حقن Intrastriatal من ذاتي الدم أو اللاهوائية كولاجيناز كنماذج الفئران من نزف الدماغي الداخلي

Summary

Preclinical models of intracerebral hemorrhage are utilized to mimic certain aspects of clinical disease. Thus, mechanisms of injury and potential therapeutic strategies may be explored. In this protocol, two models of intracerebral hemorrhage are described, intrastriatal (basal ganglia) injections of autologous blood or collagenase.

Abstract

نزيف داخل المخ (ICH) هو شكل شائع من الأمراض الدماغية الوعائية ويترافق مع معدلات الاعتلال والوفيات كبيرة. نقص العلاج الفعال وفشل التجارب السريرية الكبيرة التي تستهدف الارقاء وإزالة جلطة تظهر الحاجة لمزيد من التحقيق يحركها آلية ICH. قد يتم تنفيذ هذا البحث من خلال الإطار الذي توفره نماذج قبل السريرية. وتشمل نموذجين الفئران في استخدام شعبية intrastriatal (العقد القاعدية) حقن الدم كله إما ذاتي أو كولاجيناز المطثية. منذ ذلك الحين، كل نموذج يمثل الميزات الفيزيولوجية المرضية تختلف اختلافا واضحا المتعلقة ICH، يمكن اختيار استخدام نموذج معين بناء على ما الجانب من المرض لدراستها. على سبيل المثال، وحقن الدم الذاتي يمثل أكثر دقة استجابة الدماغ على وجود الدم intraparenchymal، ويمكن تكرار أوثق فصي النزف. المطثية حقن كولاجيناز يمثل أكثر دقة لياليتمزق الأوعية مول وتطور ورم دموي سمات نزيف عميق. وبالتالي، فإن كل نتائج النموذج في تشكيل مختلف ورم دموي، والاستجابة neuroinflammatory والتنمية وذمة دماغية، ونتائج السلوك العصبي. قوة من التدخل العلاجي المزعوم يمكن أن يكون أفضل تقييمها باستخدام كلا النموذجين. في هذا البروتوكول، وأظهرت تحريض ICH باستخدام كلا النموذجين، مظاهرة بعد الجراحة الفورية للإصابة، وتقنيات الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية في وقت مبكر. كلا النموذجين تؤدي الى سقوط ضحايا استنساخه، وحجم ورم دموي، والعجز السلوك العصبي. بسبب عدم تجانس ICH الإنسان، وهناك حاجة إلى نماذج متعددة قبل السريرية لاستكشاف آليات الفسيولوجية المرضية بدقة واختبار الاستراتيجيات العلاجية المحتملة.

Introduction

نزيف داخل المخ (ICH) هو شكل شائع نسبيا من الأمراض الدماغية الوعائية مع ما يقرب من 40-50٪ من المرضى المصابين يموتون في غضون 30 يوما ^1. للأسف، أحرز تحسن طفيف في معدل وفيات خلال ال 20 سنة الماضية ^2. وأكد تقارير من المعاهد الوطنية للصحة ⁽³⁾ والمبادئ التوجيهية من جمعية القلب الأمريكية ⁴ على أهمية تطوير النماذج ذات الصلة سريريا من ICH تمديد فهم الفيزيولوجيا المرضية ووضع أهداف للنهج علاجية جديدة.

