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran

Özet

Proteinler arasındaki etkileşimleri tüm hücresel süreçleri için temel vardır. Bio-ışıldama, rezonans enerji transferi kullanılarak, proteinlerin bir çift arasındaki etkileşim, canlı hücrelerde ve gerçek zamanlı olarak izlenebilir. Bundan başka, potansiyel olarak patojenik mutasyonların etkisi değerlendirilebilir.

Özet

Bio-ışıldama Rezonans Enerji Transferi (BRET) dayalı tahliller, canlı hücrelerde protein-protein etkileşimleri izlemek için bir hassas ve güvenilir bir araç sağlar. BRET bir "alıcı" flüoresan protein için bir 'verici' lusiferaz enzim enerji radyatif olmayan transferidir. Bu deneyde en yaygın yapılandırmada, verici Renilla reniformis'e lusiferaz ve alıcı sarı floresan proteini (YFP) 'dir. Enerji transferi verimi güçlü mesafe bağımlı olduğu için, BRET olgusunun gözlem verici ve alıcı yakın olması gerekir. Kültürlenen memeli hücrelerde ilgi iki protein arasındaki bir etkileşim için test etmek amacıyla, protein, bir lusiferaz ve YFP ile bir füzyon olarak, ikincisi ile bir füzyon olarak ifade edilir. Ilgilenilen iki protein arasında bir etkileşim verici ve enerji transferi oluşabilmesi için yeterince yakın akseptörü getirebilir. Protein-protein araştırmak için başka teknikler ile karşılaştırıldığındateractions, Bret tahlil duyarlı, küçük ellerini-zaman ve kaç reaktifler gerektirir, ve, zayıf geçici, ya da canlı bir hücrenin içinde bulunan biyokimyasal çevresine bağlıdır etkileşimleri tespit edebiliyor. Bu nedenle, maya iki-melez ya da kütle spektrofotometresi proteomik çalışmalar önerdiği varsayımsal etkileşimleri doğrulanması için ideal bir yaklaşımdır, ve ek olarak protein-protein etkileşimleri, çevirim sonrası değişikliklerin etkisini değerlendirmek, eşleme etkileşim bölgeleri için çok uygundur, ve Hasta DNA tanımlanan mutasyonların etkisini değerlendirmek.

Giriş

Dizileme insan bozuklukları arasında bağlantı analizleri klasik ve yeni nesil Hem biyolojik yolların bir aralıkta yer alan proteinlerin klinik anlam açıklayıcıdır. Bu önce bu tür çalışmalarda kendi tanımlama, bu proteinlerin biyolojik rolünün çok az veya hiç soruşturma edildiğine, genellikle böyledir. Ilgi konusu bir proteinin biyolojik fonksiyonunu keşfetmek başlatmak için verimli bir yol onun fizyolojik bağlamında ile etkileşen diğer hangi proteinlerin tespit etmektir. Bu şekilde moleküler ağlar karakterize insan fenotip altında yatan biyolojik yollar içgörüler sağlar.

En sık kullanılan büyük ölçekli tarama ilgi konusu olan proteinlerin aday etkileşim ortakları belirlenmesi için yaklaşımlar maya iki-hibrid eleme ¹ ve kütle spektrometresi tabanlı proteomik ^{2 'dir.} Bu yöntemler potansiyel etkileşim proteinler düşündüren çok başarılı olabilir, ancak ar olabilirYanlış pozitif sonuçlar savunmasız e. Bu nedenle, maya iki-melez ya da kütle spektrometrisi tarama ile belirlenen bir etkileşim onay ikinci bir teknik kullanılarak etkileşim doğrulaması gerektirmektedir. Tipik olarak, bir ko-immünopresipitasyon veya çekme-down deney bu amaçla ³ için kullanılır. Doğrulama için bu gibi teknikler kullanılarak bir dezavantajı, belirli bir protein etkileşimlerini muhafaza edilmesi için gerekli olabilir, hücre içi koşullar yok hücre lisisi, için bir gerekliliktir. İkinci bir dezavantaj, zayıf ya da geçici protein etkileşimleri yıkama adımları sırasında bozulabilir olmasıdır. Ayrıca, bu deneyler, önemli eller zaman talep aynı anda işlenebilir numune sayısı sınırlıdır ve genellikle reaktiflerin ve protokoller zaman alıcı optimizasyon gerektirir.

