Визуализация эндосоме Dynamics в живых нервных окончаний с Четырехмерное флуоресценции изображений

Резюме

Четырехмерное (4D) визуализация используется для изучения поведения и взаимодействия между двумя типами эндосомах в живых позвоночных нервные окончания. Движение этих небольших структур характеризуется в трех измерениях, позволяя подтверждение событий, таких как эндосом синтеза и экзоцитоза.

Аннотация

Четырехмерное (4D) свет визуализации была использована для изучения поведения малых структур в двигательных нервных терминалов тонкой поперечная мышца живота Подвязки змеи. Сырье данных содержит покадровой последовательности 3D Z-стеки. Каждый стек содержит 4-20 изображений, полученных с эпифлуоресцентной оптике в фокальных плоскостях, разделенных 400-1,500 нм. Шаги в приобретении стеки, таких как настройка фокуса, переключение длин волн возбуждения, и эксплуатация цифровыми камерами, автоматизированы как можно больше, чтобы максимизировать скорость изображения и уменьшения повреждения тканей от воздействия света. После приобретения, набор изображений стеков deconvolved улучшить пространственное разрешение, преобразуется в нужный формат 3D, и используется для создания 4D "кино", который подходит для разнообразных анализов компьютерных, в зависимости от экспериментальных данных стремились. Одним из применений является исследование динамического поведения двух классов эндосомах найденных в нервных окончаниях-macroendosomes (MES)и кислотные эндосомы (НЯ)-чьи размеры (200-800 нм для обоих типов) находятся на или вблизи дифракционного предела. Доступ к 3D информации в каждый момент времени обеспечивает ряд преимуществ по сравнению с обычными покадровой обработки изображений. В частности, размер и скорость движения структур может быть определена количественно с течением времени без потери фокусе. Примеры данных изображений 4D показывают, что МЭ подход плазматическую мембрану и исчезают, что указывает, что они экзоцитозу, а не просто перемещение в вертикальной плоскости от одной плоскости фокуса. Также выявлено является предполагаемый слияние МЧС и ОПЗ, по визуализации перекрытия между двумя красителей, содержащих структур, как видно на каждых трех ортогональных проекций.

Введение

Покадровый визуализации живой ткани обеспечивает визуальный доступ к динамических структурно-функциональных отношений, которые не могут быть оценены в фиксированных или живых препаратов отображаемого в одной точке во времени. Часто, однако, плата за доступ к временной информации является уменьшение оптическим разрешением. Высокие цели масло-погружные числовая апертура непрактичны в живой ткани из-за их узкого круга внимания, оставляя погружение в воду или сухие целей в качестве единственных альтернатив. Кроме того, повышенное разрешение, обеспечиваемая конфокальных оптики не могут быть использованы в некоторых живых препаратов из-за фототоксичности от относительно высоких уровней освещенности, необходимых ^1,2. Наконец, в то время как несколько в режиме реального времени или покадровой оптические методы доступны, что предложение улучшенное разрешение, их применимость ограничена препаратов, где структуры интересов могут быть расположены в пределах нескольких сотен нанометров в цели ^1. Способ, описанныйиспользует относительно недорогое оборудование, является универсальным, но предлагает улучшенное разрешение по сравнению с более часто используемых методов покадровой. Он предназначен для использования в отдельных лабораторий, а также изображений объектов.