وتوجد عدة نماذج لمحاكاة ICH الإنسان ^5. كما فهم ICH نضوج الفيزيولوجيا المرضية، فقد أصبح من الواضح أن مجموعة متنوعة من النماذج التي يمكن استخدامها لدراسة جوانب مختلفة من هذا المرض. وتشمل النماذج المستخدمة سابقا الفئران اميلويد اعتلال وعائي ^6، intraparenchymal الإدراج microballoon والتضخم ^7، والدم الشرياني المباشرتسلل ^8،9. تم غرار فصي نزف من اميلويد اعتلال وعائي مع استخدام الفئران المعدلة وراثيا، ويمثل التراث الثقافي غير المادي سلالة متميزة. نماذج تحاكي تأثير Microballoon الشامل الحاد من تشكيل ورم دموي لكنه يفشل في التقاط استجابة الدماغ الخلوية إلى وجود الدم. أخيرا، مباشرة تسلل الدم الشرياني يخضع الدماغ للضغوط الشرياني من الشريان الفخذي. وهكذا، وهذا يحاكي نموذج الضغوط الشرياني ووجود الدم ولكن لا تعرض الدماغ لإصابة تمزق الاوعية الدموية الدقيقة من الأوعية الدموية الصغيرة. علاوة على ذلك، هذا النموذج قد تقلب عالية بطبيعتها. ومن المثير للاهتمام، الفئران ارتفاع ضغط الدم بشكل عفوي ¹⁰ تطوير عفوية ICH مع تقدمهم في السن. دراسة هذه الحيوانات بعد تطوير ICH قد تحاكي المرض في وجود واحد من الأمراض المصاحبة الرئيسية المهيئة للتراث الثقافي غير المادي البشر. في حين توجد هذه النماذج الأخرى، حقن intrastriatal من اللاهوائية كولاجيناز ¹¹ أو حقن instrastiatal لالدم الكامل utologous ¹² هي، في الوقت الراهن، واثنين من النماذج الأكثر شيوعا التي تستخدم في البحوث قبل السريرية ICH.

وينبغي بذل ICH اختيار نموذج استنادا إلى الهدف من السؤال التجريبية، بما في ذلك اختيار الأنواع وطريقة حمل تشكيل دموي. على سبيل المثال، الخنازير هي الحيوانات الكبيرة مع وحدات التخزين بيضاء الدماغ المسألة كبيرة نسبيا بالمقارنة مع الفئران. وبالتالي، هي مناسبة نماذج الخنازير لدراسة المسألة الأبيض الفيزيولوجيا المرضية التالية ICH. في المقابل، أدمغة القوارض هي المادة الرمادية إلى حد كبير، ولكن الأنظمة المعدلة وراثيا جعل القوارض مفيدة لتقييم الآليات الجزيئية من الإصابة والتعافي بعد ICH. يحتوي كل نموذج على نقاط القوة والضعف المتأصلة فيها (الجدول 1)، والتي ينبغي النظر فيها بعناية قبل التجريب.

البروتوكولات التالية تثبت الدم والحقن كولاجيناز نماذج ذاتي في الفئران. وقد ترجمت كل هذه النماذج من نماذج وضعت أصلا في الفئران^13،14 والسماح باستخدام التكنولوجيا المعدلة وراثيا على نطاق واسع لاستكشاف الآليات الجزيئية المرتبطة موت الخلايا بعد ICH. سواء تمثل آليات الإصابة تختلف اختلافا واضحا من ICH الإنسان، وكلاهما النتيجة المتوقعة تختلف اختلافا واضحا من حيث التدابير السلوكية والنسيجية. وبالتالي، قد فرضيات معينة تصلح لنموذج واحد على الآخر، ولكن قد تتطلب التحقق من صحة العديد من الأفكار في كلا النموذجين.

الجدول 1. مقارنة بين خصائص كولاجيناز وحقن الدم نزيف داخل المخ نماذج ذاتي.

	كولاجيناز حقن	حقن الدم
سهولة الاستخدام	+ + +	+ +
استنساخ	+ +	+ +
السيطرة على النزيف الحجم	+ +	+ + +
الجزر الدم	+	+ +
يحاكي الأمراض البشرية	+	-
بساطة	+ +	+ +
استخدام بأنواع متعددة	+ +	+ +

Protocol

بيان الأخلاق: تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة جامعة ديوك المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام ويتبع كل مبادئ توجيهية لاستخدام الأخلاقية للحيوانات.

1. إعداد معدات

1. الأوتوكلاف الأدوات الجراحية قبل الجراحة.
2. تطهير الجهاز المجسم مع الايثانول 70٪.
3. بدوره على حمام المياه والحفاظ على درجة حرارة المياه على 42 درجة مئوية.
4. حل نوع IV-S المطثية كولاجيناز في محلول ملحي بتركيز 0.075 U في 0.4 ميكرولتر.

