تصور جسيم داخلي حيوية في محطات عصب المعيشة مع رباعية الابعاد التصوير الإسفار

Summary

ويستخدم رباعي الأبعاد (4D) التصوير لدراسة السلوك والتفاعلات بين نوعين من الإندوسومات في العيش المحطات العصبية الفقاريات. وتتميز حركة هذه الهياكل الصغيرة في ثلاثة أبعاد، والسماح تأكيد الأحداث مثل الانصهار جسيم داخلي وإيماس.

Abstract

وقد استخدمت رباعي الأبعاد (4D) التصوير ضوء لدراسة سلوك هياكل صغيرة داخل المحطات العصب المحرك للالمستعرضة البطنية العضلات رقيقة من ثعبان سام. تضم البيانات الخام تسلسل الوقت الفاصل بين ل3D ض المداخن. كل كومة يحتوي على 4-20 الصور المكتسبة مع عدسات epifluorescence في طائرات التنسيق مفصولة 400-1،500 نانومتر. الخطوات في اكتساب مداخن صورة، مثل تعديل التركيز، والتحول من موجات الإثارة، وتشغيل الكاميرا الرقمية، ومؤتمتة قدر الإمكان لزيادة معدل الصورة وتقليل تلف الأنسجة من التعرض للضوء. بعد الاستحواذ، وdeconvolved مجموعة من مداخن صورة لتحسين القرار المكانية، وتحويلها إلى شكل 3D المطلوب، واستخدامها لإنشاء "فيلم" 4D التي هي مناسبة لمجموعة متنوعة من التحليلات التي تعتمد على الكمبيوتر، اعتمادا على البيانات التجريبية المطلوبة. طلب واحد هو دراسة السلوك الديناميكي للفئتين من الإندوسومات جدت في الأعصاب الطرفية-macroendosomes (MES)والإندوسومات الحمضية (AES) الذي أحجام (200-800 نانومتر لكلا النوعين) هي في أو بالقرب من الحد الحيود. الوصول إلى المعلومات 3D في كل نقطة زمنية يوفر العديد من المزايا التقليدية الوقت الفاصل بين التصوير. على وجه الخصوص، وحجم وسرعة حركة الهياكل يمكن قياسها كميا مع مرور الوقت من دون فقدان التركيز الشديد. أمثلة من البيانات من 4D التصوير تكشف عن أن محلات الصرافة الاقتراب من غشاء البلازما وتختفي، مما يشير إلى أنهم exocytosed بدلا من مجرد التحرك عموديا بعيدا عن طائرة واحدة من التركيز. وكشف أيضا هو الانصهار المفترضة من محلات الصرافة وكيانات، من خلال التصور من التداخل بين الهياكل التي تحتوي على صبغة اثنين كما شوهدت في كل ثلاثة إسقاطات المتعامدة.

Introduction

الوقت الفاصل بين التصوير من الأنسجة الحية يوفر الوصول البصرية للعلاقات هيكل الوظائف الديناميكية التي لا يمكن تقديره في الأعمال التحضيرية ثابتة أو يعيشون تصويرها عند نقطة واحدة في الوقت المناسب. في كثير من الأحيان، ومع ذلك، والمقايضة للحصول على المعلومات الزمانية هو انخفاض في القرار البصرية. الأهداف النفط الغمر عالية الفتحة العددية هي غير عملي في الأنسجة الحية بسبب نطاق ضيق على التركيز، وترك الغمر بالماء أو أهداف الجافة باعتبارها بدائل فقط. وعلاوة على ذلك، فإن قرار زيادة يوفرها البصريات متحد البؤر لا يمكن استخدامها في بعض الاستعدادات المعيشة بسبب الضيائية من مستويات عالية نسبيا من الإضاءة المطلوبة ^1،2. أخيرا، في حين أن العديد من الوقت الحقيقي أو الوقت الفاصل بين التقنيات البصرية المتاحة التي عرض القرار المحسن تطبيقها يقتصر على الاستعدادات حيث يمكن وضعه داخل هياكل الفائدة بضع مئات نانومتر الهدف ^1. الطريقة الموضحةيجعل من استخدام المعدات قليلة التكلفة نسبيا، هي متعددة، ولكن يقدم تحسين القرار مقارنة استخداما أكثر التقنيات مرور الزمن. الغرض منه هو للاستخدام في المختبرات الفردية فضلا عن مرافق التصوير.

