Iniezione intrastriatali di sangue autologo o Clostridial Collagenase come modelli murini di emorragia intracerebrale

Riepilogo

Preclinical models of intracerebral hemorrhage are utilized to mimic certain aspects of clinical disease. Thus, mechanisms of injury and potential therapeutic strategies may be explored. In this protocol, two models of intracerebral hemorrhage are described, intrastriatal (basal ganglia) injections of autologous blood or collagenase.

Abstract

Emorragia intracerebrale (ICH) è una comune forma di malattia cerebrovascolare ed è associata a significativa morbidità e mortalità. La mancanza di un trattamento efficace e il fallimento di grandi studi clinici volti a emostasi e la rimozione di coaguli dimostrare la necessità di ulteriori indagini meccanismo-driven di ICH. Questa ricerca può essere effettuata attraverso il quadro fornito dai modelli preclinici. Due modelli murini in uso popolare includono intrastriatali (gangli basali) iniezione di entrambi sangue intero autologo o collagenasi clostridiale. Poiché, ogni modello rappresenta nettamente diverse caratteristiche fisiopatologiche relative a ICH, l'uso di un particolare modello può essere selezionato in base a ciò aspetto della malattia è da studiare. Ad esempio, l'iniezione di sangue autologo rappresenta più accuratamente la risposta del cervello alla presenza di sangue intraparenchimale, e può più strettamente replicare lobare emorragia. Clostridial iniezione di collagenasi rappresenta la maggior precisione le srottura del vaso centro commerciale ed ematoma evoluzione caratteristica emorragie profonde. Così, ogni modello si traduce in diversa formazione di ematomi, la risposta neuroinfiammatorie, sviluppo edema cerebrale, e gli esiti neurocomportamentali. La robustezza di un intervento terapeutico presunto può essere meglio valutata utilizzando entrambi i modelli. In questo protocollo, l'induzione di ICH utilizzare entrambi i modelli, immediata dimostrazione post-operatorio del pregiudizio e tecniche di cura post-operatorie precoci sono dimostrati. Entrambi i modelli provocare lesioni riproducibili, volumi ematoma, e deficit neurocomportamentali. A causa della eterogeneità dei ICH umana, sono necessari diversi modelli preclinici di esplorare a fondo i meccanismi fisiopatologici e testare potenziali strategie terapeutiche.

Introduzione

Emorragia intracerebrale (ICH) è una forma relativamente comune di malattia cerebrovascolare con circa il 40-50% dei pazienti colpiti muore entro 30 giorni ^1. Purtroppo, piccolo miglioramento è stato fatto nel tasso di mortalità negli ultimi 20 anni ^2. I rapporti del National Institutes of Health ³ e linee guida dell'American Heart Association ⁴ hanno sottolineato l'importanza di sviluppare modelli clinicamente rilevanti di ICH per estendere la comprensione della fisiopatologia e sviluppare obiettivi per nuovi approcci terapeutici.

Esistono diversi modelli di imitare ICH umano ^5. Come comprensione della fisiopatologia ICH matura, è diventato evidente che una varietà di modelli può essere utilizzato per esaminare i diversi aspetti della malattia. Modelli usati in precedenza includono murino angiopatia amiloide ^6, inserimento microballoon intraparenchimale e l'inflazione ^7, e il sangue arterioso direttoinfiltrazione ^8,9. Lobare emorragia da angiopatia amiloide è stato modellato con l'uso di topi transgenici e rappresenta un distinto ICH sottotipo. Modelli Microballoon imitano effetto massa acuta da ematoma ma non riescono a catturare risposta cellulare del cervello per la presenza di sangue. Infine, diretta infiltrazione di sangue arterioso sottopone il cervello a pressioni arteriose dalla arteria femorale. Così, questo modello imita la pressione arteriosa e la presenza di sangue, ma non sottoporre il cervello a danno microvascolare da piccola rottura del vaso sanguigno. Inoltre, questo modello ha intrinsecamente elevata variabilità. È interessante notare che i ratti spontaneamente ipertesi ¹⁰ si sviluppano spontaneamente ICH man mano che invecchiano. Studio di questi animali dopo sviluppo ICH può mimare la malattia in presenza di uno dei principali comorbidità predisponenti esseri umani di ICH. Mentre esistono questi altri modelli, iniezione intrastriatali di Clostridial collagenasi ¹¹ o iniezione instrastiatal di unsangue intero utologous ¹² sono, attualmente, i due modelli più comuni utilizzati nella ricerca preclinica ICH.

Selezione del modello ICH deve essere effettuata sulla base dell'obiettivo della questione sperimentale, compresa la selezione delle specie e metodo per indurre la formazione di ematomi. Ad esempio, i maiali sono animali di grandi dimensioni con volumi relativamente grandi bianca del cervello questione rispetto ai topi. Così, i modelli suina sono adatti per studiare la materia bianca fisiopatologia seguente ICH. Al contrario, il cervello di roditori sono materia grigia in gran parte, ma i sistemi transgenici fanno roditori utile per valutare i meccanismi molecolari di danno e di recupero dopo ICH. Ogni modello ha i suoi punti di forza intrinseci e di debolezza (Tabella 1), che dovrebbe essere attentamente valutata prima della sperimentazione.