2. كولاجيناز حقن نموذج

1. وزن الماوس.
2. تخدير الماوس في غرفة الاستقراء مع 5٪ في isoflurane و30٪ O _2/70٪ N _2. وأشار التخدير كافية بعد حوالي 2 دقيقة عندما تباطأ التنفس الماوس إلى 1 في الثانية الواحدة.
3. التنبيب القصبة الهوائية مع 30 ملم 20 G القسطرة الوريدية.
4. الاتصال القسطرة لالتنفس الصناعي القوارض وتهوية الرئتين ميكانيكيا مع 1.6٪ في isoflurane و30٪ O _2/70٪ N ₂ بمعدل 105 نفسا في الدقيقة مع حجم المد والجزر تسليمها من 0.75 مل ^..
5. يحلق فروة الرأس مع ماكينة حلاقة الإلكترونية. مرة واحدة يتم تخدير الماوس ومدخل أنبوب، نقله إلى محطة عمل مختلفة للحلاقة، ثم عاد إلى مقاعد البدلاء الجراحية.
6. تأمين الرأس في إطار المجسم، ومستوى الرأس مع خياطة كلا الاكليلية والسهمي كنقاط مرجعية.
7. تطبيق مرهم للعين للعيون.
8. إدراج التحقيق في درجة الحرارة المستقيم. الحفاظ على درجة حرارة الجسم في 37.0 ± 0.2 ° C باستخدام بانسيابية تعميم مائي.
9. مسح منطقة العمليات الجراحية مع بتدين اتباعها مع الايثانول 70٪ وكرر 3 مرات.
10. جعل 1 سم خط الوسط فروة الرأس شق ومسح السمحاق أفقيا مع القطن ذات الرؤوس قضيب العقيمة لفضح bregma.
11. الحفر 1 مم حفرة قطرها 2.2 مم لدغ غادر اللاتاألطراف إلى bregma مع حفر المياه المبردة.
12. تدوير القارورة كولاجيناز 5 مرات، ثم غسل حقنة 0.5 ميكرولتر مع 25 G إبرة (تعلق على الإطار المجسم) مع 0.5 ميكرولتر حل كولاجيناز 5 مرات (اترك 0.5 ميكرولتر من محلول كولاجيناز في حقنة بعد غسل الماضي).
13. محاذاة طرف الإبرة مع ثقب لدغ ثم طرد 0.1 ميكرولتر من حقنة ويمسح شطبة إبرة مع الحلاقة لتجاهل.
14. باستخدام مياداة مجهرية، ودفع الإبرة 3 ملم العميق للقشرة وترك بلا حراك لمدة 30 ثانية.
15. ضخ 0.4 ميكرولتر أكثر من 90 ثانية.
16. تقليل isoflurane وإلى 1٪ وترك بلا حراك إبرة لمدة 5 دقائق.
17. سحب الإبرة ببطء.
18. تطبيق 1-2 قطرات من 0.25٪ بوبيفاكايين تحت الجلد وخياطة الجلد.
19. إيقاف المرذاذ isoflurane وإزالة الماوس من إطار المجسم.
20. السماح الماوس لاستعادة التهوية عفوية مع نزع الأنبوب الرغامي اللاحقة.
21. عودة الماوس إلى القفص نظيفة والسماح بحرية الوصول إلىالغذاء والماء.

3. ذاتي حقن الدم نموذج

1. اتبع الخطوات 2،1-2،11 للنموذج حقن كولاجيناز.
2. رسم 50 ميكرولتر من محلول ملحي معقم الى ميكرولتر حقنة 30 G 50.
3. ربط حقنة ميكروليتر مع 70 سم أنبوب PE10.
4. طرد كل ملحي عادي من حقنة ميكروليتر في أنبوب PE10 تماما لإزالة أنابيب الهواء.
5. سحب المكبس حقنة ميكروليتر من 1 ملم إلى جعل فقاعة هواء في افتتاح البعيدة للPE10 أنبوب ميكروليتر جهاز حقنة لتجنب خليط من المياه المالحة والدم أثناء الإجراءات في وقت لاحق.
6. مسح القاصي الذيل وسط المنطقة الشريان من الفأر مع الايثانول 70٪، وقطع الشريان بشفرة الحلاقة عند 0.5 إلى 1 سم إلى طرف الذيل.
7. جمع 40 ميكرولتر من الدم من ذيل يقتطع من PE10 أنبوب ميكروليتر جهاز حقنة. ملاحظة: أن لا يتم استخدام الهيبارين في الإبرة، وأنابيب، أو الماوس.
8. نعلق حقنة ميكروليتر على injeمضخة كشن.
9. ربط المعدن قنية جزء من إبرة 27 G إلى نهاية الأنبوب PE10، وتأمين الإبرة إلى مياداة مجهرية على الإطار المجسم.
10. طرد 2 ميكرولتر من الدم من أصل 27 G الإبرة ومسح شطبة إبرة مع الحلاقة لتجاهل.
11. محاذاة طرف الإبرة مع ثقب إبرة لدغ وإدراج 3 ملم العميق للقشرة.
12. ضخ 35 ميكرولتر من الدم الذاتي بمعدل 2 ميكرولتر لكل دقيقة.
13. تقليل isoflurane وإلى 1٪ وترك بلا حراك إبرة لمدة 10 دقيقة.
14. سحب الإبرة أكثر من 30 ثانية.
15. تطبيق 1-2 قطرات من 0.25٪ بوبيفاكايين تحت الجلد وخياطة الجلد.
16. إيقاف المرذاذ isoflurane وإزالة الماوس من إطار المجسم.
17. السماح الماوس لاستعادة التهوية عفوية مع نزع الأنبوب اللاحقة.
18. عودة الماوس إلى القفص نظيفة والسماح بحرية الوصول إلى الغذاء والماء.