يستخدم الأسلوب المجهري epifluorescence التقليدية، جنبا إلى جنب مع كاميرا رقمية حساسة ومع الأجهزة المصممة لاكتساب بسرعة مجموعات من الصور في طائرات التنسيق مختلفة قليلا (ض مداخن). وdeconvolved كل ض المكدس رقميا لزيادة القرار. ميزة واحدة من 3D مرور الزمن (4D) التصوير هو تتبع دقيق من العضيات تتحرك أو غيرها من الهياكل. عند تعيين بشكل صحيح حتى والهياكل المصورة لا يخرجون من التركيز، والحركة في كل الاتجاهات الثلاثة يمكن ملاحظتها وقياسها. وبالتالي فإنه من المستحيل لهيكل الملون لتختفي على واحد أو أكثر من لقطة مرور الزمن بمجرد الانجراف أعلاه أو أدناه البؤري الضيقة. يخدم الأسلوب أيضا كأداة حساسة لتقييم التفاعلات وممكن فوسيون هياكل صغيرة. epifluorescence التقليدية أو الصور متحد البؤر هياكل بالقرب من الحد حيود (بضع مئات نانومتر) لا تؤكد الانصهار حتى لو تظهر الصور اندمجت التداخل من التسميات كل منهما ^3. ويقترح الانصهار، ولكنه لا يزال من الممكن أن يتم فصل الكائنات أفقيا أو رأسيا لمسافة التي هي أقل من الحد الحيود. ثلاثة أو التصوير رباعي الأبعاد، في المقابل، يسمح بمشاهدة الكائنات في كل من ثلاثة اتجاهات متعامدة. مظهر الانصهار في جميع وجهات النظر الثلاثة يزيد من مستوى اليقين. وفي بعض الاستعدادات المعيشة، وجهت الحركة البراونية أو الأجسام تنصهر مزعومة يوفر دليلا آخر عند نقل كل التسميات معا في الوقت المناسب. بطبيعة الحال، عندما بالقرب من الحد حيود مستوى اليقين في الهياكل المميزين من الخلفية، أو التي تبين أنها تحتوي على اثنين من الأصباغ (الانصهار)، ليست مطلقة. إذا، تقنيات متخصصة للتطبيق، مثل مضان بالرنين نقل الطاقة (الحنق)^4، هي أكثر ملاءمة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد وصمة عار مع الأصباغ فوق حيوي

1. لبروتوكول تشريح سام ثعبان رؤية ستيوارت وآخرون. ⁵ وتنغ وآخرون لا يزال ⁶ الأنسجة زاحف الفسيولوجية لأوقات أطول، وأقل التلوث الجرثومي، عندما يحتفظ بها في درجات حرارة منخفضة (انظر أدناه). وعادة ما يتم الاحتفاظ أنسجة الثدييات في درجة حرارة الغرفة أو أعلى.
2. لالليزوزومية صبغ تلطيخ الحيوية، ويحل الصبغة في البرد الزواحف 1:5،000 الحل قارعو الأجراس (0.2 ميكرومتر). احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. يغسل عدة مرات مع قارعو الأجراس الباردة. صورة في أقرب وقت ممكن.
3. لFM1-43 تلطيخ باستخدام التحفيز بوكل، ويخفف من الصبغة في عالية بوكل-قارعو الأجراس 1:500 (7 ميكرومتر). احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30-60 ثانية كحد أقصى. يغسل ثلاث مرات بسرعة مع قارعو الأجراس الباردة، ~ 1 دقيقة / الشطف. صورة في أقرب وقت ممكن.
4. لFM1-43 تلطيخ باستخدام مفرط التوتر (السكروز) التحفيز، ويخفف من الصبغة في 0.5 M قارعو الأجراس السكروز على النحو الوارد أعلاه. احتضان عند 4 & #176؛ مئوية لمدة 2-5 دقيقة. يغسل كما في الخطوة 1.3 أعلاه مع قارعو الأجراس الباردة. صورة في أقرب وقت ممكن.
5. لFM1-43 تلطيخ عبر التحفيز الكهربائي، انظر تنغ وآخرون. ⁶ لفترة وجيزة، يتم وضع إعداد طبق يحتوي على محلول ملحي الفسيولوجية والصبغة. يتم تحفيز العصب مع قطار مبرمج مسبقا من 200 μsec البقول مستطيلة (~ 7 V، 30 هرتز، 18 μsec). يغسل كما في الخطوة 1.3 أعلاه مع قارعو الأجراس الباردة. صورة في أقرب وقت ممكن.