Ko-immünopresipitasyon deneyleri ile ilişkili problemlerin bazılarının üstesinden gelebilmek için, çeşitli tahliller, floresan ve biolum göre geliştirilmiştircanlı hücreler olarak kullanılabilir inescent proteinleri. Bu alandaki ilk deneyler Floresans (veya Förster) rezonans enerji transferi (FRET), üst üste binen emisyon ve uyarım spektrumları ^4, iki floresan protein arasındaki enerji radyatif olmayan transferi dayandırılmıştır. Enerji transferi etkinliği bu nedenle, FRET olgusunun gözlem verici ve alıcı floroforlar yakın olması gerekir, güçlü bir mesafe bağımlıdır. Ve akseptör-floroforu (yaygın sarı floresan proteini; YFP) ile bir füzyon olarak ikinci, ilgi iki protein arasındaki bir etkileşim test etmek için, bir protein, donor-florofor (CFP genel olarak mavi floresan protein) ile bir füzyon olarak ifade edilir. Ilgilenilen iki protein arasında bir etkileşim CFP donör YFP akseptör göreceli ışık emisyon ölçülebilir bir artışa neden olur ki, enerji transferi oluşabilmesi için yeterince yakın bir verici ve alıcı florofor getirebilir. FRET canlı hücreler ⁴ protein-protein etkileşimlerini tespit başarılı olmuştur. Protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için FRET kullanılmasının başlıca dezavantajı, donor-florofor uyarma dış aydınlatma için bir gerekliliktir. Emisyon sinyali, alıcı istenmeyen uyarma ve verici ve alıcı florofor hem ışıkla ağartma yüksek arka dış aydınlatma sonuçlanır. Bu etkiler, protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için, tahlilin hassasiyetini azaltır.

Dış aydınlatma yüksek bir arka plan sorununu ortadan FRET deneyinin bir modifikasyonu Bio-ışıldama Rezonans Enerji Transferi (BRET) tahlili ^5,6 olan. BRET sisteminde donor-floroforu bir lusiferaz enzimi ile değiştirilir. Bu durumda, alıcı fluorofor uyarılması için enerji gereksiz dış aydınlatma ile, bir lusiferaz alt-tabakanın oksidasyonu ile, sistem içinde oluşturulur. ÇoğundaBu tahlilin ortak bir yapılandırma, verici Renilla lusiferaz reniformis ve akseptör (alternatif donör ve akseptör proteinlere ilişkin bir tartışma için Pfleger et al. bakınız: ⁵⁾ YFP olmasıdır. Bu duruma göre, bu sistemde, ilgi konusu bir protein lusiferaz ve potansiyel olarak etkileşen protein YFP için, veya tam tersi kaynaşır. BRET deney lusiferaz için bir substrat olarak koelenterazin eklenmesini gerektirir. Coelenterazine hücre-geçirgen olduğu için, canlı hücrelerde BRET deneyleri gerçekleştirmek mümkündür. Bununla birlikte, doğal coelenterazine sulu çözelti içinde kararsız olduğu ve koelenterazin enzim bağımsız arıza tahlil için alt-tabaka mevcut konsantrasyonunu azaltır ve lusiferaz aktivitesi ölçümlerinin hassasiyetini azaltır autoluminescence oluşturur, her ikisi de. Canlı hücrelerdeki BRET kullanılması, sulu çözelti içinde stabil olan, ancak sitosolik esteraz ile bölünen korunan coelenterazines, geliştirilmesi ile kolaylaştırılmıştırhücre ⁷ içindeki aktif coelenterazine oluşturmak için hücre zarından difüzyon sonra s.

Lusiferazı ve YFP-füzyon proteinlerini eksprese eden hücrelere substrat ilave edildikten sonra, protein-protein etkileşimleri kaynaklanan enerji transferi lusiferaz ve YFP gelen emisyon izleyerek ölçülür. Protein etkileşimleri, çok oyuklu plakalar içerisinde canlı hücreler doğrudan izlenebilir için, BRET deney maliyet ve zaman tasarruflu, varsayılan etkileşimlerini doğrulamak için basit bir ölçeklenebilir bir yöntem içerir.

