Injection intraestriatal de sangue autólogo ou Clostridial colagenase como modelos murinos de hemorragia intracerebral

Resumo

Preclinical models of intracerebral hemorrhage are utilized to mimic certain aspects of clinical disease. Thus, mechanisms of injury and potential therapeutic strategies may be explored. In this protocol, two models of intracerebral hemorrhage are described, intrastriatal (basal ganglia) injections of autologous blood or collagenase.

Resumo

Hemorragia intracerebral (ICH) é uma forma comum de doença vascular cerebral e está associada a significativa morbidade e mortalidade. A falta de tratamento eficaz e fracasso de grandes ensaios clínicos destinados a hemostasia e remoção do coágulo demonstrar a necessidade de mais-driven mecanismo de investigação do ICH. Esta pesquisa pode ser realizada através da estrutura fornecida pelos modelos pré-clínicos. Dois modelos murinos em uso popular incluem intrastriatal (gânglios basais) ou injeção de sangue autólogo todo ou colagenase clostridiana. Uma vez que, cada modelo representa distintamente diferentes características fisiopatológicas relacionadas com HIC, o uso de um determinado modelo pode ser seleccionado com base no que os aspectos da doença está a ser estudado. Por exemplo, a injeção de sangue autólogo representa com mais precisão a resposta do cérebro à presença de sangue intraparenquimatosa, e pode replicar mais de perto hemorragia lobar. Clostridial injeção de colagenase representa com mais precisão as sruptura do vaso shopping e hematoma evolução característica de hemorragias profundas. Assim, cada modelo resulta na formação diferente hematoma, resposta neuroinflammatory, desenvolvimento de edema cerebral, e os resultados neurocomportamentais. Robustez de uma intervenção terapêutica pretendida pode ser melhor avaliada por ambos os modelos. Neste protocolo, a indução da ICH usando ambos os modelos, a demonstração de pós-operatório imediato de lesão, e técnicas de primeiros cuidados pós-operatórios são demonstrados. Ambos os modelos resultar em lesões reprodutíveis, volumes hematoma e déficits neurocomportamentais. Devido à heterogeneidade do ICH humana, vários modelos pré-clínicos são necessários para explorar completamente os mecanismos fisiopatológicos e testar estratégias terapêuticas potenciais.

Introdução

Hemorragia intracerebral (ICH) é uma forma relativamente comum de doença cerebrovascular, com cerca de 40-50% dos pacientes que sofrem de morrer dentro de 30 dias ^1. Infelizmente, pouca melhoria foi feita na taxa de mortalidade nos últimos 20 anos ^2. Os relatórios dos Institutos Nacionais de Saúde ³ e diretrizes da American Heart Association ⁴ sublinhou a importância do desenvolvimento de modelos clinicamente relevantes de ICH para ampliar a compreensão da fisiopatologia e desenvolver alvos para novas abordagens terapêuticas.

Existem diversos modelos de imitar ICH humano ^5. Como compreensão da patofisiologia da ICH amadurece, tornou-se evidente que uma variedade de modelos podem ser utilizados para examinar diferentes aspectos da doença. Modelos utilizados anteriormente incluem murino angiopatia amilóide ^6, inserção microbalão intraparenquimatosa e inflação ^7, eo sangue arterial diretainfiltração de ^8,9. Lobar de angiopatia amilóide foi modelada com a utilização de ratos transgénicos e representa um subtipo ICH distinta. Modelos microbalão imitar efeito de massa aguda de formação de hematoma, mas não conseguem capturar a resposta celular do cérebro para a presença de sangue. Finalmente, a infiltração do sangue arterial direta sujeita o cérebro a pressão arterial da artéria femoral. Assim, este modelo reproduz pressão arterial ea presença de sangue, mas não submeta o cérebro a lesão microvascular de ruptura de pequenos vasos de sangue. Além disso, este modelo tem inerentemente uma alta variabilidade. Curiosamente, ratos espontaneamente hipertensos ¹⁰ desenvolver ICH espontânea à medida que envelhecem. O estudo destes animais após o desenvolvimento de HIC pode imitar a doença na presença de um dos principais co-morbidades que predispõem os seres humanos para HIC. Embora existam esses outros modelos, injeção intrastriatal de Clostridial colagenase ¹¹ ou injeção instrastiatal de umtodo utologous sangue ¹² são, atualmente, os dois modelos mais comuns utilizados na pesquisa pré-clínica ICH.

ICH selecção do modelo deve ser feita com base no objectivo de questão experimental, incluindo a seleção de espécies e método de induzir a formação de hematoma. Por exemplo, os porcos são grandes animais com volumes relativamente grandes de substância branca do cérebro, em comparação com ratinhos. Assim, os modelos de suínos são adequados para estudar a fisiopatologia da substância branca após ICH. Em contraste, os cérebros de roedores são matéria em grande parte cinza, mas sistemas de transgênicos fazem roedores útil para avaliar os mecanismos moleculares de lesão e recuperação após ICH. Cada modelo tem seus pontos fortes e fracos (Tabela 1) inerentes, que devem ser cuidadosamente considerados antes da experimentação.

