הזרקת Intrastriatal של עצמי בדם או קלוסטרידיאל Collagenase כמודלים Murine של Intracerebral שטף דם

Summary

Preclinical models of intracerebral hemorrhage are utilized to mimic certain aspects of clinical disease. Thus, mechanisms of injury and potential therapeutic strategies may be explored. In this protocol, two models of intracerebral hemorrhage are described, intrastriatal (basal ganglia) injections of autologous blood or collagenase.

Abstract

דימום תוך מוחי (ICH) הוא צורה נפוצה של מחלת כלי דם במוח והיא קשורה עם תחלואה ותמותה משמעותיות. חוסר טיפול ואי יעילים של ניסויים קליניים הגדולים שמטרתו עצירת דימום והסרת קריש להדגים את הצורך בחקירה מונחה מנגנון נוספת של ICH. מחקר זה עשוי להתבצע דרך המסגרת הניתנת על ידי מודלים פרה. שני מודלים עכבריים בשימוש פופולרי כוללים הזרקת intrastriatal (גרעיני בסיס) של או דם כולו עצמי או collagenase קלוסטרידיאל. מאז, כל דגם מייצג תכונות pathophysiological שונות במובהק קשורים לICH, שימוש בדגם מסוים ניתן לבחור על סמך מה היבט של המחלה היא כדי להיחקר. לדוגמא, הזרקת דם עצמית באופן מדויק ביותר מייצגת תגובה של המוח לנוכחות של דם intraparenchymal, ועשויה לשכפל דימום אונים באופן הדוק ביותר. הזרקת collagenase קלוסטרידיאל מייצגת באופן מדויק ביותר שלקרע כלי קניון ואופייני התפתחות שטף דם של שטפי דם עמוקים. לפיכך, כל תוצאות מודל במבנה שונה שטף דם, תגובת neuroinflammatory, פיתוח בצקת מוחי, ותוצאות neurobehavioral. חוסנה של התערבות טיפולית כביכול ניתן להעריך הטוב ביותר באמצעות שני המודלים. בפרוטוקול זה, אינדוקציה של ICH שימוש בשתי המודלים, הפגנה שלאחר ניתוח מיידית של פציעה, וטכניקות טיפול שלאחר ניתוח הראשונה הם הפגינו. שני הדגמים לגרום לפציעות לשחזור, כרכי שטף דם, וגירעונות neurobehavioral. בגלל חוסר האחידות של ICH אדם, יש צורך במודלים פרה מרובים כדי לחקור ביסודיות מנגנוני pathophysiologic ולבדוק אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות.

Introduction

דימום תוך מוחי (ICH) הוא צורה נפוצה יחסית של מחלת כלי דם במוח בכ 40-50% מהחולים נגועים למות בתוך 30 ימים ^1. למרבה הצער, שיפור מועט נעשה בשיעור התמותה מעל 20 השנים האחרונות ^2. דיווחים מהמכון הלאומי לבריאות ³ והנחיות מהלב האמריקאי ⁴ האיגוד הדגישו את החשיבות של פיתוח מודלים רלוונטיים קליני של ICH להאריך את ההבנה של הפתופיזיולוגיה ולפתח מטרות לגישות טיפוליות חדשות.

