Visualisierung der Endosomen Dynamics in lebenden Nerven Klemmen mit Vier-dimensionale Fluoreszenz-Imaging

Zusammenfassung

Vierdimensionalen (4D)-Bildgebung verwendet werden, um das Verhalten und die Interaktionen zwischen den zwei Arten von Endosomen in lebenden Wirbeltier-Nervenenden zu studieren. Bewegung dieser kleinen Strukturen in drei Dimensionen gekennzeichnet, wodurch Bestätigung von Veranstaltungen wie Endosomen Fusion und Exozytose.

Zusammenfassung

Vierdimensionalen (4D)-Bildgebung Licht verwendet wurde, um das Verhalten von Kleinstrukturen im motorischen Nervenenden der dünnen trans studieren abdominis des Strumpfbandnatter. Raw-Daten umfasst Zeitraffer-Sequenzen von 3D-z-Stacks. Jeder Stapel enthält 4-20 Bilder mit Epifluoreszenz Optik bei Brennebenen von 400-1,500 nm getrennt erworben. Schritte bei der Erfassung von Bildstapeln, wie beispielsweise die Einstellung des Fokus, Schalten der Anregungswellenlängen, und der Betrieb der Digitalkamera, so weit wie möglich, die Bildrate zu maximieren und Gewebeschäden durch Lichteinwirkung zu minimieren automatisiert. Nach der Übernahme wird ein Satz von Bildstapeln entfaltet, um räumliche Auflösung zu verbessern, umgerechnet auf die gewünschte 3D-Format und verwendet, um ein 4D "-Film," dass ist geeignet für eine Vielzahl von computerbasierten Analysen, je nach den experimentellen Daten gesucht erstellen. Eine Anwendung ist das Studium der Dynamik von zwei Klassen von Endosomen in den Nervenenden-macroendosomes gefunden (MES)und saure Endosomen (AES), deren Größen (200-800 nm für beide Typen) sind an oder nahe der Beugungsgrenze. Zugriff auf 3D-Informationen zu jedem Zeitpunkt bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Zeitraffer-Bildgebung. Insbesondere, Größe und Geschwindigkeit der Bewegung der Strukturen über die Zeit ohne Verlust von Schärfe quantifiziert werden. Beispiele für Daten aus 4D-Bildgebung zeigen, dass KU nähern sich der Plasmamembran und verschwinden, was darauf hindeutet, dass sie eher als exocytosed einfach vertikal bewegt weg von einer Ebene des Fokus. Auch offenbart ist putative Fusions MES und AES, durch Visualisierung der Überlappung zwischen den beiden Farbstoff-enthaltenden Strukturen, wie in je drei orthogonalen Projektionen angesehen.

Einleitung

Zeitraffer-Bildgebung von lebenden Gewebe bietet visuelle Zugriff auf dynamische Struktur-Funktions-Beziehungen, die nicht in festen Zubereitungen oder leben in einem einzigen Punkt in der Zeit abgebildet geschätzt werden kann. Oft aber der Kompromiss für den Zugriff auf Zeitinformation ist eine Abnahme der optischen Auflösung. Hoher numerischer Apertur Öl-Immersionsobjektive sind unpraktisch in lebendem Gewebe wegen ihrer engen Bereich der Schwerpunkt, so dass Eintauchen in Wasser oder Trocken Ziele als die einzigen Alternativen. Darüber hinaus kann die erhöhte Auflösung durch konfokale Optik lieferte in einigen Lebens Vorbereitungen durch Phototoxizität von dem relativ hohen Niveau der Beleuchtung erforderlich ^1,2 verwendet werden. Schließlich, während mehrere Echtzeit oder Zeitraffer-optische Techniken zur Verfügung, die eine verbesserte Auflösung bieten, ihre Anwendbarkeit auf Zubereitungen, für die Strukturen von Interesse nur wenige hundert Nanometer von der ^Ziel-1 positioniert werden beschränkt. Das beschriebene Verfahrenmacht von relativ kostengünstigen Ausrüstung ist vielseitig und bietet dennoch eine verbesserte Auflösung im Vergleich zu gebräuchlicheren Zeitraffertechniken. Es ist für den Einsatz in einzelnen Labors sowie Imaging-Einrichtungen vorgesehen.

