Injection intrastriatale de sang autologue ou Clostridium collagénase comme modèles murins de Hémorragie intracérébrale

Résumé

Preclinical models of intracerebral hemorrhage are utilized to mimic certain aspects of clinical disease. Thus, mechanisms of injury and potential therapeutic strategies may be explored. In this protocol, two models of intracerebral hemorrhage are described, intrastriatal (basal ganglia) injections of autologous blood or collagenase.

Résumé

L'hémorragie intracérébrale (HIC) est une forme commune de la maladie cérébro-vasculaire et est associée à une morbidité et une mortalité importantes. L'absence de traitement efficace et l'échec des grands essais cliniques visant à l'hémostase et élimination des caillots de démontrer la nécessité d'une enquête plus approfondie de mécanisme mécanique de l'ICH. Cette recherche peut être effectuée par l'intermédiaire du cadre prévu par les modèles précliniques. Deux modèles murins dans l'usage populaire comprennent intrastriatale (ganglions de la base) injection de sang total autologue ou collagénase de Clostridium. Depuis, chaque modèle représente nettement différentes caractéristiques physiopathologiques liés au patrimoine culturel immatériel, l'utilisation d'un modèle particulier peut être choisi en fonction de ce que l'aspect de la maladie est à l'étude. Par exemple, l'injection de sang autologue représente le plus fidèlement la réponse du cerveau à la présence de sang intraparenchymateuse, et peut reproduire le plus étroitement lobaire hémorragie. Injection de collagénase de Clostridium représente plus de précision les srupture de la cuve du centre commercial et hématome évolution caractéristique des hémorragies profondes. Ainsi, chaque modèle provoque la formation d'un hématome différente, la réponse neuro-inflammatoire, le développement de l'oedème cérébral, et les résultats neurocomportementaux. Robustesse d'une intervention thérapeutique présumé peut être mieux évaluée en utilisant les deux modèles. Dans ce protocole, l'induction de l'ICH en utilisant les deux modèles, immédiate démonstration post-opératoire de blessures, et des techniques de soins post-opératoires précoces sont démontrées. Les deux modèles se traduisent par des blessures reproductibles, les volumes d'hématome, et les déficits neurocomportementaux. En raison de l'hétérogénéité de l'ICH humaine, plusieurs modèles précliniques sont nécessaires pour explorer à fond les mécanismes physiopathologiques et tester des stratégies thérapeutiques potentielles.

Introduction

L'hémorragie intracérébrale (HIC) est une forme relativement fréquente de la maladie cérébro-vasculaire à environ 40-50% des patients atteints de mourir dans les 30 jours ^1. Malheureusement, peu de progrès ont été réalisés dans le taux de mortalité au cours des 20 dernières années ^2. Rapports des Instituts nationaux de la santé ³ et les lignes directrices de l'American Heart Association ⁴ ont souligné l'importance de développer des modèles cliniquement pertinentes du PCI pour étendre la compréhension de la physiopathologie et de développer des cibles pour de nouvelles approches thérapeutiques.

Plusieurs modèles existent pour simuler ICH humaine ^5. Que la compréhension de la physiopathologie de l'ICH mûrit, il est devenu évident qu'une variété de modèles peut être utilisé pour examiner les différents aspects de la maladie. Modèles utilisés précédemment comprennent murin angiopathie amyloïde ^6, insertion de microballon intraparenchymateuse et l'inflation ^7, et le sang artériel directeinfiltration ^8,9. Lobaire hémorragie de l'angiopathie amyloïde a été modélisé à l'utilisation de souris transgéniques et représente un sous-type distinct ICH. modèles de microballon imitent l'effet de masse aigu de la formation d'un hématome mais ne parviennent pas à capturer la réponse cellulaire du cerveau à la présence de sang. Enfin, l'infiltration directe de sang artériel soumet le cerveau à partir de la pression artérielle de l'artère fémorale. Ainsi, ce modèle imite les pressions artérielles et la présence de sang, mais ne pas soumettre le produit à une lésion cérébrale microvasculaire de petite rupture de vaisseau sanguin. En outre, ce modèle a intrinsèquement une forte variabilité. Fait intéressant, des rats spontanément hypertendus ¹⁰ développent ICH spontanée à mesure qu'ils vieillissent. L'étude de ces animaux après le développement ICH peut imiter la maladie, en présence de l'un des principaux co-morbidités qui prédisposent l'homme à l'ICH. Bien que ces autres modèles existent, injection intrastriatale de la collagénase de Clostridium ¹¹ ou par injection d'un instrastiatalsang total utologous ¹² sont, actuellement, les deux modèles les plus courants utilisés dans la recherche préclinique de l'ICH.

Sélection du modèle PCI doit être faite sur la base de l'objectif de la question expérimentale, y compris la sélection des espèces et de la méthode d'induire la formation d'un hématome. Par exemple, les porcs sont de grands animaux avec des volumes relativement importants de la substance blanche du cerveau par rapport à des souris. Ainsi, les modèles porcins sont adaptées pour étudier la matière blanche physiopathologie suivante ICH. En revanche, les cerveaux de rongeurs sont largement matière grise, mais les systèmes transgéniques font rongeurs utile pour évaluer les mécanismes moléculaires des lésions et la récupération après l'ICH. Chaque modèle a ses forces et ses faiblesses (tableau 1) inhérents, qui devrait être examinée avec soin avant l'expérimentation.

