生物発光共鳴エネルギー転移を用いて生細胞中のタンパク質 - タンパク質相互作用を調査する

要約

タンパク質間の相互作用は、すべての細胞プロセスの基本である。生物発光共鳴エネルギー転移を用いて、タンパク質の対の間の相互作用は、生細胞におけるリアルタイムでモニターすることができる。さらに、潜在的に病原性の変異の効果を評価することができる。

要約

生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）に基づくアッセイは、生細胞におけるタンパク質 - タンパク質相互作用をモニターするための高感度で信頼性の高い手段を提供する。 BRETは「アクセプター」蛍光タンパク質への「ドナー」ルシフェラーゼ酵素からのエネルギーの非放射伝達である。このアッセイの最も一般的な構成では、ドナーはウミレニフォルミスルシフェラーゼであるとアクセプターは、黄色蛍光タンパク質（YFP）である。エネルギー移動の効率を強く距離依存なので、BRET現象の観察は、ドナーとアクセプターが近接にあることを必要とする。培養哺乳動物細胞中の目的の2つのタンパク質間の相互作用をテストするために、一つのタンパク質をルシフェラーゼとの融合とYFPとの融合としての第2のように表現されている。関心のある2つのタンパク質間の相互作用は、エネルギー移動が起こるのに十分に近いドナーおよびアクセプターをもたらすことができる。タンパク質 - タンパク質を調査するための他の技術と比較してteractionsは、BRETアッセイは敏感であり、少しのハンズオン時間といくつかの試薬を必要とし、弱い一過性の、または、生細胞内で見つかった生化学的環境に依存している相互作用を検出することができます。従って、酵母ツーハイブリッドまたは質量分析プロテオミクス研究によって示唆され、推定上の相互作用を確認するための理想的なアプローチであり、加えて、タンパク質 - タンパク質相互作用に対する翻訳後修飾の効果を評価する、マッピング相互作用する領域に適していて、患者のDNAで同定された変異の影響を評価する。

概要

ヒトの疾患の両方の古典的な結合および次世代シーケンス解析は、生物学的経路の範囲に関与するタンパク質の臨床的関連性を明らかにしている。なお、従来、このような研究におけるそれらの同定のために、これらのタンパク質の生物学的役割のほとんど又は全く検討があったことがよくある。目的のタンパク質の生物学的機能を探索を開始する一つの実りアベニューは、その生理的な文脈でと対話する他のどのタンパク質を特定することです。このように、分子ネットワークを特徴づけることは、人間の表現型の根底にある生物学的経路への洞察を提供しています。

最も頻繁に使用される大規模スクリーニングは、目的のタンパク質のための候補相互作用パートナーを同定するためのアプローチは、酵母ツーハイブリッドスクリーニング¹及び質量分析に基づくプロテオミクス²である。これらのメソッドは、潜在的な相互作用するタンパク質を示唆している中で、非常に成功したが、arはでき偽陽性の結果を受けやすいE。従って、酵母ツーハイブリッドまたは質量分析スクリーニングによって同定相互作用の確認は、第二の技術を用いて相互作用の検証を必要とする。典型的には、共免疫沈降、またはプルダウンアッセイは、この目的のために使用される^3。検証のためにそのような技術を使用する1つの欠点は、特定のタンパク質相互作用を維持するために必須であり得る細胞内条件を破壊し、細胞溶解のための要件である。第2の欠点は、弱いかまたは一過性のタンパク質相互作用は、洗浄工程中に破壊され得ることである。さらに、これらのアッセイは、重要な実践的な時間を要求を同時に処理することができるサンプルの数が制限され、多くの場合、試薬およびプロトコルの時間のかかる最適化を必要とする。

