Intrastriataler Injektion von Eigenblut oder Clostridien-Kollagenase als Murine Modelle der Hirnblutung

Zusammenfassung

Preclinical models of intracerebral hemorrhage are utilized to mimic certain aspects of clinical disease. Thus, mechanisms of injury and potential therapeutic strategies may be explored. In this protocol, two models of intracerebral hemorrhage are described, intrastriatal (basal ganglia) injections of autologous blood or collagenase.

Zusammenfassung

Intrazerebralen Blutungen (ICH) ist eine häufige Form von zerebrovaskulären Erkrankungen und ist mit einer signifikanten Morbidität und Mortalität verbunden. Mangel an wirksamen Behandlung und Miss großen klinischen Studien bei Blutstillung und Entfernung von Blutgerinnseln richtet zeigen die Notwendigkeit weiterer Mechanismus gesteuerte Untersuchung der ICH. Diese Forschung kann durch die Rahmen von präklinischen Modellen vorgesehen durchgeführt werden. Zwei Mausmodellen im populären Gebrauch sind intrastriatalen (Basalganglien) Injektion von autologem Vollblut oder Clostridien-Kollagenase. Seit Jedes Modell stellt deutlich unterschiedliche pathophysiologische Funktionen ICH Zusammenhang kann die Verwendung eines bestimmten Modells auf Basis welcher Aspekt der Krankheit untersucht werden soll gewählt werden. Zum Beispiel Eigenblutinjektion am genauesten entspricht der Reaktion des Gehirns auf die Anwesenheit von intraparenchymal Blut und kann lobäre Blutung am nächsten replizieren. Clostridien-Kollagenase-Injektion am genauesten stellt die sMall Gefäßruptur und Hämatome Evolution charakteristisch tiefen Blutungen. So, jeder Modellergebnisse in verschiedenen Hämatombildung, neuroinflammatorischen Antwort, Hirnödem Entwicklung und neurologisch-Ergebnisse. Robustheit eines angeblichen therapeutischen Intervention am besten mit beiden Modellen bewertet werden. In diesem Protokoll Induktion von ICH mit beiden Modellen unmittelbaren postoperativen Demonstration von Verletzungen und frühen postoperativen Pflege Techniken werden demonstriert. Beide Modelle führen zu reproduzierbaren Verletzungen, Hämatome Volumen und Neuropsychologische Defizite. Aufgrund der Heterogenität der menschlichen ICH werden mehrere präklinischen Modellen benötigt, um gründlich zu erforschen pathophysiologischen Mechanismen und Testen potentieller therapeutischer Strategien.

Einleitung

Intrazerebrale Blutung (ICH) ist eine relativ häufige Form von zerebrovaskulären Erkrankungen mit etwa 40-50% der betroffenen Patienten sterben innerhalb von 30 Tagen ^ein. Leider hat sich wenig Verbesserung der Sterblichkeit in den letzten 20 Jahre ² gemacht. Berichte aus den National Institutes of Health ³ und Richtlinien der American Heart Association ⁴ betont die Bedeutung der Entwicklung klinisch relevanten Modelle von ICH, das Verständnis der Pathophysiologie zu erweitern und zu entwickeln, Ziele für neue therapeutische Ansätze.

Einige Modelle gibt es für die menschliche ICH ⁵ imitieren. Wie Verständnis der Pathophysiologie ICH reift, hat es sich gezeigt, dass eine Vielzahl von Modellen verwendet werden, um verschiedene Aspekte der Krankheit zu untersuchen. Früher verwendete Modelle sind murine Amyloid-Angiopathie ^6, intraparenchymal Mikroballon Einsetzen und Inflation ⁷ und direkten arteriellen BlutInfiltration ^8,9. Lobäre Blutung aus Amyloid-Angiopathie ist mit der Verwendung von transgenen Mäusen, modelliert und stellt einen deutlichen ICH-Subtyp. Mikroballonmodelle imitieren akuten Massenwirkung von Hämatombildung, aber nicht zu zellulären Reaktion des Gehirns auf die Anwesenheit von Blut zu erfassen. Schließlich unterzieht direkten arteriellen Blut Infiltration des Gehirns, um den arteriellen Druck der Oberschenkelarterie. So ist dieses Modell imitiert arteriellen Druck und die Anwesenheit von Blut, aber nicht das Gehirn unterziehen, um mikrovaskulären Schädigung von kleinen Blutgefäß Bruch. Weiterhin hat dieses Modell inhärent hohe Variabilität. Interessant ist, spontan hypertensiven Ratten ¹⁰ entwickeln spontane ICH wie sie altern. Untersuchung dieser Tiere nach ICH-Entwicklung kann die Krankheit in Gegenwart eines der Hauptbegleiterkrankungen prädisponiert Menschen ICH imitieren. Während diese anderen Modelle gibt, intrastriatalen Injektion von Clostridien-Kollagenase ¹¹ oder instrastiatal Injektion einutologous Vollblut ¹² sind derzeit in der präklinischen Forschung ICH die beiden häufigsten Modelle.

