Исследование белок-белковых взаимодействий в живых клетках с помощью биолюминесценции резонансный перенос энергии

Резюме

Взаимодействия между белками являются основополагающими для всех клеточных процессов. Использование биолюминесценции резонансный перенос энергии, взаимодействие между парой белков можно контролировать в живых клетках и в реальном времени. Кроме того, эффекты потенциально патогенных мутаций могут быть оценены.

Аннотация

Анализы, основанные на Биолюминесценция резонансный перенос энергии (BRET) обеспечивают чувствительные и надежные средства контроля за белок-белковых взаимодействий в живых клетках. BRET является безызлучательное передача энергии от «донора» фермента люциферазы к «акцепторной» флуоресцентного белка. В наиболее общем конфигурации этом анализе донор Renilla reniformis люциферазы и акцептора желтый флуоресцентный белок (YFP). Поскольку эффективность передачи энергии сильно зависящая от расстояния, наблюдение явления BRET требует, чтобы донор и акцептор находиться в непосредственной близости. Для проверки взаимодействия между двумя представляющих интерес белков в культивируемых клетках млекопитающих, один белок экспрессируется в виде слияния с люциферазы, а второй в виде слияния с YFP. Взаимодействие между двумя представляющих интерес белков может привести донора и акцептора достаточно близко для передачи энергии происходит. По сравнению с другими методами для исследования белок-белковых ввзаимодействий, анализ BRET чувствителен, требует мало практического времени и несколько реагентов, и способен обнаруживать взаимодействия, которые слабы, преходящее, или зависит от биохимической среде найденного в живой клетке. Поэтому идеальный подход для подтверждения предполагаемых взаимодействий предложенные дрожжей двух гибридных или масс-спектрометрии протеомики исследований, и, кроме того это хорошо подходит для отображения взаимодействия регионов, оценивает эффект от пост-трансляционных модификаций на белок-белковых взаимодействий, и оценки воздействия мутаций, выявленных в ДНК пациента.

Введение

Оба классическая связь и следующего поколения секвенирования анализ нарушений в организме человека являются выявление клиническую значимость белков, участвующих в диапазоне биологических путей. Это часто бывает, что до их идентификации в таких исследований, было мало или вообще не исследование биологической роли этих белков. Один плодотворным начать изучение биологической функции белка интереса является определить, какие другие белки он взаимодействует с в физиологическом контексте. Характеризуя молекулярные сети таким образом дает представление о биологических путей, лежащих в основе фенотипа человека.

Наиболее часто используемый масштабный скрининг подходов для идентификации партнеров кандидатов взаимодействия белков, представляющих интерес, дрожжи двугибридная скрининг ¹ и масс-спектрометрии на основе протеомики ^2. Эти методы могут быть очень успешным в предложении потенциальных взаимодействующих белков, но аре уязвимы к ложным положительным результатам. Таким образом, подтверждение взаимодействия, определенных дрожжей двух гибридных или массового скрининга спектрометрии требуется проверку взаимодействия с использованием второго технику. Обычно со-иммунопреципитацию или тянуть вниз анализ используют для этой цели ^3. Одним из недостатков использования таких методов для проверки является требование к лизису клеток, которая разрушает внутриклеточные условия, которые могут быть необходимы для поддержания определенных белковых взаимодействий. Вторым недостатком является то, что слабые или переходные белковых взаимодействий может быть нарушена во время стадий промывки. Кроме того, эти анализы требуют значительных практического времени, ограничены в количестве образцов, которые могут быть обработаны одновременно, и часто требуют много времени оптимизации реагентов и протоколов.