4. عملية الشام

1. تتبع نفس الإجراءات لمباشرة صب كولاجينازنموذج ن، باستثناء من دون حقن إبرة بعد الإدراج.

5. رعاية ما بعد الجراحة

1. حقن 0.5 مل تحت الجلد من الطبيعي المالحة في المساء لإجراء العمليات الجراحية في الجزء الخلفي من الرقبة الحيوان.
2. توفير الغذاء خففت بالماء وهلام الغذاء في أكواب بلاستيكية صغيرة توضع على أرضية القفص. استبدال المواد الغذائية يوميا لمدة 7 أيام.
3. تحقق من فقدان الوزن، والتئام الجروح، وعلامات الانزعاج يوميا لمدة 7 أيام.
4. إذا كانت هناك حاجة فترات انتعاش أكبر من 7 أيام، وإزالة خياطة يمكن أداؤها تحت ضوء التخدير استنشاق (حوالي 1٪ isoflurane وفي 30٪ O _2/70٪ N _2)، إذا لزم الأمر.

النتائج

بسبب الاختلافات في تشكيل الورم الدموي (الشكل 1)، يظهر تحول المماثل مباشرة بعد الاستيقاظ بالنسبة للفئران حقنت الدم الذاتي وضمن 2-4 ساعة بعد الحقن كولاجيناز، كما يحدث توسع الورم الدموي (الشكل 2). غياب تحول المماثل يجب أن يثير القلق لعدم وجود إصابات كبير?...

Discussion

على الرغم من البحوث قبل السريرية والتجارب السريرية الكبيرة الناتجة الناشئة للعلاجات واعدة ^15-18، لا توجد التدخلات الدوائية أظهرت لتحسين النتيجة في ICH، ويبقى الرعاية الداعمة إلى حد كبير. قد يتم إنشاء قوائم العلاجات الممكنة بواسطة تكنولوجيات إنتاجية عالية، مثل ا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic frame	Stoelting Co.	51603
Probe holder with corner clamp	Stoelting Co.	51631
Mini grinder	Power Glide	Model 60100002
0.5 μl syringe	Microliter	86259	25 G needle
5 μl syringe	Microliter	7637-01
30 G microliter syringe	Microliter	7762-03
Syringe pump	KD Scientific	Model 100
Heat therapy water pump	Gaymar Industries, Inc.	Model# TP650
Circulating waterbed	CMS Tool & Die, Inc.
Rodent ventilator	Harvard Apparatus	Model 683
Isoflurane vaporizer	Drager	Vapor 19.1
Air flowmeter	Cole Parmer	Model PMR1-010295
Induction chamber			Self made
Otoscope	Welch Allyn	22820
Intravenous catheter	Becton-Dickinson	381534	20 G, 1.16 inch Insyte-W
Isoflurane	Baxter Healthcare Corporation	NDC10019-360-69
Collagenase Type IV-S	Sigma	C1889
Polyethylene tubing PE10	Becton-Dickinson	427401
27 G 1 1/4 inch needle	Becton-Dickinson	305136
Surgical scissors	Miltex	21-539
Forceps	Miltex	17-307
Needle holder	Boboz	RS-7840
Monofilament suture	Ethicon	8698	Size 5-0
Indicating controller	YSI	73ATD