ICH Modellauswahl auf Basis der Ziel der experimentellen Frage, einschließlich Artenwahl und Art der Hämatombildung induziert werden. Zum Beispiel Schweine sind große Tiere mit relativ großen Volumen der weißen Substanz des Gehirns im Vergleich zu Mäusen. So sind Schweine Modelle geeignet, um der weißen Substanz Pathophysiologie folgende ICH studieren. Im Gegensatz dazu sind Nagetier Gehirn weitgehend grauen Substanz, aber transgene Systeme machen Nager nützlich, um die molekularen Mechanismen der Schädigung und Erholung nach ICH beurteilen. Jedes Modell hat seine eigenen Stärken und Schwächen (Tabelle 1), die vor dem Experiment sorgfältig betrachtet werden sollten.

Die folgenden Protokolle zeigen die Eigenblutinjektion und Collagenase-Modellen bei Mäusen. Diese Modelle haben jeweils von Modelle, die ursprünglich bei Ratten entwickelt übersetzt^13,14 und erlauben die Verwendung von transgenen Technologie weit verbreitet, um die molekularen Mechanismen mit Zelltod nach ICH verbunden zu erkunden. Beide stellen deutlich verschiedene Verletzungsmechanismen von menschlichen ICH, und beide haben deutlich unterschiedliche erwartete Ergebnis in Bezug auf Verhaltens-und histologische Maßnahmen. So sind bestimmte Hypothesen können sich auf ein Modell, über den anderen zu leihen, aber viele Ideen kann die Validierung in beiden Modellen erfordern.

Tabelle 1. Vergleich der Eigenschaften von Kollagenase-und Eigenblutinjektion Hirnblutung Modelle.

	Collagenase-Injection	Blutinjektion
Benutzerfreundlichkeit	+ + +	+ +
Reproduzierbarkeit	+ +	+ +
Kontrolle der Blutung Größe	+ +	+ + +
Blut Reflux	+	+ +
Simuliert Human Disease	+	-
Einfachheit	+ +	+ +
Verwendung in mehreren Arten	+ +	+ +

Protokoll

Ethikerklärung: Dieses Protokoll wurde von der Duke University Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss gebilligt wurde und folgt alle Richtlinien für die ethische Nutzung von Tieren.

1. Vorbereitung der Ausrüstung

1. Autoklaven werden die Operationswerkzeuge vor der Operation.
2. Desinfizieren Sie die stereotaktische Apparat mit 70% Ethanol.
3. Schalten Sie Wasserbad und halten die Wassertemperatur bei 42 ° C
4. Auflösen Typ IV-S Clostridien Kollagenase in physiologischer Kochsalzlösung in einer Konzentration von 0,075 U pro 0,4 &mgr;.

