Intrastriatal Инъекция аутологичной крови или клостридиальной коллагеназы как мышиный Модели внутримозгового кровоизлияния

Резюме

Preclinical models of intracerebral hemorrhage are utilized to mimic certain aspects of clinical disease. Thus, mechanisms of injury and potential therapeutic strategies may be explored. In this protocol, two models of intracerebral hemorrhage are described, intrastriatal (basal ganglia) injections of autologous blood or collagenase.

Аннотация

Внутримозгового кровоизлияния (ICH) является распространенной формой болезни сосудов головного мозга и связано с высокой заболеваемостью и смертностью. Отсутствие эффективного лечения и отказа крупных клинических испытаний, направленных на гемостаза и удаления сгустка продемонстрировать необходимость дальнейшего механизма по инициативе расследования НКН. Это исследование может быть выполнено через рамках, предусмотренных доклинических моделях. Два мышиные модели в популярной использования, включают intrastriatal (базальные ганглии) инъекции либо аутологичных цельной крови или клостридий коллагеназы. Так, каждая модель представляет отчетливо различные патофизиологические особенности, связанные с ICH, использование конкретной модели может быть выбрана на основе какой аспект заболевания должны быть изучены. Например, аутологичных инъекции крови наиболее точно представляет реакцию мозга на наличие интрапаренхимальные крови, и может наиболее точно воспроизвести долевой кровоизлияния. Clostridial инъекции коллагеназы наиболее точно представляет секРазрыв центр судно и гематома эволюция характерна глубоких кровоизлияний. Таким образом, каждая модель приводит к различным образованием гематомы, нейровоспалительных ответ, развития отека мозга и нейроповеденческих результатов. Устойчивость предполагаемого терапевтического вмешательства может быть лучше всего оценивать с помощью обеих моделей. В этом протоколе, индукция ICH, используя обе модели, немедленное послеоперационное демонстрацию травмы и ранние методы послеоперационного ухода демонстрируются. Обе модели приводят к воспроизводимых травм, объемы гематома, и нейроповеденческих дефицита. Из-за разнородности человеческого ICH, несколько доклинические модели необходимы тщательно изучить патофизиологические механизмы и тестирования потенциальных терапевтических стратегий.

Введение

Внутримозгового кровоизлияния (ICH) является относительно распространенной формой болезни сосудов головного мозга с примерно 40-50% пострадавших пациентов умирает в течение 30 дней ^1. К сожалению, небольшое улучшение было сделано в смертности за последние 20 лет ^2. Сообщения из Национальных Институтов Здоровья ³ и руководящих принципов от Американской ассоциации сердца ⁴ подчеркнул важность развития клинически значимых моделей ICH расширить понимание патофизиологии и разработать для новых терапевтических подходов.

Несколько моделей существуют, чтобы имитировать человеческий НКН ^5. Как понимание ICH патофизиологии созревает, стало очевидно, что целый ряд моделей может быть использован для изучения различных аспектов заболевания. Ранее используемые модели включают мышиный амилоида ангиопатия ^6, интрапаренхимальные вставки микросферы и инфляции ^7, а также прямой артериальной кровиинфильтрация ^8,9. Лобар кровотечение из амилоидной ангиопатии была смоделирована с использованием трансгенных мышей и представляет собой отличный ICH подтип. Модели микросферы имитировать острую массовую силу с образованием гематомы, но не в состоянии захватить клеточный ответ мозга на наличие крови. Наконец, прямая инфильтрация артериальное подвергает мозг артерий давлениях от бедренной артерии. Таким образом, эта модель имитирует артериальное давление и наличие крови, но не подвергать мозг микрососудов травмы от небольшого разрыва кровеносного сосуда. Кроме того, эта модель имеет по своей сути высокую изменчивость. Интересно, что крыс со спонтанной гипертензией ¹⁰ развивается спонтанная НКН, поскольку они стареют. Изучение этих животных после развития ICH может имитировать болезнь в присутствии одного из основных сопутствующих заболеваний, предрасполагающих людей к ICH. В то время как эти другие модели существуют, intrastriatal инъекция клостридиальной коллагеназы ¹¹ или instrastiatal инъекцииutologous цельной крови ¹² являются, в настоящее время, два наиболее распространенных моделей используется в доклинических исследований ICH.

ICH выбор модели должны быть сделаны на основе объективного экспериментального вопрос, в том числе выбора видов и способа вызывать образование гематомы. Например, свиньи крупных животных с относительно большими объемами белого вещества мозга по сравнению с мышами. Таким образом, свинина модели подходят для исследования белого вещества патофизиологии следующие ICH. В отличие от этого, мозг грызунов в основном серое вещество, но трансгенные системы делают грызуны полезно оценить молекулярные механизмы повреждения и восстановления после ICH. Каждая модель имеет свои, присущие сильные и слабые стороны (табл. 1), которые должны быть тщательно продуманы до эксперимента.