Proteomik tarama çalışmalarda tanımlanan varsayılan inter aktörlerin onaylamaya ek olarak, BRET sistem aynı zamanda, ilgi konusu bir protein üzerinde önceden biyokimyasal ve yapısal çalışmalarından gelen test aday uygulayıcı için kullanılabilir. , Bir protein-protein etkileşiminin varlığı (BRET yöntemi kullanılarak ya da diğer teknikler yoluyla) bir kez kurulduktan sonra BRET deney emp olması için potansiyel vardırloyed ayrıca etkileşimlerini karakterize etmek için. Örneğin, etkileşim bölgeleri proteinlerinin kesilmiş versiyonları üreterek eşlenebilir ve bu etkileşimde belirli tortuların katılımı nokta mutasyonlar oluşturarak kanıtlanabilir. Ayrıca, protein-protein etkileşimleri ile ilgili çevrim sonrası modifikasyon veya (ilaç veya ligandlar gibi) küçük moleküller modüle edici etkisinin ^8-10 araştırılabilir.

Tahlil, aynı zamanda, hasta BRET DNA tanımlanan mutasyonlar araştırmak için büyük bir potansiyele sahiptir. Durumda, bir mutasyon için nedensel rol BRET fenotip ¹¹ moleküler etiyolojisi hakkında daha fazla ortaya çıkarabilir kullanılarak protein-protein etkileşimlerine mutasyonun etkisi araştırılarak kurulmuştur burada. Çeşitli potansiyel olarak zarar veren mutasyonların rele olduğu açık değildir, bu durumda, bir birey içinde tespit edilmesi için yeni nesil dizileme yöntemleri gelişiyle bu yana, giderek daha yaygın olduğufenotip ¹² adjuvant. Bu durumda BRET deney protein işlevi üzerindeki mutasyonlar etkisini değerlendirmek için de değerlidir ve bozukluğa dolayısıyla alaka olabilir.

Protokol

Plazmitlerin 1. Yaratılış

1. (Şekil 1), standart moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak, iki pLuc ve pYFP vektörlere ilgi her protein için cDNA'lar alt-klonlanmıştır. Detaylı protokollerin Yeşil ve arkadaşları ¹³ bkz.
2. Sıra tüm ilgi duyulan proteinlerin herhangi bir araya giren durdurma kodonları ile Luc / YFP sekansı ile çerçeve içinde olduğunu doğrulamak için oluşturur.
3. Füzyon proteinleri biyolojik etkinliğini korumak olduğunu teyit etmek için arzu edildiği gibi fonksiyonel deneylerde yapın. Burada yer alan durumunda YFP füzyon proteinlerin hücre içi lokalizasyonu floresan mikroskobu ile tespit edildi.
4. PLuc ve pYFP ekspresyon vektörleri içine uygun hedefleme sinyalleri mühendislik tarafından uygun Luc ve YFP kontrol proteinleri için sentezleme plasmidleri olun. Burada yer alan durumunda, pLuc ve pYFP vektörlere bir nükleer lokalizasyon sinyali sokulmasıyla nükleer hedefli Luc ve YFP yapıları oluşturur.
5. YapmakLuc ve YFP tek polipeptid halinde birleşmiş olduğu bir pozitif kontrol yapısı. Burada yer alan durumunda, YFP kodlama dizisi pLuc vektör içine sokulduğu bir pozitif kontrol üretir.
6. Transfeksiyon karışımları DNA kütlesini eşitlemek için kullanılacak nötr dolgu plazmid seçin. Herhangi bir ökariyotik promoter içeren bir plazmid kullanarak ve bu nedenle, bir bakteri klonlama vektörü gibi memeli hücrelerinde transkripsiyonel olarak etkin olacaktır.