Les protocoles suivants mettent en évidence les modèles de sang et d'injection de collagénase autologues chez la souris. Ces modèles ont chacun été traduits à partir de modèles développés à l'origine chez les rats^13,14 et permettre l'utilisation de la technologie transgénique largement disponibles pour explorer les mécanismes moléculaires associés à la mort cellulaire après ICH. Représentent tous les deux très différents mécanismes de blessure de l'ICH humaine, et les deux ont résultat attendu nettement différente en termes de mesures comportementales et histologiques. Ainsi, certaines hypothèses peuvent se prêter à un modèle sur l'autre, mais de nombreuses idées peuvent être validés dans les deux modèles.

Tableau 1. Comparaison des caractéristiques de la collagénase et modèles autologues hémorragie intracérébrale d'injection de sang.

	Collagénase injection	Injection de sang
Facilité d'utilisation	+ + +	+ +
Reproductibilité	+ +	+ +
Contrôle de l'hémorragie Taille	+ +	+ + +
Le reflux du sang	+	+ +
Simule maladies humaines	+	-
Simplicité	+ +	+ +
Utilisez des espèces multiples	+ +	+ +

Protocole

Déclaration éthique: Ce protocole a été approuvé par le Comité de l'Université Duke institutionnel de protection et d'utilisation des animaux et suit toutes les directives pour l'utilisation éthique des animaux.

Une. Préparation de l'équipement

1. Autoclave les instruments chirurgicaux avant la chirurgie.
2. Désinfecter l'appareil stéréotaxique avec 70% d'éthanol.
3. Mettez bain d'eau et maintenir la température de l'eau à 42 ° C.
4. Dissoudre de type IV-S collagénase de Clostridium dans une solution saline normale à une concentration de 0,075 U par 0,4 ul.

2. Collagénase Injection Modèle

1. Peser la souris.
2. Anesthésier la souris dans une chambre d'induction avec 5% d'isoflurane dans de 30% O ₂ / N ₂ à 70%. Anesthésie adéquate est signalée après environ 2 min quand la respiration de souris ont ralenti à 1 par seconde.
3. Intuber la trachée avec un G cathéter intraveineux 30 mm 20.
4. Branchez le cathéter à unrongeur ventilateur et ventiler mécaniquement les poumons avec 1,6% d'isoflurane dans 30% O _2/70% N ₂ à un taux de 105 respirations par minute avec un volume courant fourni de 0,75 ml ^..
5. Raser le cuir chevelu avec un rasoir électronique. Une fois que la souris est anesthésiée et intubé, le déplacer vers un poste de travail différent pour le rasage et est ensuite retourné sur le banc chirurgicale.
6. Fixer la tête dans un cadre stéréotaxique, et le niveau de la tête avec suture coronale et sagittale deux points de référence.
7. Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux.
8. Insérez une sonde de température rectale. Maintenir la température rectale à 37,0 ± 0,2 ° C en utilisant un soubassement matelas d'eau en circulation.
9. Essuyez la zone chirurgicale avec de la bétadine suivi avec 70% d'éthanol et répéter 3 fois.
10. Faire une incision du cuir chevelu 1 cm de la ligne médiane et essuyez périoste latéralement avec un coton-tige stérile pour exposer bregma.
11. Drill 1 mm de diamètre trou de trépan de 2,2 mm à gauche latERALES à bregma avec une perceuse refroidi à l'eau.
12. Tournez la collagénase flacon 5 fois, puis lavez une seringue de 0,5 pi avec 25 aiguille G (attaché au cadre stéréotaxique) avec 0,5 solution de collagénase pi 5 fois (Laissez 0,5 pi de solution de collagénase dans la seringue après le dernier lavage).
13. Alignez pointe de l'aiguille avec trou de trépan, puis expulser 0,1 pi de la seringue et l'aiguille de biseau essuyer avec un rasoir à jeter.
14. L'utilisation d'un micromanipulateur, avancer l'aiguille 3 mm de profondeur de cortex et laisser immobile pendant 30 secondes.
15. Injecter 0,4 pi plus de 90 sec.
16. Diminuer l'isoflurane à 1% et de laisser l'aiguille immobile pendant 5 min.
17. Retirer l'aiguille lentement.
18. Appliquer les 1 - 2 gouttes de bupivacaïne à 0,25% sous-cutanée et suturer la peau.
19. Désactiver l'isoflurane vaporisateur et enlever la souris du cadre stéréotaxique.
20. Laissez la souris pour récupérer la ventilation spontanée avec trachéale ultérieure extubation.
21. Retour à la souris une cage propre et permettre le libre accès ànourriture et d'eau.