Os seguintes protocolos de demonstrar o sangue e injecção colagenase modelos autólogas em ratinhos. Estes modelos têm cada foram traduzidos a partir de modelos desenvolvidos originalmente em ratos^13,14 e permitir a utilização de tecnologia transgénica largamente disponível para explorar mecanismos moleculares associadas com a morte celular após a ICH. Ambos representam distintamente diferentes mecanismos de lesão do ICH humano, e ambos têm resultado esperado distintamente diferentes em termos de medidas comportamentais e histológicas. Assim, certas hipóteses podem prestar-se a um modelo sobre o outro, mas muitas ideias podem exigir validação em ambos os modelos.

Tabela 1. Comparação das características de injeção de sangue autólogo modelos hemorragia intracerebral colagenase-e.

	Colagenase Injeção	Injeção de sangue
Fácil de Usar	+ + +	+ +
Reprodutibilidade	+ +	+ +
Controle de Hemorragia Tamanho	+ +	+ + +
Refluxo de sangue	+	+ +
Simula Doenças Humanas	+	-
Simplicidade	+ +	+ +
Uso em múltiplas espécies	+ +	+ +

Protocolo

Declaração de Ética: Este protocolo foi aprovado pelo Comitê da Universidade Duke Institutional Animal Care e Use e segue todas as diretrizes para o uso ético de animais.

1. Preparação de Equipamento

1. Autoclave os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia.
2. Desinfectar o aparelho estereotáxico com etanol a 70%.
3. Ligue banho de água e manter a temperatura da água a 42 ° C.
4. Dissolver tipo IV-S colagenase de Clostridium, em solução salina normal com uma concentração de 0,075 L por 0,4 ul.

2. Injeção Modelo colagenase

1. Pesar o mouse.
2. Anestesiar o mouse em uma câmara de indução com 5% de isoflurano em 30% O _{2/70% N2.} Anestesia adequada é sinalizado após cerca de 2 min, quando respirations rato ter abrandado a 1 por segundo.
3. Entubar a traqueia com um G 30 mm 20 cateter intravenoso.
4. Conectar o cateter para umventilador roedor e ventilar mecanicamente os pulmões com 1,6% de isoflurano em 30% O _{2/70% N2} a uma taxa de 105 ciclos por minuto, com um volume corrente fornecido de 0,75 ml ^..
5. Raspar o couro cabeludo com um barbeador eletrônico. Uma vez que o mouse é anestesiado e entubado, movê-lo para uma estação de trabalho diferente para fazer a barba e, em seguida, voltou para o banco cirúrgico.
6. Fixe a cabeça em um quadro estereotáxico, e nivelar a cabeça com sutura tanto coronal e sagital, como pontos de referência.
7. Aplicar pomada oftálmica para os olhos.
8. Insira uma sonda de temperatura retal. Manter a temperatura rectal em 37,0 ± 0,2 ° C usando um colchão de água em circulação substrutura.
9. Limpe a área cirúrgica com betadine seguido com etanol 70% e repetir 3 vezes.
10. Faça uma incisão no couro cabeludo um centímetro da linha média e limpe periósteo lateralmente com um aplicador com ponta de algodão estéril para expor bregma.
11. Exercício 1 mm de diâmetro burr hole 2,2 milímetros deixou latral para bregma com uma broca refrigerado a água.
12. Gire colagenase frasco 5 vezes, em seguida, lave a seringa de 0,5 mL com agulha 25 G (anexo ao quadro estereotáxico) com 0,5 mL solução de colagenase 5 vezes (Deixar de 0,5 ml de solução de colagenase em seringa após a última lavagem).
13. Alinhe a ponta da agulha com orifício de trepanação, em seguida, expulsar 0,1 mL da seringa e limpe a agulha de bisel com navalha descartar.
14. Usando um micromanipulador, avançar a agulhas 3 mm de profundidade ao córtex e deixar imóvel por 30 seg.
15. Injetar 0,4 mL mais de 90 seg.
16. Diminuir isoflurano a 1% e deixar agulha imóvel por 5 min.
17. Retire a agulha lentamente.
18. Aplicar 1-2 gotas de bupivacaína a 0,25% por via subcutânea e suturar a pele.
19. Desligue o isoflurano vaporizador e retire do mouse a partir do quadro estereotáxico.
20. Permitir mouse para recuperar a ventilação espontânea com posterior extubação traqueal.
21. Retorno do mouse para uma gaiola limpa e permitir o acesso livre paraalimentos e água.

