İntraserebral Kanama Fare Modellerinden olarak Otolog Blood veya Klostridyal Kollajenazının intrastriatal Enjeksiyon

Özet

Preclinical models of intracerebral hemorrhage are utilized to mimic certain aspects of clinical disease. Thus, mechanisms of injury and potential therapeutic strategies may be explored. In this protocol, two models of intracerebral hemorrhage are described, intrastriatal (basal ganglia) injections of autologous blood or collagenase.

Özet

Intraserebral kanama (İSK) serebrovasküler hastalık yaygın bir şeklidir ve önemli morbidite ve mortalite ile ilişkilidir. Hemostaz ve pıhtı çıkarılması hedefleniyor büyük klinik çalışmaların etkili tedavi ve başarısızlık eksikliği ICH daha mekanizması odaklı soruşturma için ihtiyaç göstermektedir. Bu araştırma, klinik öncesi modellerde tarafından sağlanan çerçeve aracılığıyla gerçekleştirilebilir. Popüler kullanımı iki kemirgen modelleri, otolog kan veya klostridial kolajenaz ya intrastriatal (bazal ganglia) enjeksiyon yer alır. Yana, her model İSH'lı ilgili belirgin farklı patofizyolojik özellikleri temsil eder, belli bir modelin kullanımı öğretilmektedir hastalığın hangi yönü dayalı seçilebilir. Örneğin, otolog kan enjeksiyonu en doğru intraparenkimal kan varlığı için beynin yanıtı temsil eder, ve en yakın lobar kanama çoğaltabilir. Clostridial kollajenaz enjeksiyon en doğru s temsilalışveriş merkezi damar rüptürü ve derin kanamalar hematom evrimi karakteristik. Böylece farklı hematom oluşumu, nöroenflamatuar tepki, serebral ödem gelişmesi ve nörodavranışsal sonuçları her model sonuçları. Sözde bir terapötik müdahale Sağlamlık en iyi iki model kullanılarak değerlendirilebilir. Bu protokol, her iki model, yaralanma hemen ameliyat sonrası gösteri ve erken post-operatif bakım teknikleri kullanılarak Vaginal indüksiyon gösterilmiştir. Her iki model de tekrarlanabilir yaralanmaları, hematom hacimleri ve nörodavranışsal kayıpla sonuçlanabilir. Çünkü insan ICH heterojenite, birden fazla preklinik modeller iyice patofizyolojik mekanizmalarını keşfetmek ve potansiyel tedavi stratejileri test etmek için gereklidir.

Giriş

Intraserebral kanama (İSK) etkilenen hastaların yaklaşık% 40-50 30 gün içinde ölme ¹ ile serebrovasküler hastalık nispeten sık görülen şeklidir. Ne yazık ki, küçük bir iyileşme son 20 yıl boyunca ² ölüm oranında yapılmıştır. Ulusal Sağlık Enstitüleri ³ ve Amerikan Kalp Derneği ⁴ kılavuzların raporları patofizyolojisi anlayış genişletmek ve yeni tedavi yaklaşımları için hedeflerini geliştirmeye ICH klinik olarak ilgili modellerinin geliştirilmesinin önemini vurguladı.

Çeşitli modeller, insan ICH ⁵ taklit var. ICH patofizyoloji yetişkinlerin anlama olarak, çeşitli modeller hastalığın farklı yönlerini incelemek için kullanılabilir, belirgin hale gelmiştir. Daha önce kullanılan modeller kemirgen amiloid anjiopati ^6, intraparenkimal mikrobalon ekleme ve enflasyon ⁷ ve doğrudan arteriyel kan bulunmaktadırinfiltrasyon ^8,9. Amiloid anjiyopati ikinci Lobar kanama transgenik farelerin kullanılması ile model ve ayrı bir alt tipi ICH temsil edilmiştir. Mikrobalonların modelleri hematom akut kütle etkisinin taklit eden ancak, kan varlığı için beynin hücresel yanıtı yakalamak için başarısız. Son olarak, doğrudan arteriyel kan sızması femoral arterden arteriyel baskılara beyin tabi. Dolayısıyla, bu model taklit arter basınçları ve kan varlığı ancak küçük kan damarı yırtılması gelen mikrovasküler yaralanma beyin tabi değildir. Bundan başka, bu model, doğal olarak yüksek bir değişkenlik vardır. Onlar yaş olarak İlginçtir, spontan hipertansif sıçanlar ¹⁰ spontan ICH gelişir. ICH geliştirme sonra bu hayvanların çalışma İSH'lı için insanları yatkınlık önemli Komorbiditelerin birinin varlığında hastalığı taklit edebilir. Klostridial kolajenaz ¹¹ veya a instrastiatal enjeksiyonu bu model mevcut olmakla birlikte, enjeksiyon intrastriatalutologous tüm kan ^12, şu anda en yaygın iki model ICH klinik öncesi araştırmalarda kullanılır.

