Visualización de la Dinámica en Endosoma Vivir terminaciones nerviosas con imágenes de fluorescencia en cuatro dimensiones

Resumen

Cuatro dimensiones (4D) de formación de imágenes se utiliza para estudiar el comportamiento y las interacciones entre los dos tipos de endosomas en los terminales nerviosos de vertebrados vivían. Movimiento de estas pequeñas estructuras se caracteriza en tres dimensiones, permitiendo la confirmación de eventos tales como la fusión endosoma y la exocitosis.

Resumen

Cuatro dimensiones (4D) de imágenes de luz se ha utilizado para estudiar el comportamiento de las pequeñas estructuras dentro de las terminaciones nerviosas motoras del transverso del abdomen delgado muscular de la serpiente de liga. Los datos en bruto comprende secuencias de time-lapse de z-pilas 3D. Cada pila contiene 4-20 imágenes adquiridas con la óptica de epifluorescencia en planos focales separados por 400-1,500 nm. Los pasos en la adquisición de pilas de imágenes, tales como el ajuste de enfoque, la conmutación de longitudes de onda de excitación, y el funcionamiento de la cámara digital, se automatizan tanto como sea posible para maximizar la velocidad de imagen y minimizar el daño de tejido de exposición a la luz. Después de la adquisición, un conjunto de pilas de imágenes se deconvolved para mejorar la resolución espacial, la convierte al formato 3D deseada, y se utiliza para crear una "película" 4D que es adecuado para una variedad de análisis basados ​​en computadoras, dependiendo de los datos experimentales se persiguen. Una aplicación es el estudio del comportamiento dinámico de dos clases de endosomas encontrados en terminales nerviosas-macroendosomes (MES)y endosomas ácidos (AA)-cuyos tamaños (200-800 nm para ambos tipos) están en o cerca del límite de difracción. Acceso a la información 3D en cada momento ofrece varias ventajas sobre time-lapse convencional. En particular, el tamaño y la velocidad de movimiento de las estructuras pueden ser cuantificados en el tiempo sin pérdida de enfoque nítido. Ejemplos de datos de formación de imágenes 4D revelan que las ME se acercan a la membrana plasmática y desaparecen, lo que sugiere que se exocitado en lugar de simplemente moviendo verticalmente lejos de un único plano de enfoque. También reveló es la fusión putativo del MES y EA, por la visualización de superposición entre las dos estructuras que contienen un colorante tal como se ve en cada una de tres proyecciones ortogonales.

Introducción

Time-lapse de tejido vivo proporciona acceso visual a dinámicas relaciones estructura-función que no se puede apreciar en los preparativos fijos o que viven fotografiados en un solo punto en el tiempo. A menudo, sin embargo, la compensación para el acceso a la información temporal es una disminución en la resolución óptica. Altos objetivos de inmersión en aceite apertura numérica no son prácticos en los tejidos vivos debido a su estrecho rango de enfoque, dejando a la inmersión en agua o los objetivos secos como las únicas alternativas. Por otra parte, el aumento de la resolución proporcionada por la óptica confocal no puede ser utilizado en algunas preparaciones de vida debido a la fototoxicidad de los niveles relativamente altos de iluminación requerida ^1,2. Por último, mientras que varias técnicas ópticas en tiempo real o con lapso de tiempo están disponibles que ofrecen una mayor resolución, su aplicabilidad se limita a las elaboraciones en las estructuras de interés se puede colocar dentro de unos pocos cientos de nanómetros de objetivo ^1. El método descritohace uso de un equipo relativamente de bajo costo, es versátil, sin embargo, ofrece una resolución mejorada en comparación con las técnicas de time-lapse de uso común más. Está diseñado para su uso en laboratorios individuales, así como las instalaciones de formación de imágenes.