מספר דגמים קיימים לחקות ICH אדם ^5. ככל שהבנה של מתבגרת הפתופיזיולוגיה ICH, זה הפך להיות ברור כי מגוון רחב של דגמים ניתן להשתמש כדי לבחון את ההיבטים שונים של המחלה. מודלים ששמשו בעבר כוללים angiopathy העכברי עמילואיד ^6, כניסה microballoon intraparenchymal ואינפלציה ^7, ודם עורקים ישירהחדירה ^8,9. דימום אונים מangiopathy עמילואיד כבר דגם עם השימוש בעכברים הטרנסגניים ומייצג תת סוג ICH מובחן. מודלים Microballoon לחקות אפקט מסה חריף מהיווצרות שטף דם אבל לא מצליחים ללכוד תגובה התאית של המוח לנוכחות של דם. לבסוף, חדירת דם עורקים ישירה מכפיפה את המוח לחצים עורקים מעורק הירך. לפיכך, לחצים זה מחקה מודל העורק ואת הנוכחות של דם, אך לא תחשוף את המוח לפגיעה כלי הדם מקרע של כלי דם קטן. יתר על כן, מודל זה יש גבוה מיסודו השתנות. מעניין לציין, כי חולדות עם יתר לחץ דם באופן ספונטני ¹⁰ לפתח ICH ספונטני כשהם מזדקנים. מחקר של בעלי חיים אלה לאחר פיתוח ICH יכול לחקות את המחלה בנוכחותו של אחד מהתחלואות הגדולות predisposing בני אדם לICH. בעוד מודלים אחרים אלה קיימים, הזרקת intrastriatal של collagenase קלוסטרידיאל ¹¹ או הזרקת instrastiatal שלדם כל utologous ¹² הם, כיום, שני המודלים הנפוצים ביותר בשימוש במחקר קליני ICH.

בחירה במודל ICH צריכה להתבצע על בסיס האובייקטיבי של שאלת הניסוי, כוללים בחירת זנים ושיטה של ​​גרימת היווצרות שטף דם. לדוגמא, חזירים הם בעלי חיים גדולים עם נפח מוח חומר הלבן גדול יחסית בהשוואה לעכברים. לפיכך, מודלים חזיריים מתאימים ללמוד הפתופיזיולוגיה חומר לבנה לאחר ICH. בניגוד לכך, המוח של מכרסמים הם במידה רבה עניין אפור, אבל מערכות מהונדסים לעשות מכרסמים שימושיים כדי להעריך את המנגנונים מולקולריים של פגיעה והתאוששות לאחר ICH. לכל דגם עוצמות הטבועות בו וחולשות (טבלה 1), אשר יש לשקול בזהירות לפני ניסויים.

הפרוטוקולים הבאים להדגים את המודלים דם והזרקת collagenase עצמיים בעכברים. מודלים אלה כל תורגמו ממודלים שפותחו במקור בחולדות^13,14 ולאפשר את השימוש בטכנולוגיה מהונדס זמינה באופן נרחב כדי לחקור מנגנונים מולקולריים הקשורים למוות של תאים לאחר ICH. שניהם מייצגים מנגנוני פציעה שונים במובהק מICH האנושי, ושניהם יש תוצאה צפויה שונה במובהק במונחים של מדדים התנהגותיים והיסטולוגית. לפיכך, השערות מסוימות עשויות להשאיל את עצמם למודל אחד על פנים השני, אך רעיונות רבים עשויים לדרוש אימות בשני המודלים.

טבלת 1. השוואה של מאפיינים של collagenase ודגמי דימום עצמיים הזרקת דם תוך מוחיים.

	הזרקת Collagenase	הזרקת דם
קלות השימוש	+ + +	+ +
שחזור	+ +	+ +
שליטה על גודל שטף דם	+ +	+ + +
Reflux דם	+	+ +
מדמה מחלה אנושית	+	-
פשטות	+ +	+ +
השתמש במינים רבים	+ +	+ +

Protocol

הצהרת אתיקה: פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה של אוניברסיטת דיוק בבעלי חיים מוסדי הטיפול והשימוש ועוקב כל ההנחיות לשימוש האתיים בבעלי חיים.

1. הכנת הציוד

1. החיטוי הכלים כירורגיים לפני הניתוח.
2. לחטא את מנגנון stereotactic עם 70% אתנול.
3. הפעל אמבט מים ולשמור על טמפרטורת מים ב42 ° C.
4. ממיסים collagenase קלוסטרידיאל IV-S סוג במלח רגיל בריכוז של 0.075 U ל0.4 μl.