共免疫沈降実験に関連する問題のいくつかを克服するために、いくつかのアッセイは、蛍光及びbiolumに基づいて開発されている生細胞において使用することができるinescentタンパク質。最初のそのようなアッセイは、蛍光（又はフェルスター）共鳴エネルギー移動（FRET）、重複する発光および励起スペクトルを持つ⁴つの蛍光タンパク質間のエネルギーの非放射伝達に基づいた。エネルギー移動の効率は、従って、FRET現象の観察は、ドナーとアクセプターフルオロフォアが近接している必要があり、強く、距離依存性である。とアクセプター蛍光（一般的に黄色蛍光タンパク質、YFP）との融合のような第2、関心のある2つのタンパク質間の相互作用をテストするために、一つのタンパク質は、ドナー·フルオロ（CFP一般シアン蛍光タンパク質）との融合体として発現されている。関心のある2つのタンパク質間の相互作用は、CFPドナーにYFPアクセプターの位置からの発光の測定可能な増加をもたらすであろう、エネルギー移動が起こるのに十分に近いドナーおよびアクセプターフルオロフォアをもたらすことができる。 FRETは、生きた細胞中⁴タンパク質-タンパク質相互作用を検出することに成功している。タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するためにFRETを使用することの主な欠点は、ドナーフルオロフォアの励起に外部照明のための要件である。発光信号、アクセプターの不必要な励起、およびドナーとアクセプターフルオロフォアの両方の光退色の高いバックグラウンドで外部照明の結果。これらの効果は、タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するためのアッセイの感度を低下させる。

外部照明から高バックグラウンドの問題を克服するFRETアッセイの修飾は、生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）アッセイ^5,6である。 BRETシステムにおいて、ドナーフルオロフォアは、ルシフェラーゼ酵素により置換されている。こうして、アクセプターフルオロフォアの励起にエネルギーが不要な外部照明をレンダリングする、ルシフェラーゼ基質を酸化することにより、システム内で生成される。ほとんどのこのアッセイの一般的な構成は、ドナーはウミがルシフェラーゼウミとアクセプターが（代替供与体および受容体タンパク質の議論のためにフレら ^5参照 ）YFPである。したがって、このシステムでは、目的のタンパク質は、ルシフェラーゼおよび潜在的に相互作用タンパク質YFPへ、またはその逆に融合される。 BRETアッセイは、ルシフェラーゼの基質としてセレンテラジンを追加する必要があります。セレンテラジンは細胞透過性であるため、生細胞におけるBRETアッセイを行うことができる。しかしながら、天然のセレンテラジンは、水溶液中で不安定であり、セレンテラジン両方の酵素非依存性分解アッセイのために利用可能な基質の濃度を減少させ、自己発光を生成し、ルシフェラーゼ活性の測定の感度を減少させる。生細胞におけるBRETの使用は、水溶液中で安定である保護されたセレンテラジンの開発によって促進されたが、細胞質ゾルエステラーゼによって切断されるセル⁷内活性セレンテラジンを生成するために、細胞膜を横切って拡散後sである。

ルシフェラーゼおよびYFP融合タンパク質を発現する細胞への基質の添加後、タンパク質 - タンパク質相互作用から生じるエネルギー移動をルシフェラーゼおよびYFPからの発光をモニターすることにより定​​量化される。タンパク質相互作用は、マルチウェルプレート中の生細胞内で直接監視することができるので、BRETアッセイ法は、費用及び​​時間効率的である推定上の相互作用を検証するための簡単​​な、スケーラブルな方法を構成する。

プロテオームスクリーニング研究で同定された推定インタラクターを検証することに加えて、BRETシステムはまた、目的のタンパク質上の従来の生化学的および構造的研究から生じる相互作用物質候補を試験するために使用することができる。タンパク質 - タンパク質相互作用の存在は（BRETアッセイを使用して、または他の技術のいずれかによって）確立されると、emp表であるとBRETアッセイの可能性がある相互作用を特徴づけるために、さらにloyed。例えば、相互作用領域はタンパク質の切断型を生成することによってマッピングすることができ、相互作用における特定の残基の関与は、点突然変異を作成することによって実証することができる。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用に対する翻訳後修飾、または（例えば、薬物またはリガンドなど）の小分子調節効果は^8-10を調査することができる。

BRETアッセイはまた、患者のDNAで同定された変異を調査するための大きな可能性を秘めている。突然変異の原因の役割がBRETを用いたタンパク質-タンパク質相互作用に対する変異の効果を研究、確立されているケースでは、表現型¹¹の分子病因についての詳細を公開してもよい。次世代シークエンシング方法の登場以来、それがRELEある不明確である場合には、個体内で識別することには、いくつかの潜在的に損傷を与える変異は、ますます一般的である表現型^〜12 vant。この状況では、BRETアッセイは、タンパク質の機能およびその障害のゆえの関連性に対する変異の影響を評価する上で貴重であり得る。