Следующие протоколы продемонстрировать аутологичных крови и инъекций коллагеназы модели у мышей. Эти модели друг был переведен с моделей, первоначально разработанных для крыс^13,14 и позволяют использовать широко доступны трансгенной технологии для изучения молекулярных механизмов, связанных с клеточной гибели после ICH. Оба представляют совершенно разные механизмы травмы от человека ICH, и оба имеют совершенно разные ожидаемого результата в плане поведенческих и гистологических мер. Таким образом, некоторые гипотезы могут поддаются одной модели над другой, но многие идеи может потребовать проверки в обеих моделях.

Таблица 1. Сравнение характеристик коллагеназы-и аутологичных инъекций крови внутримозговых моделей кровоизлияния.

	Коллагеназа впрыска	Кровь впрыска
Простота в использовании	+ + +	+ +
Воспроизводимость	+ +	+ +
Контроль Кровоизлияние Размер	+ +	+ + +
Кровь рефлюкс	+	+ +
Имитация болезни человека	+	-
Простота	+ +	+ +
Использование в несколько видов	+ +	+ +

протокол

Заявление по этике: Этот протокол был одобрен Комитетом по Университет Дьюка Институциональная уходу и использованию животных в и выполняет все руководящие принципы для этического использования животных.

1. Подготовка оборудования

1. Автоклав хирургические инструменты до операции.
2. Лечить стереотаксической аппарат с 70% этанола.
3. Включите водяной бане и держать температуру воды при 42 ° С
4. Растворить Type IV-S клостридий коллагеназы в нормальном физиологическом растворе в концентрации 0,075 U на 0,4 мкл.

2. Коллагеназы впрыска Модель

1. Взвесьте мыши.
2. Обезболить мышь в индукционной камере с 5% изофлуран в 30% O _2/70% N _2. Адекватная анестезия сигнал примерно через 2 мин, когда дыхания мыши замедлился до 1 в секунду.
3. Интубировать трахею с 30 мм 20 G внутривенного катетера.
4. Подключите катетергрызун вентилятор и механически вентиляции легких с 1,6% изофлуран в 30% O _2/70% N ₂ при скорости 105 вдохов в минуту с передаваемой дыхательным объемом 0,75 мл ^..
5. Бритье головы с электронным бритвы. Как только мышь под наркозом и интубации, переместить его в другую рабочую станцию ​​для бритья, а затем вернулся к хирургическому скамейке.
6. Закрепите голову в стереотаксической рамки, и выравнивания положения головы с обоими корональной и сагиттальной шва в качестве опорных точек.
7. Применить глазной мази для глаз.
8. Вставьте ректальное датчик температуры. Поддерживать ректальной температуры в 37,0 ± 0,2 ° С с использованием днище циркулирующей водяная кровать.
9. Протрите хирургическое площадь бетадином затем с 70% этанола и повторите 3 раза.
10. Сделайте 1 см по средней линии головы разрез и протрите надкостницы боков со стерильным ватным аппликатором, чтобы разоблачить брегмы.
11. Упражнение 1 мм Диаметр заусенцев отверстие 2,2 мм слева латEral брегмы дрелью с водяным охлаждением.
12. Поверните коллагеназы флакон 5 раз, затем промыть 0,5 мкл шприц с 25 G иглы (прилагается к стереотаксической рамы) с 0,5 мкл раствора коллагеназы 5 раз (Оставьте 0,5 мкл раствора коллагеназы в шприц после последней промывки).
13. Совместите кончик иглы с заусенцев отверстие затем изгнать 0,1 мкл из шприца и протрите иглы скос с бритвой, чтобы отменить.
14. Использование микроманипулятора, заранее глубоко, чтобы коры иглы 3 мм и оставить неподвижно в течение 30 сек.
15. Введите 0,4 мкл более 90 сек.
16. Уменьшение изофлуран до 1% и оставить иглы неподвижно в течение 5 мин.
17. Вывод иглу медленно.
18. Применить 1 - 2 капли 0,25% бупивакаина подкожно и сшивать кожу.
19. Выключите ИФ испаритель и удалить мышь от стереотаксической рамы.
20. Разрешить мышь, чтобы восстановить спонтанную вентиляцию с последующим экстубации трахеи.
21. Вернуться мышь на чистую клетку и обеспечить свободный доступ кпищи и воды.