DNA karışımlar 2. Hazırlanması

1. 260 nm'de absorbans göre Bölüm 1 'de tarif edilen tüm plasmidlerin konsantrasyonunu tahmin (1 absorbans birimi 50 ug / ml DNA eşdeğerdir). 650 Da ile baz çiftlerinin sayısı çarpılarak her plazmid moleküler kütlesi belirler. Her bir plazmid hazırlama molar konsantrasyonunu hesaplamak için, konsantrasyon ve moleküler kütlesi kullanın. 36 nM'lik bir konsantrasyonda plasmid DNA preparatları seyreltin. Bunlar çalışma stokları olacakBu transfeksiyon için DNA karışımları hazırlamak için kullanılacaktır.
2. Su 20 ul'lik bir son hacim içinde dolgu plazmid 1800 ng DNA içeren bir kontrol karışımı hazırlayın.
3. PLuc kontrol konstruktunun 5 ul DNA içeren bir kontrol karışımı hazırlayın. 1,800 ng toplam DNA kütlesi getirmek için dolgu plazmid ekleyin. 20 ul nihai hacim getirmek için su ilave edilir.
4. PLuc kontrol konstruktunun 5 ul pYFP ve kontrol yapısının 5 ul DNA içeren bir kontrol karışımı hazırlayın. 1,800 ng toplam DNA kütlesi getirmek için dolgu plazmid ekleyin. 20 ul nihai hacim getirmek için su ilave edilir.
5. Pozitif kontrol konstruktun 5 ul DNA içeren bir kontrol karışımı hazırlayın. 1,800 ng toplam DNA kütlesi getirmek için dolgu plazmid ekleyin. 20 ul nihai hacim getirmek için su ilave edilir.
6. Aşağıdaki DNA, ilgili pLuc oluşturmak 5 ul ve py 5 ul birleşerek DNA karışımı için ilgi, X bir proteinin homodimerizasyon test etmek için karışımları hazırlamakFP inşa. 1,800 ng toplam DNA kütlesi getirmek için dolgu plazmid ekleyin. 20 ul nihai hacim getirmek için su ilave edilir.
   A) pLuc-kontrolü ve pYFP-X
   B) pLuc-X ve pYFP kontrol
   C) pLuc-X-X ve pYFP
7. Aşağıdaki DNA ilgi konusu olan proteinlerin bir çifti arasında bir etkileşim için test etmek için karışımları hazırlamak, X ve Y, her bir DNA karışımı için, ilgili pLuc oluşturmak 5 ul birleştirmek ve pYFP 5 ul oluştururlar. 1,800 ng toplam DNA kütlesi getirmek için dolgu plazmid ekleyin. 20 ul nihai hacim getirmek için su ilave edilir.
   A) pLuc-kontrolü ve pYFP-X
   B) pLuc-X ve pYFP kontrol
   C) pLuc-kontrolü ve pYFP-Y
   D) pLuc-Y ve-kontrol pYFP
   E) pLuc-X-Y ve pYFP
   F) pLuc-Y ve-X pYFP

3. Transfeksiyon

1. Hasat 75 cm ² şişeden HEK293 hücreleri alt konfluent. Kültür ortamında 13 ml toplam hücrelerin% 10 seyreltin. Beyaz her oyuğuna hücre süspansiyonu 130 ul koyunnet 96 oyuklu doku kültürü plakası dipli. 24 saat boyunca kültür hücreleri.
2. 3 ile DNA karışımları sayısını çarpılarak transfekte edilecek kuyu sayısını hesaplayın., Oda sıcaklığına kadar, serum içermeyen kültür ortamı getirin. Serum-barındırmayan ortam içinde 6.3 ul ve oyuk başına 0.18 ul transfeksiyon reaktifi ihtiva eden bir ana karışımı hazırlayın. Vorteks ile karıştırılır ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
3. Serum-barındırmayan ortam / transfeksiyon reaktifi ana karışımı 20 ul DNA karışımı 2 ul ekleyerek transfeksiyon karışımları hazırlayın. Vorteks. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
4. Oyuk başına transfeksiyon karışımı 6.5 ul tevzi her transfeksiyon karışımı ile üç kuyu transfekte. Bir başka 36-48 saat için kültür hücreleri.