ICH modeli seçimi türlerin seçimi ve hematom oluşumunu sağlama yöntemi de dahil olmak deneysel sorusunun objektif dayalı yapılmalıdır. Örneğin, domuz farelere göre daha büyük bir beyaz madde beyin hacmi ile büyük hayvanlar olmalarıdır. Böylece, domuz modeller İSH'lı aşağıdaki beyaz cevher patofizyolojisini incelemek için uygundur. Aksine, kemirgen beyin büyük ölçüde gri madde vardır, ancak transgenik sistemleri İSH'lı yaralanma ve iyileşme moleküler mekanizmalarını değerlendirmek için kemirgenler yararlı olun. Her model dikkatli bir deney öncesinde dikkat edilmesi gereken, kendine özgü güçlü ve zayıf yönlerini (Tablo 1) vardır.

Aşağıdaki protokoller farelerde otolog kan ve kolajenaz enjeksiyon modellerini göstermektedir. Bu modeller her biri aslında sıçanlarda geliştirilen modellerden çevrilmiştir^13,14 ve İSH'lı hücre ölümü ile ilişkili moleküler mekanizmalarını keşfetmek için yaygın olarak kullanılabilir transgenik teknolojinin kullanımına izin. Hem insan İSH'lı belirgin farklı bir yaralanma mekanizmalarını ifade eder, hem de davranışsal ve histolojik önlemler açısından belirgin farklı beklenen sonuç var. Böylece, bazı hipotezler diğer üzerinden bir modele kendilerini borç olabilir, ancak birçok fikirler hem de model doğrulama gerekebilir.

Kollajenaz-ve otolog kan enjeksiyonu intraserebral kanama modellerinin özellikleri Tablo 1.. Karşılaştırılması.

	Kolajenaz Enjeksiyon	Kan Enjeksiyon
Kullanım kolaylığı	+ + +	+ +
Tekrarlanabilirlik	+ +	+ +
Kanama Boyutu Kontrolü	+ +	+ + +
Kan Reflü	+	+ +
İnsan Hastalığı simüle	+	-
Basitlik	+ +	+ +
Çoklu Türler kullanın	+ +	+ +

Protokol

Etik Beyanı: Bu protokol, Duke Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve hayvanların etik kullanımı için tüm kuralları takip edilmiştir.

Ekipman 1. Hazırlanması

1. Ameliyat öncesi cerrahi aletler otoklavlayın.
2. % 70 etanol ile stereotaktik aparatı dezenfekte edin.
3. Su banyosu açın ve 42 ° C'de su sıcaklığı tutmak
4. 0.4 ul başına 0.075 U 'lik bir konsantrasyonda, normal tuzlu su içinde Type IV-S klostridial kolajenaz çözülür.