2. Collagenase Injection Modell

1. Wiegen Sie die Maus.
2. Anesthetize die Maus in eine Induktionskammer mit 5% Isofluran in 30% O _2/70% N _2. Adäquate Anästhesie ist nach ca. 2 min, wenn die Maus Atmung haben, 1 pro Sekunde verlangsamt signalisiert.
3. Intubate die Luftröhre mit einem 30 mm 20 G intravenösen Katheter.
4. Verbinden Sie den Katheter einNagetier Ventilator und mechanisch lüften die Lunge mit 1,6% Isofluran in 30% O _2/70% N ₂ bei einer Rate von 105 Atemzügen pro Minute mit einem Tidalvolumen von 0,75 ml ^..
5. Rasieren Sie die Kopfhaut mit einem elektronischen Rasierer. Sobald die Maus anästhesiert und intubiert, verschieben Sie es an einem anderen Arbeitsplatz für die Rasur und kehrte in die chirurgische Bank dann.
6. Sichern Sie den Kopf in einem stereotaktischen Rahmen, und ebnen den Kopf mit beiden koronalen und Pfeilnaht als Referenzpunkte.
7. Bewerben Augensalbe auf die Augen.
8. Legen Sie eine rektale Temperatursonde. Aufrechterhaltung Rektaltemperatur bei 37,0 ± 0,2 º C unter Verwendung eines zirkulierenden Wasserbettboden.
9. Wischen den Operationsbereich mit Betadin, gefolgt mit 70% Ethanol und 3-mal wiederholen.
10. Machen Sie eine 1 cm Mittellinie Kopfhauteinschnitt und wischen Knochenhaut seitlich mit einem sterilen Wattestäbchen zu Bregma aussetzen.
11. Drill 1 mm Durchmesser Bohrloch 2,2 mm links latBundes mit einem wassergekühlten Bohrer Bregma.
12. Drehen Kollagenase Fläschchen 5-mal, dann waschen eine 0,5 ul Spritze mit 25 G-Nadel (zum stereotaktischen Rahmen befestigt) mit 0,5 ul Collagenase-Lösung 5 mal Pinnwand (0,5 ul der Collagenase-Lösung in der Spritze nach dem letzten Waschgang).
13. Richten Nadelspitze mit Bohrloch dann vertreiben 0,1 ul aus Spritze und Nadel wischen Kegel mit gestochen zu verwerfen.
14. Mit einem Mikromanipulator, vorab die Nadel 3 mm tief, um Rinde und lassen für 30 Sekunden regungslos.
15. Inject 0,4 ul über 90 sek.
16. Verringern Isofluran auf 1% und lassen Nadel bewegungslos für 5 min.
17. Ziehen Nadel langsam.
18. Wenden 1-2 Tropfen 0,25% Bupivacain subkutan und Naht der Haut.
19. Schalten Sie Isofluran-Verdampfer und Maus zu entfernen aus der stereotaktischen Rahmen.
20. Lassen Sie Maus, um Spontanatmung mit anschließender Luftröhren Extubation erholen.
21. Zurück Maus an einen sauberen Käfig und ermöglichen den freien Zugang zuNahrung und Wasser.

3. Eigenblut Injection Modell

1. Führen Sie die Schritte 2,1-2,11 für die Kollagenase Injektion Modell.
2. Draw 50 ul sterilem normaler Kochsalzlösung in eine 30 G 50 ul Spritze.
3. Verbinden Sie den Mikroliter-Spritze mit einer 70 cm PE10 Rohr.
4. Vertreibt alle normalen Kochsalzlösung aus Mikroliter-Spritze in PE10 Rohr komplett de-Luftschlauch.
5. Ziehen Sie den Mikroliterspritze Kolbens aus 1 mm, um eine Luftblase an der distalen Öffnung des röhren PE10 Mikroliterspritze Vorrichtung zu machen Gemisch aus Kochsalzlösung und Blut im späteren Verfahren zu vermeiden.
6. Wischen Sie den distalen Schwanzarterie zentralen Region des Maus mit 70% Ethanol, und schneiden Sie die Arterie mit einer Rasierklinge in 0,5 bis 1 cm auf die Schwanzspitze.
7. Sammeln Sie 40 ul Blut aus dem Schwanz in die PE10 Rohr-Mikroliterspritze Gerät geschnitten. Hinweis: das Heparin nicht in der Nadel, Schläuche oder Maus.
8. Befestigen Sie den Mikroliterspritze auf die injection Pumpe.
9. Verbinden der Metallkanüle Teil einer 27 G-Nadel auf das Ende der Röhre PE10 und sichern die Nadel in einem Mikromanipulator auf dem stereotaktischen Rahmen.
10. Vertreibt 2 ul Blut von 27 G-Nadel und wischen Nadel Kegel mit gestochen zu verwerfen.
11. Richten Nadelspitze mit Bohrloch und Nadel 3 mm tief, um Kortex.
12. Spritzen Sie 35 ul der autologen Blut mit einer Rate von 2 ul pro min.
13. Verringern Isofluran auf 1% und lassen Nadel bewegungslos für 10 min.
14. Ziehen Nadel über 30 sek.
15. Wenden 1-2 Tropfen 0,25% Bupivacain subkutan und Naht der Haut.
16. Schalten Sie Isofluran-Verdampfer und Maus zu entfernen aus der stereotaktischen Rahmen.
17. Lassen Sie Maus, um Spontanatmung mit anschließender Extubation erholen.
18. Zurück Maus an einen sauberen Käfig und lassen Sie freien Zugang zu Futter und Wasser.