3. Autólogo Modelo Injeção de sangue

1. Siga os passos 2,1-2,11 para o modelo de injeção de colagenase.
2. Desenhar 50 ul de solução salina normal estéril numa seringa de 30 mL, G 50.
3. Conecte a seringa microlitro com um tubo PE10 70 centímetros.
4. Expulse todo o soro fisiológico do microlitro seringa no tubo PE10 completamente a tubulação de ar-DE.
5. Puxar o êmbolo da seringa para fora microlitro de 1 mM a fazer uma bolha de ar na abertura distal do aparelho de seringa de tubo PE10-microlitro para evitar a mistura de solução salina e de sangue durante procedimentos posteriores.
6. Seque a região da artéria caudal centro distal do rato com etanol a 70%, e cortar a artéria com uma lâmina de 0,5 a 1 cm para a ponta da cauda.
7. Recolha de 40 mL de sangue a partir da cauda cortada em o aparelho de seringa de tubo PE10-microlitro. Nota: que a heparina não é usado na agulha, tubo ou um rato.
8. Fixe a seringa microlitro na injebomba cção.
9. Ligue a porção de cânula metálica de uma agulha de 27 G para a extremidade do tubo PE10, e proteger a agulha a um micromanipulador na armação estereotáxica.
10. Expulse 2 l de sangue de 27 G agulha e limpe a agulha de bisel com navalha descartar.
11. Alinhe a ponta da agulha com orifício de trepanação e inserir as agulhas 3 mm de profundidade ao córtex.
12. Injectar 35 mL de sangue autólogo, a uma taxa de 2 mL por minuto.
13. Diminuir isoflurano a 1% e deixar agulha imóvel por 10 min.
14. Retire a agulha mais de 30 seg.
15. Aplicar 1-2 gotas de bupivacaína a 0,25% por via subcutânea e suturar a pele.
16. Desligue o isoflurano vaporizador e retire do mouse a partir do quadro estereotáxico.
17. Permitir mouse para recuperar a ventilação espontânea com extubação subseqüente.
18. Retorno do mouse para uma gaiola limpa e permitir o acesso livre à comida e água.

4. Sham Operação

1. Siga os mesmos procedimentos para a colagenase injectiomodelo n, exceto sem injeção após a inserção da agulha.

5. Cuidados pós-cirurgia

1. Injectar 0,5 mL de uma solução salina normal subcutaneamente na noite do procedimento cirúrgico na parte de trás do pescoço do animal.
2. Fornecer comida amolecida com água e comida de gel em pequenas chávenas de plástico colocadas sobre o chão da gaiola. Substitua os alimentos por dia durante 7 dias.
3. Verifique se há perda de peso, cicatrização de feridas, e sinais de desconforto por dia durante 7 dias.
4. Se são requeridos intervalos de recuperação superiores a 7 dias, a remoção da sutura pode ser realizada sob anestesia leve inalado (aproximadamente 1% de isoflurano em 30% O _2/70% N _2), se necessário.

Resultados

Devido às diferenças na formação de hematoma (Figura 1), de virada ipsilateral é mostrado imediatamente após o despertar para o sangue autólogo camundongos injetados e dentro de 2-4 horas após a injeção de colagenase, como a expansão do hematoma ocorre (Figura 2). Ausência de viragem ipsilateral deve causar preocupação para a ausência de lesões significativas. No primeiro dia pós lesão, os ratos de ambos os modelos devem demonstrar déficits neurológicos significativo...

Discussão

Apesar emergente pesquisa pré-clínica e grandes ensaios clínicos resultantes para prometendo terapêutica ^15-18, não há intervenções farmacológicas demonstraram para melhorar o resultado na ICH e cuidados permanece em grande parte de suporte. As listas de possíveis terapias podem ser gerados pelas tecnologias de alto rendimento, como o trabalho transcriptomic e proteômica. Embora estas tecnologias continuam a avançar o nosso conhecimento de potenciais alvos terapêuticos, para frente e para trás t...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic frame	Stoelting Co.	51603
Probe holder with corner clamp	Stoelting Co.	51631
Mini grinder	Power Glide	Model 60100002
0.5 μl syringe	Microliter	86259	25 G needle
5 μl syringe	Microliter	7637-01
30 G microliter syringe	Microliter	7762-03
Syringe pump	KD Scientific	Model 100
Heat therapy water pump	Gaymar Industries, Inc.	Model# TP650
Circulating waterbed	CMS Tool & Die, Inc.
Rodent ventilator	Harvard Apparatus	Model 683
Isoflurane vaporizer	Drager	Vapor 19.1
Air flowmeter	Cole Parmer	Model PMR1-010295
Induction chamber			Self made
Otoscope	Welch Allyn	22820
Intravenous catheter	Becton-Dickinson	381534	20 G, 1.16 inch Insyte-W
Isoflurane	Baxter Healthcare Corporation	NDC10019-360-69
Collagenase Type IV-S	Sigma	C1889
Polyethylene tubing PE10	Becton-Dickinson	427401
27 G 1 1/4 inch needle	Becton-Dickinson	305136
Surgical scissors	Miltex	21-539
Forceps	Miltex	17-307
Needle holder	Boboz	RS-7840
Monofilament suture	Ethicon	8698	Size 5-0
Indicating controller	YSI	73ATD