Чтобы преодолеть некоторые из проблем, связанных с со-иммунопреципитации экспериментов, несколько анализы были разработаны на основе флуоресцентных и bioluminescent белки, которые могут быть использованы в живых клетках. Первые такие анализы были основаны на флуоресценции (или Ферстер) резонансный перенос энергии (FRET), не-лучистого переноса энергии между двумя флуоресцентных белков с перекрытием спектров испускания и возбуждения ^4. Эффективность передачи энергии сильно зависящая от расстояния, поэтому наблюдение явления FRET требует, чтобы доноров и акцепторов флуорофоры находиться в непосредственной близости. Для проверки взаимодействия между двумя белками, представляющих интерес, один белок экспрессируется в виде слияния с донорного флюорофора (обычно голубой флуоресцентный белок; CFP) и второй виде слитого с акцепторного флюорофора (обычно желтого флуоресцентного белка; YFP). Взаимодействие между двумя белками интересов может привести донора и акцептора флуорофоры достаточно близкие для передачи энергии происходят, что приведет к ощутимым увеличением эмиссии света от YFP акцепторной относительно донора CFP. FRET успешно обнаружения белок-белковых взаимодействий в живых клетках ^4. Основным недостатком использованием FRET для обнаружения белок-белковых взаимодействий является требование наружного освещения для возбуждения доноров флуорофора. Внешние результаты освещенности в высоком фоне в сигнале выбросов, нежелательного возбуждения акцептора и фотообесцвечивания как донора и акцептора флуорофорами. Эти эффекты уменьшить чувствительность анализа для обнаружения белок-белковых взаимодействий.

Модификация FRET анализа, который преодолевает проблему высокой фоне из наружного освещения является передача Биолюминесценция резонансной энергии (BRET) анализ ^5,6. В системе BRET донор флуорофор заменен фермента люциферазы. Таким образом, энергия возбуждения акцепторного флюорофора генерируется внутри системы окислением люциферазы субстрата, что делает ненужным внешний освещение. В наиболеестандартная конфигурация этого анализа, донором является Renilla reniformis люциферазу и акцептора YFP (для обсуждения альтернативного донора и акцепторных белков см. Pfleger соавт. ^5). Соответственно, в этой системе, представляющий интерес белок слит с люциферазы и потенциально-взаимодействующего белка к YFP, или наоборот. BRET анализ требует добавления коэлентеразина в качестве субстрата для люциферазы. Поскольку целентеразин является проницаемым для клеток, можно выполнить BRET анализов в живых клетках. Тем не менее, родной целентеразин неустойчиво в водном растворе, и фермент-независимый пробой коэлентеразина и снижает концентрацию субстрата, доступной для анализа и генерирует autoluminescence, что снижает чувствительность измерений активности люциферазы. Использование BRET в живых клетках было облегчено развитию охраняемых coelenterazines, устойчивых в водном растворе, но расщепляются цитозольным эстеразыс после диффузии через клеточную мембрану, чтобы генерировать активный коэлентеразина внутри клетки ^7.

После добавления субстрата в клетках, экспрессирующих люциферазы-и YFP-слитые белки, передача энергии в результате белок-белковых взаимодействий количественно путем мониторинга выбросов от люциферазы и YFP. Поскольку белковые взаимодействия можно контролировать непосредственно в живых клетках в мульти-луночных планшетах, анализ BRET представляет собой простую, масштабируемую способ проверки предполагаемых взаимодействий, что является экономически и эффективный по времени.

В дополнение к проверке предполагаемых interactors выявленных в протеомных скрининговых исследований, система BRET также может быть использован для тестирования кандидатов interactors, вытекающих из предыдущих биохимических и структурных исследований по представляющим интерес белком. После того, как существование белок-белкового взаимодействия было установлено (либо с помощью анализа BRET или другими методами), существует возможность BRET анализ быть EMPloyed далее характеризуют взаимодействие. Например, взаимодействующие участки могут быть отображены путем генерации усеченные варианты белков, и вовлечение специфических остатков в взаимодействия может быть продемонстрирована путем создания точечных мутаций. Кроме того, модулирующее действие посттрансляционных модификаций или малых молекул (например, лекарственных препаратов или лигандов) на белок-белковых взаимодействий могут быть исследованы ^8-10.

BRET анализ также имеет большой потенциал для исследования мутаций, выявленных в ДНК пациента. В случаях, когда была создана причинную роль для мутации, изучении влияния мутации на белок-белковых взаимодействий с помощью BRET может выявить больше о молекулярном этиологии фенотипа ^11. С появлением методик секвенирования следующего поколения, становится все более распространенным в течение нескольких потенциально повреждающих мутации, которые будут определены в течение индивидуума, и в этом случае остается неясным, которые РелеВант в фенотипе ^12. В этой ситуации анализ BRET может быть ценным в оценке воздействия мутаций на функцию белка и, следовательно, их актуальность для расстройства.