2.. Kolajenaz Enjeksiyon Model

1. Fare tartılır.
2. % 30 O ₂ /% 70 N _2% 5 izofluran ile indüksiyon odasında fare anestezisi. Yeterli anestezi fare solunum saniyede 1 yavaşladı yaklaşık 2 dakika sonra bildirilir.
3. 30 mm 20 G intravenöz kateter ile trakea entübe.
4. Bir kateteri geçkemirgen vantilatör ve mekanik olarak% 30% 1.6 izofluran ile akciğerlere havalandırmak O _2/70 0.75 ml 'lik bir teslim tidal hacmi ile dakikada 105 nefes' lik bir oranda% ₂ ^..
5. Bir elektronik tıraş makinesi ile kafa derisi tıraş. Fare uyutuldu ve sonda sonra, traş etme için başka bir çalışma istasyonuna taşımak ve daha sonra cerrahi tezgah döndü.
6. Stereotaktik çerçeve içinde başını sağlamlaştırmak, ve referans noktaları olarak koronal ve sagital hem sütür ile baş seviyesi.
7. Gözleri oftalmik merhem sürün.
8. Bir rektal ısı probu yerleştirin. Su yatağı dolaşan bir alt gövdeyi kullanarak 37.0 ± 0.2 ° C rektal sıcaklığı korumak.
9. Wipe betadin cerrahi alan% 70 etanol ile takip ve 3 kez tekrarlayın.
10. 1 cm orta hat kafa derisi kesi yapmak ve bregma maruz steril pamuk uçlu bir aplikatör ile yanal periosta silin.
11. Matkap çapı 1 mm burr hole 2,2 mm lat bıraktısu ile soğutulan bir matkap ile bregmaya eral.
12. Kolajenaz şişe 5 çevirin, daha sonra 0.5 ul kolajenaz çözeltisi (stereotaksik çerçeveye bağlı) 25 G iğne ile 5 kez (Son yıkamadan sonra, şırınga içinde kolajenaz çözeltisi 0.5 ul bırak), bir 0.5 ul şırınga yıkayın.
13. Çapak delik ile iğne ucu hizalamak şırınga 0.1 ul sınırdışı ve atmak için ustura ile iğne konik silin.
14. Bir mikromanipülatör kullanarak, kortekse derin iğne 3 mm ilerlemek ve 30 saniye boyunca hareketsiz bırakın.
15. 90 saniye boyunca 0.4 ul enjekte edilir.
16. % 1 izofluran azaltmak ve 5 dakika boyunca iğne hareketsiz bırakın.
17. Yavaş yavaş iğneyi.
18. % 0.25 bupivakain subkutan 2 damla ve cilt sütür 1 - uygulayın.
19. Izofluran buharlaştırıcı kapatın ve stereotaktik çerçeve fareyi çıkarın.
20. Fare sonraki ekstübasyon ile spontan ventilasyon kurtarmak için izin verin.
21. Temiz bir kafes fare dönün ve ücretsiz izinYiyecek ve su.

3.. Otolog Kan Enjeksiyon Modeli

1. Kollajenaz enjeksiyon modeli için 2.11 - 2.1 adımları izleyin.
2. Bir 30 G 50 ul şırınga içine steril normal tuzlu su, 50 ul çizin.
3. 70 cm PE10 boru ile mikrolitre şırınga bağlayın.
4. PE10 tüp tamamen de-hava tüpü içine mikrolitre şırınga tüm normal tuzlu kovun.
5. Daha sonra tuzlu su ve işlemler sırasında kan karışımı önlemek için PE10 boru mikrolitre şırınga düzeneğinin distal açıklık bir hava kabarcığı yapmak için dışarı 1 mm mikrolitre şırınga pistonunu çıkarın.
6. % 70 etanol ile fare distal santral kuyruk arter bölgeyi silin, ve kuyruk ucuna 1 cm 0.5 de bir ustura ile arter kesti.
7. PE10 boru mikrolitre şırınga düzeneğinin kesilmiş kuyruk kan 40 ul toplayın. Not: heparin, iğne, boru, ya da fare kullanılmaz.
8. Inje üzerine mikrolitre şırınga takınction pompası.
9. PE10 tüp sonuna bir 27 G iğne metal kanül kısmı bağlayın ve stereotaktik çerçeve üzerinde bir micromanipulator iğne sabitleyin.
10. 27 G iğne üzerinden kan 2 ul sınırdışı ve atmak için ustura ile iğne konik silin.
11. Çapak delik ile iğne ucu hizalayın ve kortekse derin iğne 3 mm yerleştirin.
12. Dakika başına 2 ul 'lik bir oranda otolog kan 35 ul enjekte edilir.
13. % 1 izofluran azalma ve 10 dakika boyunca iğne hareketsiz bırakın.
14. 30 saniye içinde iğneyi.
15. % 0.25 bupivakain subkutan 2 damla ve cilt sütür 1 - uygulayın.
16. Izofluran buharlaştırıcı kapatın ve stereotaktik çerçeve fareyi çıkarın.
17. Fare sonraki ekstübasyon ile spontan ventilasyon kurtarmak için izin verin.
18. Temiz bir kafes fare dönün ve gıda ve su ücretsiz erişim sağlar.