El método utiliza la microscopía de epifluorescencia convencional, combinado con una cámara digital sensible y con hardware diseñado para adquirir rápidamente los conjuntos de imágenes en momentos ligeramente diferentes planos focales (Z-pilas). Cada z-stack se deconvolved digitalmente para aumentar la resolución. Una característica de las imágenes en 3D de lapso de tiempo (4D) es un seguimiento preciso de los orgánulos u otras estructuras en movimiento. Si se configuran correctamente, estructuras proyectadas no salen fuera de foco, y el movimiento en las tres direcciones pueden ser observados y cuantificados. Por lo tanto es imposible que una estructura manchado a desaparecer en uno o más marcos de lapso de tiempo simplemente por la deriva por encima o por debajo de un plano focal estrecho. El método también sirve como una herramienta sensible para la evaluación de las interacciones y posible Fusión de las estructuras pequeñas. Epifluorescencia convencional o confocal de imágenes de estructuras cerca del límite de difracción (unos pocos cientos de nm) no confirman fusión aunque las imágenes fusionadas muestran la superposición de sus respectivas etiquetas ^3. Se sugiere la fusión, pero sigue siendo posible que los objetos están separados horizontalmente o verticalmente por una distancia que está por debajo del límite de difracción. Tres-o formación de imágenes de cuatro dimensiones, en contraste, permite ver los objetos en cada una de tres direcciones ortogonales. La aparición de la fusión en todos los tres puntos de vista aumenta el nivel de certeza. Y, en algunas preparaciones de vida, dirigió o movimiento browniano de objetos supuestamente fusionados proporciona una prueba más de que ambas etiquetas se mueven juntos en el tiempo. Por supuesto, cuando está cerca del límite de difracción del nivel de certeza en las estructuras exigentes de fondo, o demostrando que contienen dos tintes (de fusión), no es absoluta. Si, técnicas especializadas aplicables, tales como la fluorescencia de resonancia la transferencia de energía (FRET)^4, son más apropiados.

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Protocolo

1. Teñir la preparación con supravital Colorantes

1. Para el protocolo de disección culebra ver Stewart et al. ⁵ y Teng et al. ⁶ tejido reptil permanece fisiológica durante tiempos más largos y con menos contaminación bacteriana, cuando se mantiene a bajas temperaturas (véase más adelante). Tejidos de mamíferos por lo general se mantiene a temperatura ambiente o superior.
2. Para lisosomal tinción colorante vital, disolver el colorante en 1:5.000 fríos reptiles Timbres solución (0,2 M). Incubar a 4 º C durante 15 min. Lavar varias veces con Ringers fríos. Imagen tan pronto como sea posible.
3. Para FM1-43 tinción utilizando KCl estimulación, diluir el colorante en alta KCl Ringers 1:500 (7 M). Incubar a 4 º C durante 30-60 seg máximo. Lave rápidamente tres veces con Ringers fríos, ~ 1 min / aclarado. Imagen tan pronto como sea posible.
4. Para FM1-43 tinción utilizando hipertónica (sacarosa) la estimulación, diluir el colorante en 0,5 M de sacarosa Ringers que el anterior. Incubar a 4 y #176; C durante 2-5 min. Lavar como en el paso 1.3 anterior con Ringers fríos. Imagen tan pronto como sea posible.
5. Para la tinción de FM1-43 a través de la estimulación eléctrica, ver Teng et al. ⁶ Brevemente, la preparación se coloca un plato que contiene la solución salina fisiológica y el colorante. El nervio se estimula con un tren preprogramado de 200 microsegundos pulsos rectangulares (~ 7 V, 30 Hz, 18 microsegundos). Lavar como en el paso 1.3 anterior con Ringers fríos. Imagen tan pronto como sea posible.

2. Configure la Preparación de la Imagen

1. Orientar la preparación de modo que las estructuras de interés están tan cerca como sea posible del objetivo del microscopio.
2. Si se utiliza un microscopio invertido, utilizar una cámara cuyo fondo contiene una delgada hoja de la cubierta redonda. Normalmente, la cámara de imágenes debe tener un fondo de acero inoxidable fino con un diámetro de 25 mm # 1 vaso de espesor cubierta de resbalón en el centro. Si se utiliza un microscopio vertical, no se requiere un cubreobjetos parte inferior, pero es útilpara permitir la formación de imágenes con luz transmitida (por ejemplo, el contraste de interferencia diferencial, DIC) para orientar la muestra y localizar objetos de interés.
3. Elija un objetivo apropiado para obtener la resolución más alta posible en 3D. Hay ventajas y desventajas entre la apertura numérica (NA), distancia de funcionamiento, ampliación, y el tipo de lente (seco, sin agua y de inmersión en aceite). Para las preparaciones finas como cultivos de tejidos, los objetivos del petróleo son los mejores. Usando un microscopio vertical, flotar una hoja de cubierta en el baño acuoso, y el uso de aceite de inmersión entre la parte superior de la hoja de la cubierta y el objetivo.
4. Si se utiliza el software de deconvolución, el proveedor podría proporcionar funciones de dispersión de punto predeterminado (PSF) para ciertos objetivos. Si no se proporciona dicha información, o si se elige un objetivo compatible, determinar el PSF por imágenes micropuntos fluorescentes u objetos de difracción limitada similares ^7,8.