2. דגם הזרקת Collagenase

1. לשקול את העכבר.
2. להרדים את העכבר בתא אינדוקציה עם isoflurane 5% ב30% O _2/70% N _2. הרדמה נאותה הוא אותת לאחר כ 2 דקות כאשר נשימות עכבר יש האטה עד 1 לשנייה.
3. צנרר קנה הנשימה עם קטטר תוך ורידי G 30 מ"מ 20.
4. חבר את הקטטר להנשמה מכרסמים ומכאניים לאוורר את הריאות עם isoflurane 1.6% ב30% O _2/70% N ₂ בשיעור של 105 נשימות לדקה עם נפח גאות נמסר מ0.75 מיליליטר ^..
5. לגלח את הקרקפת עם מכונת גילוח חשמלי. ברגע שהעכבר הוא מורדם ומונשם, להעביר אותו לתחנת עבודה שונה לגילוח ולאחר מכן חזרתי לספסל כירורגית.
6. לאבטח את הראש במסגרת stereotactic, ואת רמת הראש עם תפר שתי העטרה ועל sagittal כנקודות התייחסות.
7. החל משחת עיניים לעיניים.
8. הכנס בדיקה טמפרטורה רקטלית. לשמור על טמפרטורה רקטלית ב37.0 ± 0.2 מעלות צלזיוס באמצעות underbody במחזור מיטת מים.
9. נגב את אזור הניתוח עם בטאדין אחריו עם 70% אתנול ולחזור 3 פעמים.
10. לעשות חתך בקרקפת קו האמצע 1 סנטימטר ולנגב periosteum רוחבי עם המוליך כותנה שקצה סטרילי לחשוף גבחת.
11. לקדוח חור בקוטר 1 מ"מ בר 2.2 מ"מ עזב latאראל לגבחת עם מקדחת מקורר מים.
12. סובב בקבוקון collagenase 5 פעמים, ולאחר מכן לשטוף מזרק 0.5 μl עם מחט 25 G (המצורף למסגרת stereotactic) עם 0.5 פתרון collagenase μl 5 פעמים (השאר 0.5 μl של פתרון collagenase במזרק לאחר השטיפה האחרונה).
13. יישר קצה מחט עם חור בר לאחר מכן לגרש 0.1 μl מהמזרק ולנגב פוע מחט עם סכין גילוח כדי לבטל.
14. באמצעות micromanipulator, לקדם מ"מ העמוק לקליפת מחט 3 ולהשאיר תנועה במשך 30 שניות.
15. הזרק 0.4 μl מעל 90 שניות.
16. ירידת isoflurane עד 1% ולהשאיר את התנועה מחט למשך 5 דקות.
17. לסגת מחט באיטיות.
18. החל 1 - 2 טיפות של 0.25% מתחת לעור bupivacaine ולתפור את העור.
19. כבה את מכשיר האדים isoflurane ולהסיר עכבר מהמסגרת stereotactic.
20. לאפשר עכבר כדי להתאושש אוורור ספונטני עם האקסטובציה לקנה הנשימה שלאחר מכן.
21. חזור עכבר לכלוב נקי ולאפשר גישה חופשית אלמזון ומים.

3. דגם הזרקת דם עצמי ב

1. בצע את השלבים 2.1-2.11 עבור דגם הזרקת collagenase.
2. צייר 50 μl של מלח רגיל סטרילי לתוך מזרק μl 30 G 50.
3. חבר את מזרק microliter עם צינור PE10 70 סנטימטר.
4. לגרש את כל מלח הרגיל ממזרק microliter לתוך צינור PE10 לחלוטין לצינורות דה אוויר.
5. משוך את הבוכנה מזרק microliter מתוך 1 מ"מ לעשות בועת אוויר בפתיחה הדיסטלי של מנגנון מזרק צינור microliter PE10 כדי למנוע תערובת של מי מלח ודם במהלך הליכים מאוחר יותר.
6. נגב את אזור עורק הזנב המרכזי הדיסטלי של העכבר עם 70% אתנול, וחתך את העורק בסכין גילוח ב.5-1 סנטימטר ועד לקצה הזנב.
7. לאסוף 40 μl דם מהזנב החתוך למנגנון מזרק צינור microliter PE10. הערה: שלא נעשה שימוש בהפרין במחט, צינורות, או העכבר.
8. צרף את מזרק microliter על injeמשאבת ction.
9. חבר את חלק צינורית המתכת של מחט 27 G לסוף צינור PE10, ולאבטח את המחט לmicromanipulator על מסגרת stereotactic.
10. לגרש 2 μl דם מתוך 27 מחט G ולנגב פוע מחט עם סכין גילוח כדי לבטל.
11. יישר קצה מחט עם חור בר ולהכניס את המחט 3 מ"מ עמוק לקליפת המוח.
12. הזרק 35 μl דם עצמי בשיעור של 2 μl לדקה.
13. ירידת isoflurane עד 1% ולהשאיר את התנועה מחט ל10 דקות.
14. לסגת מחט מעל 30 שניות.
15. החל 1 - 2 טיפות של 0.25% מתחת לעור bupivacaine ולתפור את העור.
16. כבה את מכשיר האדים isoflurane ולהסיר עכבר מהמסגרת stereotactic.
17. לאפשר עכבר כדי להתאושש אוורור ספונטני עם האקסטובציה שלאחר מכן.
18. חזור עכבר לכלוב נקי ולאפשר גישה חופשית למזון ומים.