протокол

1. Создание плазмид

1. Субклонировани кДНК для каждого интересующего белка в обоих векторов pLuc и pYFP, ​​с использованием стандартных способов молекулярной биологии (рис. 1). Подробные протоколы см. Зеленый и др. ^13.
2. Последовательность всех строит, чтобы убедиться, что белки интересные в рамке с последовательностью Люк / YFP без промежуточных стоп-кодонов.
3. Выполнение функциональных анализов по желанию, чтобы подтвердить, что слитые белки сохраняют биологическую активность. В случае представленной здесь внутриклеточной локализации слитых белков YFP было установлено путем флуоресцентной микроскопии.
4. Сделать плазмиды экспрессии для соответствующих белков управления Люк и YFP инженерными соответствующие сигналы таргетинга в векторы экспрессии pLuc и pYFP. В случае, представленном здесь, генерировать ядерных таргетингом Luc и YFP конструкции, вставив сигнал ядерной локализации в векторы pLuc и pYFP.
5. Делатьположительное конструкция управления, в котором Люк и YFP слиты в единый полипептид. В случае, представленном здесь, генерировать положительный контроль, в котором кодирующая последовательность YFP вставлен в вектор pLuc.
6. Выбор нейтральный наполнитель плазмиды, которые будут использоваться для выравнивания массу ДНК в трансфекции смесей. Использование плазмиды, которая не имеет эукариотический промотор и, следовательно, будет транскрипционно неактивный в клетках млекопитающих, таких как бактериальный клонирующий вектор.

2. Подготовка ДНК Mixes

1. Оценить концентрацию всех плазмид, описанных в разделе 1 на основе поглощения при 260 нм (1 оптическая плотность единица эквивалентна 50 мкг / мл ДНК). Определить молекулярную массу каждой плазмиды путем умножения количества пар оснований на 650 дальтон. С помощью концентрации и молекулярную массу вычислить молярную концентрацию каждого препарата плазмиды. Развести препараты плазмидной ДНК в концентрации 36 нМ. Это будут рабочие запасы, который будет использоваться для приготовления смесей ДНК для трансфекции.
2. Приготовьте смесь управления ДНК, содержащего 1800 нг плазмиды наполнителя в конечном объеме 20 мкл воды.
3. Подготовьте смесь управления ДНК, содержащего 5 мкл pLuc контроля конструкции. Добавить заливной плазмиды довести общую массу ДНК в 1800 нг. Добавьте воду, чтобы довести до конечного объема 20 мкл.
4. Подготовьте смесь управления ДНК, содержащего 5 мкл pLuc контроля конструкции и 5 мкл pYFP контроля конструкции. Добавить заливной плазмиды довести общую массу ДНК в 1800 нг. Добавьте воду, чтобы довести до конечного объема 20 мкл.
5. Приготовьте смесь управления ДНК, содержащего 5 мкл положительного контроля конструкции. Добавить заливной плазмиды довести общую массу ДНК в 1800 нг. Добавьте воду, чтобы довести до конечного объема 20 мкл.
6. Подготовьте следующие ДНК смешивается для проверки гомодимеризации белка интересов, X. Для каждой смеси ДНК объединить 5 мкл соответствующего pLuc построить и 5 мкл РуFP построить. Добавить заливной плазмиды довести общую массу ДНК в 1800 нг. Добавьте воду, чтобы довести до конечного объема 20 мкл.
   А) pLuc-контроль и pYFP-X
   Б) pLuc-X и pYFP-контроль
   С) pLuc-X и pYFP-X
7. Подготовьте следующие ДНК смешивается для проверки взаимодействия между парой белков, представляющих интерес, X и Y. Для каждой смеси ДНК объединить 5 мкл соответствующего pLuc построить и 5 мкл pYFP построить. Добавить заливной плазмиды довести общую массу ДНК в 1800 нг. Добавьте воду, чтобы довести до конечного объема 20 мкл.
   А) pLuc-контроль и pYFP-X
   Б) pLuc-X и pYFP-контроль
   С) pLuc-контроль и pYFP-Y
   D) pLuc-Y и pYFP-контроль
   Е) pLuc-X и pYFP-Y
   F) pLuc-Y и pYFP-X