4. Sham Betrieb

1. Führen Sie die gleichen Verfahren für die Kollagenase injection-Modell, jedoch ohne Injektion nach Nadeleinführung.

5. Post-Chirurgie Pflege

1. Injizieren von 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung subkutan in den Abend des chirurgischen Eingriffs an der Rückseite des Halses des Tieres.
2. Geben enthärtetem Wasser und Nahrung mit Gel-Essen in kleinen Plastikbecher auf dem Boden des Käfigs platziert. Ersetzen Sie das Essen täglich für 7 Tage.
3. Überprüfen Sie für die Gewichtsabnahme, Wundheilung, und Anzeichen von Unbehagen täglich für 7 Tage.
4. Wenn Erholungsintervalle von mehr als 7 Tage erforderlich sind, können Nahtentfernung unter Licht inhaliert Anästhesie (ca. 1% Isofluran in 30% O _2/70% N ₂₎ durchgeführt werden, falls erforderlich.

Ergebnisse

Aufgrund der Unterschiede in Hämatombildung (Abbildung 1), wird ipsilateral Wende sofort nach dem Aufwachen für Eigenblut injizierten Mäusen gezeigt und innerhalb von 2 - 4 Stunden nach der Kollagenase-Injektion, wie Hämatome Expansion auftritt (Abbildung 2). Fehlen ipsilateralen Wende sollte Sorge um Abwesenheit von erheblichen Verletzungen erhöhen. Am ersten Tag nach der Verletzung sollte Mäuse in beiden Modellen erhebliche neurologische Defizite (Abbildung 3) z...

Diskussion

Trotz Schwellen präklinischen Forschung und der daraus resultierenden großen klinischen Studien für vielversprechende Therapeutika ^15-18, es gibt keine pharmakologischen Interventionen gezeigt, dass Ergebnis in ICH verbessern und Pflege bleibt weitgehend unterstützend. Listen von möglichen Therapien können durch Hochdurchsatz-Technologien, wie Transkriptom-und Proteom-Arbeit erzeugt werden. Während diese Technologien weiter, unser Wissen über mögliche therapeutische Ziele voranzubringen, vorwärts un...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic frame	Stoelting Co.	51603
Probe holder with corner clamp	Stoelting Co.	51631
Mini grinder	Power Glide	Model 60100002
0.5 μl syringe	Microliter	86259	25 G needle
5 μl syringe	Microliter	7637-01
30 G microliter syringe	Microliter	7762-03
Syringe pump	KD Scientific	Model 100
Heat therapy water pump	Gaymar Industries, Inc.	Model# TP650
Circulating waterbed	CMS Tool & Die, Inc.
Rodent ventilator	Harvard Apparatus	Model 683
Isoflurane vaporizer	Drager	Vapor 19.1
Air flowmeter	Cole Parmer	Model PMR1-010295
Induction chamber			Self made
Otoscope	Welch Allyn	22820
Intravenous catheter	Becton-Dickinson	381534	20 G, 1.16 inch Insyte-W
Isoflurane	Baxter Healthcare Corporation	NDC10019-360-69
Collagenase Type IV-S	Sigma	C1889
Polyethylene tubing PE10	Becton-Dickinson	427401
27 G 1 1/4 inch needle	Becton-Dickinson	305136
Surgical scissors	Miltex	21-539
Forceps	Miltex	17-307
Needle holder	Boboz	RS-7840
Monofilament suture	Ethicon	8698	Size 5-0
Indicating controller	YSI	73ATD