4. Sham Operasyonu

1. Kollajenaz injectio için aynı prosedürleri takipiğne yerleştirildikten sonra enjeksiyon olmadan hariç n modeli.

5. Post-cerrahi Bakımı

1. Hayvanın boynun arkasındaki cerrahi prosedürün akşam normal tuzlu su deri altına, 0.5 ml enjekte edilir.
2. Kafesin zeminine yerleştirilen küçük plastik bardak, su ve jel gıda ile yumuşatılmış yiyecek sağlamak. 7 gün boyunca günlük yiyecek değiştirin.
3. 7 gün boyunca günlük ağırlık kaybı, yara iyileşmesi ve rahatsızlık belirtileri kontrol edin.
4. 7 günden daha fazla geri kazanımı aralıkları gerekmektedir, gerekirse, ameliyat dikiş ipliği kaldırma, (% 30, O _2/70, N% ₂ yaklaşık olarak% 1 izofluran) açık inhale anestezi altında gerçekleştirilebilir.

Sonuçlar

Hematom genişleme (Şekil 2) oluştuğunda, kolagenaz enjeksiyondan sonra 4 saat - Due hematom oluşumu (Şekil 1) farklılıklara, ipsilateral dönüm hemen otolog kan enjekte edilen farelerin için uyanmak sonra ve 2 içinde gösterilmiştir. Ipsilateral torna yokluğu önemli yaralanma olmaması için endişe yükseltmek gerekir. İlk sonrası yaralanma gününde, her iki modelde de fareler önemli nörolojik defisit (Şekil 3) göstermelidir. Enjeksiyonundan 24 saa...

Tartışmalar

Therapeutics ^15-18 umut verici için klinik öncesi araştırma ve sonuçta büyük klinik çalışmalar gelişmekte olmasına rağmen, orada ICH içinde sonuçlarını iyileştirdiği gösterilmiş hiçbir farmakolojik müdahaleler ve bakım büyük ölçüde destekleyici kalır. Muhtemel tedavilerin listeleri gibi Transkriptomik ve proteomik çalışma gibi yüksek kapasiteli teknolojileri ile üretilebilir. Bu teknolojiler, ileri potansiyel terapötik hedeflerin bilgimizi ilerlemeye devam ediyor ve umut ve...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic frame	Stoelting Co.	51603
Probe holder with corner clamp	Stoelting Co.	51631
Mini grinder	Power Glide	Model 60100002
0.5 μl syringe	Microliter	86259	25 G needle
5 μl syringe	Microliter	7637-01
30 G microliter syringe	Microliter	7762-03
Syringe pump	KD Scientific	Model 100
Heat therapy water pump	Gaymar Industries, Inc.	Model# TP650
Circulating waterbed	CMS Tool & Die, Inc.
Rodent ventilator	Harvard Apparatus	Model 683
Isoflurane vaporizer	Drager	Vapor 19.1
Air flowmeter	Cole Parmer	Model PMR1-010295
Induction chamber			Self made
Otoscope	Welch Allyn	22820
Intravenous catheter	Becton-Dickinson	381534	20 G, 1.16 inch Insyte-W
Isoflurane	Baxter Healthcare Corporation	NDC10019-360-69
Collagenase Type IV-S	Sigma	C1889
Polyethylene tubing PE10	Becton-Dickinson	427401
27 G 1 1/4 inch needle	Becton-Dickinson	305136
Surgical scissors	Miltex	21-539
Forceps	Miltex	17-307
Needle holder	Boboz	RS-7840
Monofilament suture	Ethicon	8698	Size 5-0
Indicating controller	YSI	73ATD