4. שאם מבצע

1. בצע את אותו נהלים למכוירים יציקת collagenaseמודל n, למעט ללא הזרקה לאחר החדרת מחט.

5. טיפול שלאחר ניתוח

1. הזרק 0.5 מיליליטר של תת עורי מלח הרגיל בערבו של ההליך הכירורגי בחלק האחורי של צווארו של בעל החיים.
2. לספק מזון מרוכך במים ומזון ג'ל בכוסות פלסטיק קטנים שהונחו על הרצפה של הכלוב. החלף את המזון ביום למשך 7 ימים.
3. הגעה לירידה במשקל, ריפוי פצעים, וסימנים של אי נוחות ביום למשך 7 ימים.
4. אם מרווחי התאוששות של יותר מ 7 ימים נדרשים, הסרת תפר עשויה להיות מבוצעת בהרדמה בשאיפה אור (isoflurane כ 1% ב30% O _2/70% N _2), במידת צורך.

תוצאות

בשל הבדלים בהיווצרות המטומה (איור 1), מפנה ipsilateral מוצג מייד לאחר השכמה לעכברים שהוזרקו דם עצמי ובתוך 2 - 4 שעות לאחר הזרקת collagenase, כהרחבת שטף דם מתרחשת (איור 2). העדרו של מפנה ipsilateral צריך להעלות חשש להיעדרות של פציעה משמעותית. ביום שלאחר הפציעה הראשון, עכב?...

Discussion

למרות מתעורר מחקר קליני וניסויים קליניים גדולים שנוצר למבטיח הרפוי ^15-18, אין התערבויות תרופתי הפגינו כדי לשפר את התוצאה בICH, וטיפול נשאר במידה רבה תומך. רשימות של טיפולים אפשריים עשויות להיות שנוצרו על ידי טכנולוגיות תפוקה גבוהה, כגון עבודת transcriptomic וproteomic. בעוד ט...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic frame	Stoelting Co.	51603
Probe holder with corner clamp	Stoelting Co.	51631
Mini grinder	Power Glide	Model 60100002
0.5 μl syringe	Microliter	86259	25 G needle
5 μl syringe	Microliter	7637-01
30 G microliter syringe	Microliter	7762-03
Syringe pump	KD Scientific	Model 100
Heat therapy water pump	Gaymar Industries, Inc.	Model# TP650
Circulating waterbed	CMS Tool & Die, Inc.
Rodent ventilator	Harvard Apparatus	Model 683
Isoflurane vaporizer	Drager	Vapor 19.1
Air flowmeter	Cole Parmer	Model PMR1-010295
Induction chamber			Self made
Otoscope	Welch Allyn	22820
Intravenous catheter	Becton-Dickinson	381534	20 G, 1.16 inch Insyte-W
Isoflurane	Baxter Healthcare Corporation	NDC10019-360-69
Collagenase Type IV-S	Sigma	C1889
Polyethylene tubing PE10	Becton-Dickinson	427401
27 G 1 1/4 inch needle	Becton-Dickinson	305136
Surgical scissors	Miltex	21-539
Forceps	Miltex	17-307
Needle holder	Boboz	RS-7840
Monofilament suture	Ethicon	8698	Size 5-0
Indicating controller	YSI	73ATD