I seguenti protocolli dimostrano il sangue e di iniezione di collagenasi modelli autologhe nei topi. Questi modelli sono stati entrambi tradotti da modelli originariamente sviluppati nei ratti^13,14 e consentire l'utilizzo di ampiamente disponibili tecnologia transgenica per esplorare meccanismi molecolari associati alla morte cellulare dopo ICH. Entrambi rappresentano nettamente diversi meccanismi di lesione da ICH umana, ed entrambi hanno risultato atteso nettamente differenti in termini di misure comportamentali e istologici. Così, certe ipotesi possono prestarsi ad uno o l'altro, ma molte idee possono richiedere convalida in entrambi i modelli.

Tabella 1. Confronto delle caratteristiche dei modelli di emorragia intracerebrale iniezione di sangue autologo-collagenasi e.

	Collagenase iniezione	Iniezione di sangue
Facilità d'uso	+ + +	+ +
Riproducibilità	+ +	+ +
Controllo di emorragia Size	+ +	+ + +
Reflusso di sangue	+	+ +
Simula malattie umane	+	-
Semplicità	+ +	+ +
Usare in più specie	+ +	+ +

Protocollo

Etica Dichiarazione: Questo protocollo è stato approvato dal Comitato Duke University Istituzionale cura degli animali ed uso e segue tutte le linee guida per l'uso etico degli animali.

1. Preparazione delle attrezzature

1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici prima della chirurgia.
2. Disinfettare l'apparato stereotassico con il 70% di etanolo.
3. Accendere bagnomaria e mantenere la temperatura dell'acqua a 42 ° C.
4. Sciogliere Type IV-S clostridiale collagenasi in soluzione fisiologica ad una concentrazione di 0,075 U per 0.4 ml.

2. Collagenase iniezione Modello

1. Pesare il mouse.
2. Anestetizzare il mouse in una camera di induzione con 5% isoflurano nel 30% O _2/70% N _2. Anestesia adeguata viene segnalato dopo circa 2 minuti quando la respirazione del mouse hanno rallentato a 1 al secondo.
3. Intubare la trachea con una G catetere endovenosa da 30 mm 20.
4. Collegare il catetere ad unroditore ventilatore e ventilare meccanicamente i polmoni 1,6% isoflurano nel 30% O _2/70% N ₂ a una velocità di 105 respiri al minuto, con un volume corrente erogato di 0,75 ml ^..
5. Shave il cuoio capelluto con un rasoio elettronico. Una volta che il mouse è anestetizzato e intubato, spostarlo in una stazione di lavoro diversa per la rasatura e poi tornò al banco chirurgico.
6. Fissare la testa in una cornice stereotassica, e livellare la testa con sutura sia coronale e sagittale come punti di riferimento.
7. Applicare una pomata oftalmica per gli occhi.
8. Inserire una sonda di temperatura rettale. Mantenere la temperatura rettale a 37,0 ± 0,2 ° C con un sottoscocca letto ad acqua circolante.
9. Pulire l'area chirurgica con betadine seguita con il 70% di etanolo e ripetere 3 volte.
10. Fare un 1 centimetro linea mediana del cuoio capelluto incisione e pulire periostio lateralmente con un applicatore con punta di cotone sterile per esporre bregma.
11. Drill 1 millimetro di diametro bava foro 2,2 millimetri lasciato latrale di bregma con un trapano raffreddato ad acqua.
12. Ruotare collagenasi flaconcino 5 volte, poi lavare una siringa da 0,5 ml con il 25 ago G (collegato al telaio stereotassico) con 0,5 ml soluzione di collagenasi 5 volte (Lascia 0,5 ml di soluzione di collagenasi in siringa dopo l'ultimo lavaggio).
13. Allineare la punta dell'ago con foro cranico poi espellere 0,1 microlitri dalla siringa e pulire l'ago smusso con il rasoio di disfarsi.
14. Utilizzando un micromanipolatore, avanzare l'ago 3 millimetri in profondità per corteccia e lasciare immobile per 30 sec.
15. Iniettare 0,4 ml oltre 90 sec.
16. Diminuire isoflurano al 1% e lasciare l'ago immobile per 5 min.
17. Ritirare l'ago lentamente.
18. Applicare 1-2 gocce di 0,25% bupivacaina per via sottocutanea e suturare la pelle.
19. Spegnere isoflurano vaporizzatore e togliere il mouse dal telaio stereotassico.
20. Lasciare il mouse per recuperare ventilazione spontanea con successiva estubazione tracheale.
21. Ritorno mouse in una gabbia pulita e consentire l'accesso gratuito alcibo e acqua.