プロトコル

プラスミドの1。作成

1. （ 図1）標準的な分子生物学技術を使用して、両方をpLucおよびpYFPベクターに関心対象の各タンパク質のためのcDNAをサブクローニングする。詳細なプロトコルのためにGreen ら ^13を参照してください。
2. シーケンスは、すべての目的のタンパク質が介在終止コドンとリュック/ YFPの配列とインフレームであることを確認するために構築します。
3. 所望の融合タンパク質は、生物学的活性を保持することを確認するための機能的アッセイを行う。ここに提示された場合にYFP融合タンパク質の細胞内局在を、蛍光顕微鏡により確認した。
4. pLucをとpYFP発現ベクターに関連する標的化シグナルを操作することによって、適切なリュックとYFP制御タンパク質の発現プラスミドを作成します。ここで紹介する場合、pLucをしてpYFPベクターに核移行シグナルを挿入することにより、核標的リュックとYFPの構造を生成します。
5. 作るLucおよびYFPは、単一のポリペプチドに融合された陽性対照構築物。ここに提示された場合に、YFPをコードする配列はpLucをベクターに挿入された陽性対照を生成する。
6. トランスフェクション混合物にDNAの質量を等しくするために使用される中性フィラープラスミドを選択する。全く真核生物プロモーターを持っていないため、このような細菌のクローニングベクターのような哺乳動物細胞における転写的に不活性になるプラスミドを使用してください。

DNAミックスの2。準備

1. 260 nmの吸光度に基づいて、セクション1に記載されている全てのプラスミドの濃度を推定（1吸光度単位は、50μgのDNA / mlのと同じです）。 650ダによって塩基対の数を乗じて各プラスミドの分子量を決定します。各プラスミド調製物のモル濃度を計算するために濃度および分子量を使用する。 36 nMでの濃度のプラスミドDNA調製物を希釈する。これらは、ワーキングストックになりますすなわち、トランスフェクションのためのDNAミックスを調製するために使用される。
2. 水20μlの最終体積中に、フィラープラスミドの1800 NGを含むコントロールDNAミックスを調製する。
3. pLucを制御コンストラクトの5μLを含むコントロールDNAミックスを調製する。 1800 NGに全DNA質量を持って来るためにフィラープラスミドを追加します。 20μlの最終容量を持って来るために水を加える。
4. pLucを制御コンストラクトの5μLとpYFP制御コンストラクトの5μLを含むコントロールDNAミックスを調製する。 1800 NGに全DNA質量を持って来るためにフィラープラスミドを追加します。 20μlの最終容量を持って来るために水を加える。
5. ポジティブコントロールコンストラクトの5μLを含むコントロールDNAミックスを調製する。 1800 NGに全DNA質量を持って来るためにフィラープラスミドを追加します。 20μlの最終容量を持って来るために水を加える。
6. 以下のDNAは、目的のタンパク質のホモ二量体化をテストするためにミックスの準備、各DNAミックスXを、関連pLucを5μlの構築Pyとの5μLを組み合わせるFPは構築。 1800 NGに全DNA質量を持って来るためにフィラープラスミドを追加します。 20μlの最終容量を持って来るために水を加える。
   A）pLucを制御し、pYFP-X
   B）をpLuc-XおよびpYFP制御
   C）をpLuc-XおよびpYFP-X
7. 以下のDNAは、目的のタンパク質のペアの間の相互作用をテストするためにミックスの準備、XおよびYは、それぞれのDNA混合物に関連しpLucをコンストラクトの5μLを組み合わせ、pYFP5μlを構築する。 1800 NGに全DNA質量を持って来るためにフィラープラスミドを追加します。 20μlの最終容量を持って来るために水を加える。
   A）pLucを制御し、pYFP-X
   B）をpLuc-XおよびpYFP制御
   C）をpLuc制御とpYFP-Y
   D）をpLuc-YとpYFP制御
   E）をpLuc-XおよびpYFP-Y
   F）をpLuc-YとpYFP-X