2. تكوين إعداد للتصوير

1. توجيه إعداد بحيث هياكل الفائدة في أقرب وقت ممكن إلى الهدف المجهر.
2. إذا تم استخدام مجهر مقلوب، واستخدام غرفة التي تحتوي على رقيقة جولة زلة تغطية القاع. عادة، يجب أن يكون غرفة التصوير رقيقة أسفل الفولاذ المقاوم للصدأ مع 25 مم # 1 كوب سمك الغطاء زلة في المركز. إذا تم استخدام المجهر تستقيم، لا يشترط ساترة القاع ولكن من المفيدللسماح التصوير مع ضوء المنقولة (مثل تدخل الفرق النقيض من ذلك، DIC) لتوجيه العينة وتحديد مواقع الأشياء المثيرة للاهتمام.
3. اختيار الهدف المناسب للحصول على أعلى دقة ممكنة 3D. هناك مفاضلات بين الفتحة العددية (غير متوفر)، بعد العمل، التكبير، ونوع من عدسة (الجاف، المياه والنفط الغمر). لمستحضرات رقيقة مثل مزارع الأنسجة، والأهداف النفط هي الأفضل. باستخدام المجهر تستقيم، تطفو زلة تغطية على حمام مائي، واستخدام زيت الغمر بين الجزء العلوي من الغطاء زلة وموضوعية.
4. إذا تم استخدام البرمجيات deconvolution، البائع قد تقدم سلفا انتشار نقطة ظائف (PSFS) لتحقيق أهداف معينة. إذا لم يتم توفير هذه المعلومات، أو إذا ما تم اختيار هدف غير معتمد، وتحديد PSF عن طريق التصوير microdots الفلورسنت أو الأجسام محدودة حيود مماثلة ^7،8.

3. تأسيس العمق المرغوب الميدانية وعدد إيماغيس المرغوب في الوقت الفاصل بين الإطار

1. حدد عمق إجمالي قدره حقل بحيث تتحرك أو التفاعل هياكل الفائدة لا تختفي أو الخروج من التركيز لأنها تتحرك في اتجاه زي. في الميدان ض يجب أن يتجاوز قليلا البعد العمودي للعملية الخلية أو الخلايا التي يجري تصويرها. لمحطات السيارات الفقاريات، 15-20 ميكرومتر هو نموذجي.
2. حساب الخطوة ض محور اللازمة لكل زيادة التركيز. القرار على طول محور ض يختلف تبعا خصائص الهدف؛ فهو يقع في حوالي ربع هذا القرار الطائرة س ص. إذا تم استخدام إما التصوير متحد البؤر أو برامج deconvolution، تم تحسين القرار ض محور. تحسين القرار النهائي من قبل الإفراط المتعمد في اتجاه زي ^5، ولكن انظر أيضا الخطوة 3.3 أدناه. فاصل خطوة نموذجية في نطاق من 400-1،500 نانومتر لأهداف 40-100X. ينبغي أن أغلقت ضوء قبالة بين كل صورة ض الخطوة.
3. حدد عدد الصور في كل ض المكدس، وهما العمق المطلوب من حقل تقسيمقبل الفاصل الخطوة. الوقت لاستكمال نموذجي ض المكدس هو 1-10 ثانية. الأجسام التي تتحرك بسرعة (100 نيوتن متر / ثانية) يمكن أن تظهر واضحة في صورة كومة 3D لأن كل صورة الطائرة يتوافق مع نقطة زمنية مختلفة قليلا. أيضا، يساهم كل صورة إضافية لphotobleaching من والضيائية ممكن (انظر مناقشة). إذا تنتمي إما الوضع، واختيار أكبر ض خطوة لجمع الصور أقل في المكدس. تعويض في وقت لاحق باستخدام برنامج صورة الاستيفاء (الخطوة 6.3 أدناه).