Bret Sinyal 4. Ölçümü

1. Vorteks ile DMSO içinde 34 mg / ml 'de, canlı hücre lusiferaz alt-tabaka içinde çözündürülür.
2. Alt-tabaka seyreltme ortamı p 1:1,000 ile yeniden canlı hücre lusiferaz alt-tabaka seyreltik37 ° C'ye yeniden ısıtıldı 50 alt-tabaka seyreltme ortamı ul başına de izin verir. Karıştırmak için Vortex. Bir çökelti meydana getirebilir, ancak testi ile engel olmaz.
3. 96 oyuklu plaka kültür ortamı aspire. Her bir seyreltilmiş canlı hücre lusiferaz alt-tabaka 50 ul koyun. En az 2 saat (en fazla 24 saat) için Kültür hücreleri.
4. 96 oyuklu plaka kapağı çıkarın ve luminometre içinde, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
5. Ayrıca bir anda Luc ve YFP itibaren emisyonunu ölçün. Uzun ve 470 nm dalga boylarında daha engelleyen bir filtre kullanılarak Luc adlı emisyonunu ölçün. 500-600 nm bant geçişli filtre kullanılarak YFP salmaları ölçün. 10 sn emisyon sinyalleri entegre.

5. Veri Analizi

1. Sadece dolgu plazmid alınan 3 kuyulardan Luc emisyon ölçümleri ortalama. Arka plan çıkarılır Luc emisyon değerlerini üretmek için diğer tüm Luc emisyon okumalar bu Değ.Çıkar.
2. Sadece dolgu plazmid alınan 3 kuyulardan YFP emisyon ölçümleri ortalama. Arka plan çıkarılır YFP emisyon değerlerini üretmek için diğer tüm YFP emisyon okumalar bu Değ.Çıkar.
3. Her bir kuyu için, düzeltilmemiş Bret oranını vermek arka plan çıkarılır Luc emisyon değeriyle arka plan çıkarılır YFP emisyon değeri bölmek.
4. Yalnızca pLuc kontrol plasmidi ile transfekte edildi, üç kuyu düzeltilmemiş BRET oranlarını ortalama. Düzeltilmiş Bret oranlarını vermek için tüm diğer düzeltilmemiş Bret oranlarından bu Değ.Çıkar.
5. Düzeltilmiş BRET oranlar kalan kümelerinin her biri için, bir son BRET oranını elde etmek için, üç transfekte kuyulardan değerlerinin ortalamasını alın.

Sonuçlar

BRET Analizin ilkesi Şekil 2'de görüntülenmiştir. Burada yer alan deneyler boyunca kullanılan deney kurulumu, Şekil 3'te gösterilmiştir. Bir lusiferaz-YFP füzyon proteini ile transfekte edilmiş hücrelerin güçlü bir BRET sinyalin tespiti enerji transferi gözlemlenebilir olduğunu doğruladı Bu deney düzeneğinde (Şekil 4).

Bizim araştırma beyin gelişiminde transkripsiyonel baskılayıcıların FoxP ailenin rolü ...

Tartışmalar

Füzyon protein ekspresyon yapılarının tasarımı Bret tahlil kurma önemli bir adımdır. Burada yer alan deneylerde, ilgi duyulan proteinlerin veya lusiferaz YFP C-terminine kaynaştırılmıştır. De mümkündür, ve lusiferaz / YFP N-terminine proteinleri sigorta, gerekli olabilir. Bazı proteinler için, füzyonları, sadece protein yapısı ve işlevinin bozulmasını önlemek için N-veya C-terminalinde ya da kabul edilebilir. Ayrıca, zar proteinleri olarak N ve C termini lusiferaz / YFP protein etkileşim o...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanodrop 8000	Nanodrop		Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96-microwell plates, flat bottom, white	Greiner Bio One	655098	White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software	TECAN		Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.
pLuc, pYFP, positive control plasmid	N/A	N/A	Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells	ECACC	85120602	Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red	Gibco	41966	This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)	Gibco	21063	This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum	Gibco	10270	For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent	Novagen	70967	If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO	Sigma	D2650	Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.
EnduRen live-cell substrate	Promega	E6481	Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.