3. Establecer la profundidad de campo deseada y número de Imabios deseados por Frame Time-lapse

1. Seleccione la profundidad total del campo de manera que moviendo o interactuar estructuras de interés no desaparecen o ir fuera de foco a medida que avanzan en la dirección z. El campo z debe exceder ligeramente la dimensión vertical del proceso celular o célula se va a examinar. Para terminales del motor de vertebrados, 15-20 micras es típico.
2. Calcular el paso del eje z necesaria para cada incremento de foco. Resolución en el eje z varía dependiendo de las propiedades del objetivo; se trata de una cuarta parte de la resolución del plano xy. Si se utiliza ya sea de imagen confocal o software de deconvolución, se mejora la resolución del eje z. Mejorar la resolución final por sobremuestreo deliberada en la dirección z ^5, pero véase también el paso 3.3. Un intervalo de paso típico es en el intervalo de 400-1,500 nm para objetivos 40-100X. La luz debe ser cerró off entre cada imagen z a paso.
3. Seleccione el número de imágenes por z-stack, es decir, la profundidad de campo deseada divididapor el intervalo de paso. Tiempo para completar un típico z-stack es 1-10 seg. Objetos en rápido movimiento (100 nm / seg) pueden aparecer borrosa en una pila de imágenes en 3D, ya que cada plano de la imagen corresponde a un punto de tiempo ligeramente diferente. Además, cada imagen adicional contribuye a photobleaching y posible fototoxicidad (ver Discusión). Si cualquiera de estas situaciones corresponde, elija una más grande z paso para recoger menos imágenes por pila. Compensar más tarde el uso de software de interpolación de imágenes (paso 6.3).

4. Seleccione la Time-lapse Frame Rate

Elija por experimentación de una tasa que es sólo adecuada para resolver problemas cambios con el tiempo tales como el movimiento, las interacciones o acontecimientos de fusión ^9. Bajo el muestreo puede producir artefactos de movimiento (errores de muestreo), mientras que aumenta innecesariamente sobremuestreo exposición a la luz. Recoger ya sea una única secuencia larga o varias secuencias repetidas de la misma preparación, cada uno con un relativamente pequeño intervalo de tiempo total ( por ejemplo, 10 puntos de tiempo x 30 seg intervalo = 5 min). Si es posible, observar la preparación con la iluminación de epifluorescencia continua para calcular aproximadamente las velocidades de movimiento, incluyendo la deriva de toda la preparación si está presente.

5. Completa todos los imágenes en vivo de una preparación particular

Preparaciones reptiles suelen permanecer robusta para ~ 1-2 horas, más si se enfría.