3. Autologo Modello Iniezione di sangue

1. Seguire i passaggi 2,1-2,11 per il modello iniezione di collagenasi.
2. Disegna 50 ml di soluzione fisiologica sterile in una siringa da 30 G 50 microlitri.
3. Collegare la siringa microlitri con un tubo PE10 70 centimetri.
4. Espellere tutta la soluzione fisiologica dalla siringa microlitro in PE10 tubi di tubi completamente de-aria.
5. Estrarre il microlitro siringa pistone 1 mm fare una bolla d'aria all'apertura distale del tubo-microlitro apparecchi siringa PE10 evitare miscela di soluzione salina e sangue durante le procedure successive.
6. Pulire la coda regione centrale arteria distale del mouse con etanolo al 70%, e tagliare l'arteria con un rasoio a 0.5 a 1 cm dalla punta della coda.
7. Raccogliere 40 ml di sangue dalla coda tagliata nel tubo-microlitro apparecchi siringa PE10. Nota: che l'eparina non viene utilizzato nell'ago, tubi, o mouse.
8. Attaccare la siringa microlitri sul injepompa ction.
9. Collegare la porzione cannula metallica di un ago 27 G all'estremità del tubo PE10, e fissare l'ago a un micromanipolatore sul telaio stereotassico.
10. Espellere 2 ml di sangue su 27 G ago e pulire l'ago smusso con il rasoio di disfarsi.
11. Allineare la punta dell'ago con foro cranico e inserire aghi 3 mm di profondità di corteccia.
12. Iniettare 35 ml di sangue autologo ad una velocità di 2 ml al minuto.
13. Diminuire isoflurano al 1% e lasciare l'ago immobile per 10 min.
14. Ritirare l'ago oltre 30 sec.
15. Applicare 1-2 gocce di 0,25% bupivacaina per via sottocutanea e suturare la pelle.
16. Spegnere isoflurano vaporizzatore e togliere il mouse dal telaio stereotassico.
17. Lasciare il mouse per recuperare ventilazione spontanea con successiva estubazione.
18. Ritorno mouse in una gabbia pulita e permettere il libero accesso a cibo e acqua.

4. Sham Funzionamento

1. Seguire le stesse procedure di collagenasi injectioModello n, tranne senza iniezione dopo l'inserimento dell'ago.

5. Assistenza post-operatorio

1. Iniettare 0,5 ml di soluzione salina normale sottocutanea la sera della procedura chirurgica sul retro del collo dell'animale.
2. Fornire cibo ammorbidito con acqua e cibo gel in piccole tazze di plastica posti sul pavimento della gabbia. Sostituire il cibo al giorno per 7 giorni.
3. Verificare la perdita di peso, la guarigione delle ferite, e segni di disagio al giorno per 7 giorni.
4. Se sono necessari intervalli di recupero superiori a 7 giorni, rimozione di sutura può essere effettuata in luce anestesia inalatoria (circa 1% isoflurano nel 30% O _2/70% N _2), se necessario.

Risultati

A causa delle differenze nella formazione di ematomi (Figura 1), svolta ipsilaterale è mostrata subito dopo la sveglia per sangue autologo topi iniettati ed entro 2-4 ore dopo l'iniezione di collagenasi, l'espansione ematoma si verifica (Figura 2). Assenza di rotazione omolaterale dovrebbe sollevare preoccupazione per l'assenza di lesioni gravi. Il primo giorno pregiudizio postale, topi in entrambi i modelli dovrebbero dimostrare significativi deficit neurologici (F...

Discussione

Nonostante emergenti ricerca preclinica e grandi studi clinici che ne derivano per i promettenti terapie ^15-18, non ci sono interventi farmacologici dimostrato di migliorare il risultato in ICH, e la cura rimane in gran parte di supporto. Elenchi di possibili terapie possono essere generati da tecnologie ad alto rendimento, come il lavoro trascrittomica e proteomica. Mentre queste tecnologie continuano a progredire la nostra conoscenza di potenziali bersagli terapeutici, in avanti e all'indietro la traduz...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic frame	Stoelting Co.	51603
Probe holder with corner clamp	Stoelting Co.	51631
Mini grinder	Power Glide	Model 60100002
0.5 μl syringe	Microliter	86259	25 G needle
5 μl syringe	Microliter	7637-01
30 G microliter syringe	Microliter	7762-03
Syringe pump	KD Scientific	Model 100
Heat therapy water pump	Gaymar Industries, Inc.	Model# TP650
Circulating waterbed	CMS Tool & Die, Inc.
Rodent ventilator	Harvard Apparatus	Model 683
Isoflurane vaporizer	Drager	Vapor 19.1
Air flowmeter	Cole Parmer	Model PMR1-010295
Induction chamber			Self made
Otoscope	Welch Allyn	22820
Intravenous catheter	Becton-Dickinson	381534	20 G, 1.16 inch Insyte-W
Isoflurane	Baxter Healthcare Corporation	NDC10019-360-69
Collagenase Type IV-S	Sigma	C1889
Polyethylene tubing PE10	Becton-Dickinson	427401
27 G 1 1/4 inch needle	Becton-Dickinson	305136
Surgical scissors	Miltex	21-539
Forceps	Miltex	17-307
Needle holder	Boboz	RS-7840
Monofilament suture	Ethicon	8698	Size 5-0
Indicating controller	YSI	73ATD