3. Аутологичной крови впрыска Модель

1. Выполните шаги 2.1 - 2.11 для модели инъекции коллагеназы.
2. Draw 50 мкл стерильного физиологического солевого раствора в 30 G 50 мкл шприца.
3. Подключите мкл шприц с 70 см ПЭ10 трубы.
4. Выгнать всю физиологический раствор из микролитра шприца в ПЭ10 трубы, чтобы полностью де-воздух труб.
5. Извлеките поршень шприца мкл из 1 мм, чтобы сделать воздушный пузырь на дистальном открытия трубки микролитров шприца аппарата ПЭ10, чтобы избежать смесь физиологического раствора и крови в течение последующих процедур.
6. Протрите дистального центральный хвост регион артерии мыши с 70% этанола, и сократить артерию с бритвой от 0,5 до 1 см до кончика хвоста.
7. Соберите 40 мкл крови из хвоста врезался в трубу-микролитра шприца аппарата ПЭ10. Примечание: что гепарин не используется в иглы, труб или мыши.
8. Прикрепите мкл шприц на Injeводств насос.
9. Подключение металлическую часть канюли иглы 27 G в конце ПЭ10 трубы и закрепить иглу в микроманипулятора на стереотаксической рамы.
10. Выгнать 2 мкл крови из 27 G иглы и протрите иглы скос с бритвой, чтобы отменить.
11. Совместите кончик иглы с заусенцев отверстие и вставить глубокие, чтобы коры иглы 3 мм.
12. Введите 35 мкл аутологичной крови со скоростью 2 мкл в минуту.
13. Уменьшение изофлуран до 1% и оставить иглы неподвижно в течение 10 мин.
14. Вывод иглу в течение 30 сек.
15. Применить 1 - 2 капли 0,25% бупивакаина подкожно и сшивать кожу.
16. Выключите ИФ испаритель и удалить мышь от стереотаксической рамы.
17. Разрешить мышь, чтобы восстановить спонтанную вентиляцию с последующим экстубации.
18. Вернуться мышь на чистую клетку и обеспечить свободный доступ к пище и воде.

4. Шам Операция

1. Выполните те же процедуры для коллагеназы Injectioн модель, но без инъекции после введения иглы.

5. Послеоперационный уход

1. Введите 0,5 мл физиологического раствора подкожно вечером хирургической процедуры в задней части шеи животного.
2. Обеспечение умягченной пищу водой и гель пищи в маленьких пластмассовых чашках, размещенных на полу клетки. Замените еду в день в течение 7 дней.
3. Проверьте для потери веса, заживления ран и признаки дискомфорта в день в течение 7 дней.
4. Если интервалы восстановления из более чем 7 дней требуется, удаление шов может быть выполнен под легкой анестезией вдыхаемого (приблизительно 1% изофлуран в 30% O _2/70% Н _2), если это необходимо.

Результаты

Из-за различий в формировании гематомы (рис. 1), на той же стороне поворота показан сразу после пробуждения для аутологичных крови вводили мышам и в пределах 2 - 4 часа после инъекции коллагеназы, как расширение гематомы происходит (рис. 2). Отсутствие ипсилатеральном пов?...

Обсуждение

Несмотря возникающих доклинических исследований и результирующие большие клинические испытания для перспективных терапевтических средств ^15-18, нет фармакологических вмешательств продемонстрировали улучшить результат в ICH, и уход остается в значительной степени поддерживают. ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic frame	Stoelting Co.	51603
Probe holder with corner clamp	Stoelting Co.	51631
Mini grinder	Power Glide	Model 60100002
0.5 μl syringe	Microliter	86259	25 G needle
5 μl syringe	Microliter	7637-01
30 G microliter syringe	Microliter	7762-03
Syringe pump	KD Scientific	Model 100
Heat therapy water pump	Gaymar Industries, Inc.	Model# TP650
Circulating waterbed	CMS Tool & Die, Inc.
Rodent ventilator	Harvard Apparatus	Model 683
Isoflurane vaporizer	Drager	Vapor 19.1
Air flowmeter	Cole Parmer	Model PMR1-010295
Induction chamber			Self made
Otoscope	Welch Allyn	22820
Intravenous catheter	Becton-Dickinson	381534	20 G, 1.16 inch Insyte-W
Isoflurane	Baxter Healthcare Corporation	NDC10019-360-69
Collagenase Type IV-S	Sigma	C1889
Polyethylene tubing PE10	Becton-Dickinson	427401
27 G 1 1/4 inch needle	Becton-Dickinson	305136
Surgical scissors	Miltex	21-539
Forceps	Miltex	17-307
Needle holder	Boboz	RS-7840
Monofilament suture	Ethicon	8698	Size 5-0
Indicating controller	YSI	73ATD