6. Analizar datos según uso deseado

1. Conserve todos los archivos de datos brutos. Mientras que el almacenamiento digital por lo general no es un problema, el tiempo de procesamiento es significativa incluso con los ordenadores personales o estaciones de trabajo rápidos. Por esta razón, las imágenes de los cultivos en una región de interés [ROI]. Asegúrese de que toda la región de interés está en la ventana recortada durante todo el curso del tiempo.
2. Deconvoluir imagen pilas utilizando el software adecuado y la función de dispersión de punto correcto. Confirmar que la resolución se mejora y que ningún artefacto ha sido generada por laalgoritmo de deconvolución. Figura 3 muestra imágenes de ejemplo.
3. Utilice un algoritmo de interpolación para ampliar eje z aparente resolución. Se sugiere una expansión 6X de una imagen 1.5 micras plano de separación real a una aparente separación de 0,25 m. También puede utilizar una combinación de sobremuestreo (paso 3.2) y la interpolación.
4. Lleve a cabo el contraste, el brillo, el filtrado de ruido, fotoblanqueo y otros ajustes típicos de procesamiento de imágenes, si lo desea. Las normas de manipulación de imágenes dictan que para la mayoría de los trabajos científicos, es conveniente que las mismas correcciones se aplicarán a todas las imágenes, tanto dentro de una pila y en diferentes puntos de tiempo. La consecuencia de un ajuste particular, debe evaluarse entre todas las imágenes ^9.
5. Seleccione un modo de pantalla en particular para la exportación de datos. La pantalla más directa es de vídeo estéreo utilizando ya sea anaglifos rojo-verde o rojo-azul (ejemplos en la Figura 3), pares estéreo, o alternando izquierda / right ojo enmarca con gafas de obturación. Anaglifos se limitan a un solo color. Mejorar la profundidad de la imagen aparente si se desea para mejorar la resolución visual eje z.
6. Experimente con diferentes técnicas de mejora de filtrado y de imagen. Por ejemplo, el filtrado de Laplace es útil para aumentar el contraste de las pequeñas estructuras por encima del fondo. El brillo de los píxeles en el centro de una ventana de funcionamiento se mejora mientras que el brillo de las zonas circundantes se reduce. Tenga en cuenta que algunos métodos de filtrado no funcionan bien en combinación.
7. Aplicar corrección de deriva si hay movimiento sustancial de la preparación con el tiempo. Tal movimiento es común en el músculo viviente, incluso con fármacos añadidos para suprimir los potenciales de acción y potenciales sinápticos. Un algoritmo de registro de píxeles (por ejemplo. Imaris, Adobe AfterEffects, TurboReg plug-in para ImageJ) alinea las imágenes con lapso de tiempo y puede reducir, pero por lo general no elimina completamente, tal movimiento.

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Resultados

Los datos mostrados son de los terminales neuromusculares serpiente (ver puntos de vista baja y alta magnificación en la Figura 3, el tinte endocítica (FM1-43) la absorción crea una neblina que llena cada bouton) y, en particular, macroendosomes (MES) y endosomas ácidos (AA) dentro de estos terminales ^5. MEs son creados por endocitosis mayor durante la actividad neuronal ¹⁰ y su número disminuye exponencialmente con el tiempo después de la actividad ha cesado ^6. El...

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Discusión

El aspecto más crítico de imágenes 4D es la gestión de la duración e intensidad de la exposición a la luz. Photobleaching disminuye imagen con una relación de señal a ruido y puede ser problemático o no dependiendo de varios factores, incluyendo la elección de fluoróforos. Daños no específica al tejido vivo (fototoxicidad) está relacionada con photobleaching, y, a veces puede ser identificado utilizando sondas fluorescentes diseñados para el propósito ^2,12 o mediante el examen de la morfologí...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
SGC5	Biotium, Hayward, CA	70057	Final conc: 10 mM
FM1-43FX	Invitrogen, Carlsbad, CA	F35335	Final conc: 7 mM
LysoTracker Red	Invitrogen, Carlsbad, CA	L7528	Final conc: 0.2 mM
Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl			145 mM
KCl			2.5 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
High KCl Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl			86 mM
KCl			60 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
High Sucrose Ringers pH 7.2
NaCl			145 mM
KCl			2.5 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
Sucrose			0.5 M (17.1 g/50 ml)
Axioplan 200 inverted microscope	Carl Zeiss, Thornwood, NY		www.zeiss.com
N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm	Carl Zeiss, Thornwood, NY		www.zeiss.com
DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher	Sutter Instruments, Novato, CA	175W Xenon arc lamp	www.sutter.com
Lambda 10-2  emission filterwheel switcher	Sutter Instruments, Novato, CA		www.sutter.com
Sensicam CCD camera	Cooke Instruments, Tonawanda, NY		www.cookecorp.com
Cascade 512 CCD camera	Photometrics, Tucson, AZ		www.photometrics.com
Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins
Software
Slidebook 5.0	Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO	Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation	www.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2	Bitplane, South Windsor, CT	Drift correction; 3D and 4D data presentation	www.bitplane.com
AfterEffects CS6	Adobe, San Jose, CA	Drift correction	www.adobe.com
ImageJ 1.46	National Institutes of Health, Bethesda, MD	Multiple plugins available; Stereo pair construction	http://rsbweb.nih.gov/ij
Zeiss LSM	Carl Zeiss, Thornwood, NY	Stereo pair construction	www.zeiss.com