4 حدد الوقت الفاصل بين معدل الإطار

تختار من التجريب المعدل الذي هو مجرد كافية لحل بسلاسة يتغير مع الزمن مثل الحركة، أو تفاعلات الأحداث الانصهار ^9. تحت أخذ العينات يمكن أن تنتج الحركة الفنية (أخطاء أخذ العينات)، في حين أن الإفراط يزيد التعرض للضوء دون داع. جمع إما سلسلة طويلة واحدة أو عدة سلاسل متكررة من نفس التحضير، مع كل فترة زمنية صغيرة نسبيا الوقت الإجمالي ( على سبيل المثال 10 نقاط زمنية × 30 ثانية فاصل = 5 دقائق). إذا كان ذلك ممكنا، مع إعداد عرض مستمر epifluorescence الإضاءة إلى ما يقرب من سرعات الحركة التقدير، بما في ذلك الانجراف من إعداد كامل إذا كان موجودا.

5. أكمل جميع تصوير لايف لإعداد خاص

ولا تزال الاستعدادات الزواحف عادة قوية ل~ 1-2 ساعة، أطول إذا تبريده.

6. تحليل البيانات وفقا لاستخدام المرغوب

1. الاحتفاظ بجميع ملفات البيانات الخام. بينما التخزين الرقمية هي عادة ليست مشكلة، زمن هو كبير حتى مع أجهزة الكمبيوتر الشخصية بسرعة أو محطات العمل. لهذا السبب، والصور المحاصيل في المنطقة ذات الاهتمام [ROI]. أؤكد أن المنطقة بأسرها من الفائدة في إطار اقتصاص خلال طوال الوقت.
2. Deconvolve صورة مداخن باستخدام البرمجيات المناسبة والصحيحة انتشار نقطة وظيفة. تأكيد تم تحسين هذا القرار والتي تم إنشاؤها من قبل أي قطعة أثريةخوارزمية deconvolution. ويبين الشكل 3 مثالا الصور.
3. استخدام خوارزمية الاستيفاء لتوسيع محور ض قرار واضح. واقترح التوسع 6X من الصورة الفعلية 1.5 ميكرون فصل الطائرة إلى 0.25 ميكرون واضحة الانفصال. بدلا من ذلك، استخدام بعض مزيج من الإفراط (الخطوة 3.2) والاستيفاء.
4. أداء النقيض من ذلك، السطوع، وتصفية الضوضاء، photobleaching من التعديلات ومعالجة الصور النمطية الأخرى إذا رغبت في ذلك. معايير التلاعب صورة تملي أنه بالنسبة لمعظم الأعمال العلمية، فمن المناسب أن نفس التصحيحات تطبيقها على جميع الصور، سواء داخل كومة وعند نقاط زمنية مختلفة. ينبغي تقييم نتيجة لتسوية خاصة بين جميع الصور ^9.
5. حدد وضع عرض خاص لتصدير البيانات. العرض الأكثر وضوحا هو الفيديو ستيريو باستخدام إما anaglyphs الأحمر والأخضر أو الأحمر والأزرق (الأمثلة في الشكل 3)، أزواج ستيريو، أو بالتناوب يسار / righإطارات ر العين مع نظارات المصراع. Anaglyphs تقتصر على لون واحد. تعزيز عمق الصورة واضحة إذا رغبت في تحسين محور ض القرار البصرية.
6. تجربة مع مختلف التصفية وتقنيات تعزيز الصورة. على سبيل المثال، والترشيح ابلاس الرياضية مفيد لزيادة النقيض من الهياكل صغيرة فوق الخلفية. ومما يعزز سطوع بكسل في وسط نافذة تشغيل بينما يتم تقليل سطوع المناطق المحيطة بها. نلاحظ أن بعض وسائل التصفية لا تعمل بشكل جيد في الجمع.
7. تطبيق تصحيح الانحراف إذا كان هناك حركة كبيرة للإعداد مع مرور الوقت. هذه الحركة هو شائع في العضلات الحية، حتى مع إضافة الأدوية لقمع إمكانات العمل وإمكانات متشابك. خوارزمية تسجيل بكسل (على سبيل المثال. IMARIS، أدوبي رجعية، TurboReg المساعد ليماغيج) محاذاة الصور الوقت الفاصل بين ويمكن أن تقلل، ولكن عادة لا تقضي تماما، مثل الحركة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