Способ использует обычную эпифлюорисцентной микроскопии, в сочетании с чувствительным цифровой камеры и с средств, предназначенных для быстро приобретать наборы изображений при слегка различных фокальных плоскостях (Z-стеки). Каждый Z-Stack имеет цифровую deconvolved увеличить разрешение. Одной из особенностей 3D покадровой (4D) изображений является точным сопровождение движущихся органеллы или другие структуры. При правильной настройке, распечатанных структуры не идут не в фокусе, и движение во всех трех направлениях можно наблюдать и количественно. Таким образом, невозможно для окрашенных структура исчезнуть в течение одного или нескольких покадровой кадров просто дрейфующими выше или ниже узкой фокальной плоскости. Способ также служит в качестве чувствительного инструмента для оценки взаимодействия и возможного фуСион малых структур. Обычные эпифлуоресцентная или конфокальной образы структур вблизи дифракционного предела (несколько сотен нм) не подтверждают слияние даже если объединены изображения показывают перекрытие их соответствующих этикеток ^3. Fusion предлагается, но остается возможность, что объекты разделены горизонтально или вертикально на расстоянии, которая находится ниже дифракционного предела. Три или четыре-мерной визуализации, напротив, допускает просмотр предметов в каждом из трех ортогональных направлений. Появление синтеза во всех трех видах повышает уровень достоверности. И, в некоторых живых препаратов, направленных или броуновское движение предположительно конденсированных объектов предоставляет дополнительные доказательства, когда обе метки двигаться вместе со временем. Конечно, когда рядом с дифракционного предела уровень определенности в требовательных структур из фоне, или показывая, что они содержат две красители (фьюжн), не является абсолютным. Если это применимо, специализированные методы, такие как флуоресценции резонансной передачи энергии (FRET)^4, являются более подходящими.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Пятно препарат с суправитальной красителей

1. Для протокола вскрытия подвязка змея см. Stewart и соавт. ⁵ и Teng соавт. ⁶ Reptilian ткани остается физиологический течение более длительного времени, и с меньшим бактериального заражения, при хранении при низких температурах (см. ниже). Тканей млекопитающего, как правило, выдерживают при комнатной температуре или выше.
2. Для окрашивания жизненно красителя лизосом, растворить краситель в холодных рептилий решений 1:5000 звонари (0,2 мкм). Инкубировать при 4 ° С в течение 15 мин. Промывают несколько раз холодной Ringers. Изображение как можно скорее.
3. Для FM1-43 окрашивания с использованием KCl стимуляции, разбавить краску в высокой KCl Ringers 1:500 (7 мкм). Инкубируют при 4 ° С в течение 30-60 сек максимума. Вымойте быстро три раза с холодными Ringers, ~ 1 мин / полоскания. Изображение как можно скорее.
4. Для FM1-43 окрашивания с использованием гипертонического (сахароза) стимуляции, разбавить краску в 0,5 М сахарозы Ringers как указано выше. Инкубировать при температуре 4 & #176; С в течение 2-5 мин. Вымойте, как в пункте 1.3 выше с холодными Ringers. Изображение как можно скорее.
5. Для окрашивания FM1-43 с помощью электрической стимуляции см. Teng соавт. ⁶ Вкратце, препарат помещают в чашку, содержащую физиологический солевой раствор и краситель. Нерв стимулировали заданного поезда 200 мкс прямоугольных импульсов (~ 7 В, 30 Гц, 18 мкс). Вымойте, как в пункте 1.3 выше с холодными Ringers. Изображение как можно скорее.

2. Настройте Подготовка к визуализации

1. Ориентируйте препарат так, чтобы структура интерес как можно ближе к объектива микроскопа.
2. Если используется Инвертированный микроскоп, использовать камеру снизу которого содержит тонкую круглую крышку скольжения. Как правило, камера визуализации должны иметь тонкий из нержавеющей стали дно с 25 мм Диаметр # 1 толщина стекла покровным в центре. Если используется прямой микроскоп, нижнюю покровное не требуется, но полезноразрешить изображений с проходящего света (например, дифференциальное отличие вмешательства, ДВС-синдром), чтобы ориентировать образец и найти объекты, представляющие интерес.
3. Выберите подходящий цели, чтобы получить максимально возможную 3D разрешение. Есть компромиссы среди числовой апертурой (NA), рабочее расстояние, увеличения и тип объектива (сухой, водо-и масло-погружение). Для тонких препаратами типа тканевых культур, задачи на нефть являются лучшими. Использование прямой микроскоп, плавать покровное стекло на водной бане, и использовать иммерсионное масло между верхней части покровного стекла и цели.
4. Если используется деконволюция программного обеспечения, поставщик может обеспечить заданные функции рассеяния точки (НПФ) для определенных целей. Если такая информация не предоставляется, или если поддерживается цель выбрана, определить PSF по визуализации люминесцентных микроточки или аналогичные дифракционной объекты ^7,8.