3. Injection de sang autologue modèle

1. Suivez les étapes 2.1 à 2.11 pour le modèle d'injection de collagénase.
2. Dessinez 50 ul de solution saline normale stérile dans une seringue de 30 pi G 50.
3. Connectez la seringue microlitre avec un tube PE10 70 cm.
4. Expulser toute la solution saline normale de microlitre seringue dans PE10 tube de tube complètement hors d'air.
5. Tirer la seringue piston microlitres à 1 mm pour faire une bulle d'air à l'ouverture distale de l'appareil de la seringue tube microlitre PE10 pour éviter le mélange de solution saline et de sang au cours des procédures ultérieures.
6. Essuyez la région de l'artère de la queue centrale distale de la souris avec 70% d'éthanol, et couper l'artère avec un rasoir de 0,5 à 1 cm à l'extrémité de la queue.
7. Recueillir 40 pi de sang de la queue coupée dans le dispositif de seringue microlitre tube PE10. Remarque: l'héparine qui n'est pas utilisé dans l'aiguille, le tube, ou une souris.
8. Fixer la seringue microlitre sur la Injepompe ction.
9. Connectez la partie de canule métallique d'une aiguille 27 G à l'extrémité du tube PE10, et fixer l'aiguille à un micromanipulateur sur le cadre stéréotaxique.
10. Expulser 2 pl de sang sur 27 aiguille G et essuyez aiguille biseau avec un rasoir à jeter.
11. Alignez pointe de l'aiguille avec trou de trépan et insérer l'aiguille 3 mm de profondeur pour cortex.
12. Injecter 35 ul de sang autologue à un débit de 2 pi par minute.
13. Diminuer l'isoflurane à 1% et de laisser l'aiguille immobile pendant 10 min.
14. Retirer l'aiguille en 30 sec.
15. Appliquer les 1 - 2 gouttes de bupivacaïne à 0,25% sous-cutanée et suturer la peau.
16. Désactiver l'isoflurane vaporisateur et enlever la souris du cadre stéréotaxique.
17. Laissez la souris pour récupérer la ventilation spontanée avec extubation ultérieure.
18. Retour à la souris une cage propre et permettre l'accès libre à la nourriture et de l'eau.

4. Opération Sham

1. Suivez les mêmes procédures pour la collagénase à injectern modèle, à l'exception sans injection après l'insertion de l'aiguille.

5. Soins post-chirurgie

1. Injecter 0,5 ml de solution saline normale voie sous-cutanée dans la soirée de l'intervention chirurgicale à l'arrière du cou de l'animal.
2. Fournir de la nourriture ramolli avec de l'eau et de la nourriture de gel dans de petites tasses en plastique placés sur le plancher de la cage. Remplacer la nourriture par jour pendant 7 jours.
3. Vérifiez la perte de poids, la cicatrisation, et des signes d'inconfort par jour pendant 7 jours.
4. Si les intervalles de récupération de plus de 7 jours sont nécessaires, l'enlèvement de fil de suture peut être réalisée sous anesthésie légère par inhalation (environ 1% d'isoflurane dans de 30% O ₂ / N ₂ à 70%), si nécessaire.

Résultats

En raison des différences dans la formation d'un hématome (figure 1), tournant ipsilatéral est affiché immédiatement après le réveil pour les souris injectées de sang autologue et moins de 2 - 4 heures après l'injection de collagénase, comme l'expansion de l'hématome se produit (figure 2). Absence de rotation ipsilatérale devrait soulever des inquiétudes pour absence de préjudice important. Le premier jour après des blessures, des souris dans les deux mod?...

Discussion

Malgré la nouvelle recherche préclinique et grands essais cliniques qui en résultent pour la thérapeutique prometteuse ^15-18, il n'y a pas d'interventions pharmacologiques démontrées pour améliorer les résultats dans le PCI, et les soins reste largement favorable. Listes des thérapies possibles peuvent être générées par les technologies à haut débit, tels que le travail transcriptomique et protéomique. Bien que ces technologies continuent à progresser notre connaissance des cibles th?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic frame	Stoelting Co.	51603
Probe holder with corner clamp	Stoelting Co.	51631
Mini grinder	Power Glide	Model 60100002
0.5 μl syringe	Microliter	86259	25 G needle
5 μl syringe	Microliter	7637-01
30 G microliter syringe	Microliter	7762-03
Syringe pump	KD Scientific	Model 100
Heat therapy water pump	Gaymar Industries, Inc.	Model# TP650
Circulating waterbed	CMS Tool & Die, Inc.
Rodent ventilator	Harvard Apparatus	Model 683
Isoflurane vaporizer	Drager	Vapor 19.1
Air flowmeter	Cole Parmer	Model PMR1-010295
Induction chamber			Self made
Otoscope	Welch Allyn	22820
Intravenous catheter	Becton-Dickinson	381534	20 G, 1.16 inch Insyte-W
Isoflurane	Baxter Healthcare Corporation	NDC10019-360-69
Collagenase Type IV-S	Sigma	C1889
Polyethylene tubing PE10	Becton-Dickinson	427401
27 G 1 1/4 inch needle	Becton-Dickinson	305136
Surgical scissors	Miltex	21-539
Forceps	Miltex	17-307
Needle holder	Boboz	RS-7840
Monofilament suture	Ethicon	8698	Size 5-0
Indicating controller	YSI	73ATD