البيانات المعروضة هي من المحطات ثعبان العصبي العضلي (انظر الآراء المنخفضة والعالية التكبير في الشكل 3، وصبغ التقامي (FM1-43) امتصاص يخلق الضباب الذي يملأ كل حبة)، وعلى وجه الخصوص، macroendosomes (MES) والإندوسومات الحمضية (AES) داخل هذه المحطات ^5. يتم إنشاء محلات الص?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الجانب الأكثر أهمية من التصوير 4D هو إدارة مدة وشدة التعرض للضوء. photobleaching من النقصان صورة نسبة الإشارة إلى الضوضاء ويمكن أن يكون مشكلة أم لا اعتمادا على عوامل مختلفة، بما في ذلك اختيار fluorophores. ويرتبط الضرر غير محددة لالأنسجة الحية (الضيائية) لphotobleaching من، ويمكن في بعض ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
SGC5	Biotium, Hayward, CA	70057	Final conc: 10 mM
FM1-43FX	Invitrogen, Carlsbad, CA	F35335	Final conc: 7 mM
LysoTracker Red	Invitrogen, Carlsbad, CA	L7528	Final conc: 0.2 mM
Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl			145 mM
KCl			2.5 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
High KCl Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl			86 mM
KCl			60 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
High Sucrose Ringers pH 7.2
NaCl			145 mM
KCl			2.5 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
Sucrose			0.5 M (17.1 g/50 ml)
Axioplan 200 inverted microscope	Carl Zeiss, Thornwood, NY		www.zeiss.com
N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm	Carl Zeiss, Thornwood, NY		www.zeiss.com
DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher	Sutter Instruments, Novato, CA	175W Xenon arc lamp	www.sutter.com
Lambda 10-2  emission filterwheel switcher	Sutter Instruments, Novato, CA		www.sutter.com
Sensicam CCD camera	Cooke Instruments, Tonawanda, NY		www.cookecorp.com
Cascade 512 CCD camera	Photometrics, Tucson, AZ		www.photometrics.com
Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins
Software
Slidebook 5.0	Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO	Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation	www.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2	Bitplane, South Windsor, CT	Drift correction; 3D and 4D data presentation	www.bitplane.com
AfterEffects CS6	Adobe, San Jose, CA	Drift correction	www.adobe.com
ImageJ 1.46	National Institutes of Health, Bethesda, MD	Multiple plugins available; Stereo pair construction	http://rsbweb.nih.gov/ij
Zeiss LSM	Carl Zeiss, Thornwood, NY	Stereo pair construction	www.zeiss.com