3. Установите требуемую глубину резкости и количества ИмаГЭС Желаемые за время покадровой Рамка

1. Выберите общую глубину резкости, чтобы двигаться или взаимодействующих структур интерес не исчезают или не в фокусе, как они двигаются в направлении оси г. Г-поле должно слегка превышать вертикальный размер процесса клетки или клеточной которая отображается. Для позвоночных клеммах двигателя, 15-20 мкм характерно.
2. Вычислить шаг Z-оси, необходимое для каждого приращения фокусе. Разрешение по оси изменяется в зависимости от свойств цели; это примерно одна четвертая часть ху резолюции плоскости. Если один конфокальной микроскопии или деконволюция программное обеспечение используется, улучшается разрешение ось г. Улучшение окончательное решение преднамеренным передискретизации в направлении оси г ^5, но см. также шаг 3,3 ниже. Типичный интервал шага находится в диапазоне от 400-1,500 нм для целей 40-100X. Свет должен быть закрыты от между каждой г-ступенчатой ​​изображения.
3. Выберите количество изображений в Z-Stack, а именно требуемую глубину резкости делитсяна шаг интервала. Время для завершения типичный Z-Stack составляет 1-10 сек. Быстродвижущихся объектов (100 нм / с) может быть нерезким в 3D стека изображений, потому что каждый самолет изображение соответствует несколько иной момент времени. Кроме того, каждый дополнительный изображений способствует фотообесцвечивания и возможного фототоксичности (см. Обсуждение). Если один ситуация сложилась, выбрать больший Z-стадию сбора меньше кадров в стеке. Компенсировать позже с помощью интерполяции изображений программное обеспечение (шаг 6.3 ниже).

4. Выберите Покадровый Frame Rate

Выбрать по экспериментам тариф, который просто соответствует плавно решить изменения во времени, такие как движения, взаимодействия или событий термоядерных ^9. Под выборки может производить артефакты движения (ошибки выборки), в то время как передискретизация излишне увеличивает воздействие света. Сбор либо одну длинную последовательность или несколько повторяющихся последовательностей из того же препарата, каждый из которых имеет сравнительно небольшой общей временном интервале ( например, 10 моментов времени × 30 с интервалом = 5 мин). Если это возможно, просмотреть препарат с непрерывного освещения эпифлуоресцентной до грубо скоростей движения сметной, в том числе дрейфа всей подготовки, если присутствует.

5. Заполните все Живая съемка для конкретного препарата

Рептильные препараты обычно оставаться устойчивым в течение ~ 1-2 часов, дольше, если охлаждением.