3. Трансфекцию

1. Урожай субконфлюентные HEK293 клетки от 75 см ² колбы. Развести 10% от общего количества клеток в 13 мл культуральной среды. Внесите 130 мкл клеточной суспензии в каждую лунку белыйпрозрачным дном 96-луночного планшета для культуры ткани. Культуры клеток течение 24 часов.
2. Рассчитайте количество скважин для трансфекции путем умножения количества миксов ДНК на 3. Принесите бессывороточную культуральной среды до комнатной температуры. Подготовка основной смеси, содержащей 6,3 мкл бессывороточной среды и 0,18 мкл реагента для трансфекции на лунку. Смешайте на вортексе и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
3. Подготовка трансфекции смеси путем добавления 2 мкл смеси ДНК в 20 мкл сыворотки средний / трансфекции реагента мастер-микса. Не вихрь. Инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
4. Трансфекции три скважины с каждым трансфекции смеси дозирования 6,5 мкл трансфекции смеси в каждую лунку. Культура клетки для дальнейшего 36-48 часов.

4. Измерение BRET сигнала

1. Растворите живых клеток субстрата люциферазы в 34 мг / мл в ДМСО встряхиванием.
2. Развести восстановленного субстрата люциферазы живых клеток на 1:1000 в подложки разбавления среды рповторно нагревали до 37 ° С. Разрешить 50 мкл субстрата разбавления среды на каждую лунку. Vortex перемешать. Может образовываться осадок, но не будет мешать анализа.
3. Аспирируйте культуральной среды из 96-луночного планшета. Внесите 50 мкл разбавленного субстрата люциферазы живых клеток в каждую лунку. Культуры клеток, по крайней мере 2 часов (до 24 ч).
4. Удалить крышку с 96-луночного планшета и инкубировать пластины в течение 10 мин при комнатной температуре внутри люминометра.
5. Измерьте излучение Люком и YFP одной хорошо одновременно. Измерьте излучение Luc используя фильтр блокировки длины волн длиннее 470 нм. Измерьте излучение YFP ​​использованием 500-600 нм полосовой фильтр. Интеграция сигналы выбросов в течение 10 сек.

5. Анализ данных

1. Среднее значение на основании показаний выбросов Luc от 3 скважины, которые получили только наполнитель плазмиды. Вычтите это значение от всех других показаний выбросов Luc производить значения выбросов Luc фоновые вычитается.
2. Среднее значение на основании показаний выбросов YFP от 3 скважины, которые получили только наполнитель плазмиды. Вычтите это значение от всех других показаний выбросов YFP производить значения выбросов YFP фоновые вычитается.
3. Для каждой лунки, разделить значение выбросов YFP фона вычитается на величину выбросов, Люк фон вычитается дать нескорректированного соотношение Брет.
4. Нормальное нескорректированных отношения Брет из трех скважин, которые были трансфицированных только pLuc-контрольной плазмиды. Вычтите это значение от всех других неисправленных отношений BRET дать скорректированные коэффициенты Брет.
5. Для каждого из оставшихся наборов исправленных коэффициентов BRET, усреднить значения за три трансфектированных скважин для получения конечного соотношение Брет.

Результаты

Принцип BRET анализа показан на рисунке 2. Установка анализ используется во всех экспериментах, представленных здесь изображен на рисунке 3. Обнаружение сильного сигнала от BRET клеток, трансфицированных слитого белка люциферазы-YFP подтвердил, что передача энергии можно ...

Обсуждение

Конструкция экспрессирующих конструкций гибридного белка является важным шагом в создании Брет анализа. В экспериментах, представленных здесь, белки, представляющие интерес, слит с С-концом люциферазы или YFP. Кроме того, возможно, и может быть необходимым, чтобы сплавить протеины к N-ко...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanodrop 8000	Nanodrop		Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96-microwell plates, flat bottom, white	Greiner Bio One	655098	White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software	TECAN		Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.
pLuc, pYFP, positive control plasmid	N/A	N/A	Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells	ECACC	85120602	Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red	Gibco	41966	This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)	Gibco	21063	This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum	Gibco	10270	For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent	Novagen	70967	If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO	Sigma	D2650	Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.
EnduRen live-cell substrate	Promega	E6481	Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.