3。トランスフェクション

1. 収穫は75cm ^2のフラスコからのHEK293細胞をサブコンフルエント。培地13mlの中に全細胞の10％に希釈する。白の各ウェルに細胞懸濁液130μLを分注透明な96ウェル組織培養プレート底。 24時間培養細胞。
2. 3によりDNAミックスの数を乗算することによってトランスフェクトするウェルの数を計算する。室温まで無血清培地をもたらす。無血清培地の6.3μLおよびウェルあたり0.18μlのトランスフェクション試薬を含むマスターミックスを調製する。ボルテックスで混合し、5分間室温でインキュベートする。
3. 無血清培地/トランスフェクション試薬マスターミックス20μlにDNA混合物の2液を添加することにより、トランスフェクションミックスを準備します。ボルテックスを行います。 10分間室温でインキュベートする。
4. ウェルあたりトランスフェクション混合物の6.5μ​​Lを分注、各トランスフェクション混合物を3つのウェルをトランスフェクト。さらに36〜48時間の培養細胞。

BRET信号の4。測定

1. ボルテックスによりDMSO中34 mg / mlので生細胞のルシフェラーゼ基質を溶解。
2. 基質希釈媒体pで1:1,000に再構成された生細胞のルシフェラーゼ基質を希釈37℃まで再加温しウェル当たり基質希釈50μlの培地を許可します。ミックスする渦。沈殿物が生じることがありますが、アッセイを妨害しません。
3. 96ウェルプレートから培地を吸引する。各ウェルに希釈した生細胞のルシフェラーゼ基質を50μlを分注する。少なくとも2時間培養細胞（24時間まで）。
4. 96ウェルプレートからリッドを外し、内部照度計、室温で10分間、プレートをインキュベートする。
5. よく一度にリュックとYFP 1からの発光を測定します。長い470ナノメートル未満の波長を遮断するフィルタを用いて、リュックからの発光を測定します。 500〜600nmのバンドパスフィルタを用いてYFPから発光を測定する。 10秒かけて発光信号を統合します。

5。データ解析

1. 唯一のフィラープラスミドを受けた3つのウェルからリュックエミッションの測定値を平均。バックグラウンドを差し引いたリュック放射値を生成するために、他のすべてのリュック発光読み取り値からこの値を差し引く。
2. 唯一のフィラープラスミドを受けた3つのウェルからYFP発光測定値を平均する。バックグラウンドを差し引いたYFP発光の値を生成するために、他のすべてのYFP発光測定値からこの値を差し引く。
3. 各ウェルには、補正前のBRET比を与えるためにバックグラウンドを差し引いたリュックエミッション値によりバックグラウンドを差し引いたYFP発光値を分割します。
4. 唯一pLucを、対照プラスミドでトランスフェクトされた3つのウェルからの未補正BRET比を平均する。修正さBRET比を与えるために、他のすべての未修正のBRET比から、この値を引きます。
5. 補正されたBRET比の残りの組のそれぞれについて、最終的なBRET比を得るために3つのトランスフェクトされたウェルからの値を平均する。

結果

BRETアッセイの原理は、 図2に示されている。ここに提示される実験の全体にわたって使用されるアッセイのセットアップを図3に示されている。ルシフェラーゼ-YFP融合タンパク質をトランスフェクトした細胞からの強いBRET信号の検出は、エネルギー移動が観測できたことが確認されこの実験において（ 図4）。

我々の研究は、脳の?...

ディスカッション

融合タンパク質発現構築物の設計は、BRETアッセイをセットアップする際の重要なステップである。ここに提示される実験では、目的のタンパク質は、ルシフェラーゼまたはYFPのC末端に融合させた。それは、ルシフェラーゼ/ YFPのN末端にタンパク質を融合させることも可能であるし、必要であり得る。いくつかのタンパク質は、融合物は、タンパク質の構造および機能の破壊を回避するため?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanodrop 8000	Nanodrop		Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96-microwell plates, flat bottom, white	Greiner Bio One	655098	White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software	TECAN		Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.
pLuc, pYFP, positive control plasmid	N/A	N/A	Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells	ECACC	85120602	Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red	Gibco	41966	This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)	Gibco	21063	This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum	Gibco	10270	For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent	Novagen	70967	If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO	Sigma	D2650	Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.
EnduRen live-cell substrate	Promega	E6481	Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.