6. Анализ данных в соответствии с желаемого использования

1. Сохраните все файлы исходных данных. В то время как цифровой запоминающий обычно не проблема, время обработки составляет значимой даже с быстрыми персональных компьютеров или рабочих станций. По этой причине, обрезать изображения в интересующей нас области [ROI]. Убедите, что весь регион представляет интерес в кадрированной окна в течение всего курса времени.
2. Деконволюции изображения стеки помощью соответствующего программного обеспечения и правильной функции рассеяния точки. Убедитесь, что разрешение улучшается и что ни артефакт не была сформированаАлгоритм деконволюция. Рисунок 3 показывает пример изображения.
3. Используйте алгоритм интерполяции расширить ось г кажущуюся разрешение. Расширение 6X от фактического изображения 1,5 мкм плоскости разделения на очевидной 0,25 разделения мкм предлагается. Вместо этого можно использовать определенное сочетание избыточной дискретизации (шаг 3.2) и интерполяции.
4. Выполните контрастность, яркость, фильтрацию шумов, фотообесцвечивания и другие типичные настройки обработки изображений при желании. Image стандарты манипуляции диктуют, что для большинства научных работ, целесообразно, чтобы одни и те же исправления применяться ко всем изображениям, как в стеке и в различные моменты времени. Следствием конкретной регулировки следует оценивать среди всех изображений ^9.
5. Выберите конкретный режим отображения для экспорта данных. Самый простой дисплей стерео видео с использованием либо красно-зеленый или красно-синие анаглифы (примеры на рисунке 3), стерео пары или переменного влево / Рогт глаз кадры с затворных очков. Анаглифов ограничены одноцветных. Повышение кажущуюся глубину изображения при желании улучшить ось г визуальный разрешение.
6. Поэкспериментируйте с различными методами улучшения фильтрации и изображения. Например, оператор Лапласа фильтрации можно использовать для увеличения контрастности небольших структур выше фона. Яркость пикселей при центре работает окне усиливается в то время как яркость прилегающих районах снижается. Обратите внимание, что некоторые методы фильтрации работают не очень хорошо в комбинации.
7. Применение коррекции дрейфа если существует значительная движение препарата с течением времени. Такое движение является общим в живых мышцы, даже с препараты добавил подавить потенциалы действия и синаптические потенциалы. Алгоритм регистрации пикселей (например,. Imaris, Adobe AfterEffects, TurboReg плагин для ImageJ) выравнивает покадровой изображения и может уменьшить, но, как правило, не полностью устранить, такое движение.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Данные, приведенные в от змея нервно-мышечных терминалов (см. низкие и высокие виды увеличения изображения на рисунке 3; эндоцитотический краситель (FM1-43) поглощение создает туман, который заполняет каждый Bouton) и, в частности, macroendosomes (MES) и кислотные эндосомы (НЯ) в этих терминала?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Наиболее важным аспектом визуализации 4D является управление от продолжительности и интенсивности освещенности. Фотообесцвечивание уменьшается соотношение изображения сигнал-шум и может быть проблематичным или нет в зависимости от различных факторов, в том числе выбора флуорофорам...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
SGC5	Biotium, Hayward, CA	70057	Final conc: 10 mM
FM1-43FX	Invitrogen, Carlsbad, CA	F35335	Final conc: 7 mM
LysoTracker Red	Invitrogen, Carlsbad, CA	L7528	Final conc: 0.2 mM
Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl			145 mM
KCl			2.5 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
High KCl Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl			86 mM
KCl			60 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
High Sucrose Ringers pH 7.2
NaCl			145 mM
KCl			2.5 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
Sucrose			0.5 M (17.1 g/50 ml)
Axioplan 200 inverted microscope	Carl Zeiss, Thornwood, NY		www.zeiss.com
N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm	Carl Zeiss, Thornwood, NY		www.zeiss.com
DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher	Sutter Instruments, Novato, CA	175W Xenon arc lamp	www.sutter.com
Lambda 10-2  emission filterwheel switcher	Sutter Instruments, Novato, CA		www.sutter.com
Sensicam CCD camera	Cooke Instruments, Tonawanda, NY		www.cookecorp.com
Cascade 512 CCD camera	Photometrics, Tucson, AZ		www.photometrics.com
Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins
Software
Slidebook 5.0	Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO	Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation	www.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2	Bitplane, South Windsor, CT	Drift correction; 3D and 4D data presentation	www.bitplane.com
AfterEffects CS6	Adobe, San Jose, CA	Drift correction	www.adobe.com
ImageJ 1.46	National Institutes of Health, Bethesda, MD	Multiple plugins available; Stereo pair construction	http://rsbweb.nih.gov/ij
Zeiss LSM	Carl Zeiss, Thornwood, NY	Stereo pair construction	www.zeiss.com