Das Verfahren verwendet herkömmliche Epifluoreszenzmikroskopie, kombiniert mit einer empfindlichen digitalen Kamera und mit Hardware zur schnellen Sätze von Bildern erfassen mit leicht unterschiedlichen Brennebenen (Z-Stapel). Jedes Z-Stapel wird digital entfaltet, um die Auflösung zu erhöhen. Ein Merkmal der 3D Zeitraffer (4D)-Bildgebung ist präzise Verfolgung bewegter Organellen oder anderen Strukturen. Wenn richtig eingerichtet ist, nicht abgebildeten Strukturen nicht aus dem Fokus zu gehen, und die Bewegung in allen drei Richtungen beobachtet und quantifiziert werden. So ist es unmöglich für einen Bunt Struktur, um über eine oder mehrere Zeitraffer-Frames nur durch Driften über oder unter einem schmalen Brennebene verschwinden. Das Verfahren dient auch als empfindlich für die Beurteilung der Wechselwirkungen und mögliche fusion von kleinen Strukturen. Konventionelle Epifluoreszenz oder konfokale Bilder von Strukturen in der Nähe der Beugungsgrenze (ein paar hundert nm) nicht bestätigen Fusion zusammengeführt, auch wenn Bilder zeigen Überlappung der jeweiligen Etiketten ^3. Fusion vorgeschlagen, aber es weiterhin möglich, dass die Objekte horizontal oder vertikal um eine Distanz, die unterhalb der Beugungsgrenze ist, abgetrennt. Drei-oder vierdimensionalen Abbildung, dagegen ermöglicht die Anzeige der Objekte in jeder der drei orthogonalen Richtungen. Das Aussehen der Fusion in allen drei Ansichten erhöht den Grad der Gewissheit. Und in einigen Lebensmittel, gerichtet oder Brownsche Bewegung der vermeintlich abgesichert Objekte ist ein weiterer Beweis, wenn beide Etiketten in der Zeit zusammen zu bewegen. Natürlich, wenn in der Nähe der Beugungsgrenze das Niveau der Sicherheit in anspruchsvollen Strukturen von Hintergrund oder zeigen, dass sie zwei Farbstoffe (Fusion) enthalten, ist nicht absolut. Ggf. spezielle Techniken, wie Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET)^4, sind besser geeignet.

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Protokoll

1. Stain die Zubereitung mit Supravitalfarbstoffe

1. Für die Strumpfbandnatter Dissektion Protokoll sehen Stewart et al. ⁵ und Teng et al. ⁶ Reptilien-Gewebe bleibt physiologische für längere Zeit und mit weniger bakterielle Verunreinigung, wenn sie bei niedrigen Temperaturen gehalten (siehe unten). Säugergewebe wird üblicherweise bei Raumtemperatur oder höher gehalten wird.
2. Für lysosomale Vitalfarbstoff-Färbung, lösen den Farbstoff in kalten Reptilien Ringer-Lösung 1:5000 (0,2 uM). Inkubieren bei 4 ° C für 15 min. Mehrmals mit kaltem Ringers waschen. Bild so schnell wie möglich.
3. Für FM1-43 Färbung mit KCl-Stimulation, verdünnen den Farbstoff in hoher KCl Ringers 1:500 (7 uM). Inkubieren bei 4 ° C für 30-60 Sekunden maximal. Schnell waschen dreimal mit kaltem Ringers, ~ 1 min / Spülung. Bild so schnell wie möglich.
4. Für FM1-43 Färbung mit hypertoni (Saccharose) Stimulation, verdünnen den Farbstoff in 0,5 M Saccharose Ringers wie oben. Inkubation bei 4 & #176, C für 2-5 min. Wie in Schritt 1.3 oben mit kaltem Ringers. Bild so schnell wie möglich.
5. Für FM1-43-Färbung durch elektrische Stimulation, siehe Teng et al. ^6. Kurz gesagt, wird die Herstellung einer Schale mit physiologischer Kochsalzlösung und der Farbstoff gegeben. Der Nerv wird mit einem vorprogrammierten Zug von 200 Mikrosekunden Rechteckimpulse (~ 7 V, 30 Hz, 18 Mikrosekunden) stimuliert. Wie in Schritt 1.3 oben mit kaltem Ringers. Bild so schnell wie möglich.

2. Konfigurieren Sie die Vorbereitung für Imaging

1. Richten Sie die Vorbereitung so, dass die Strukturen von Interesse sind, so nah wie möglich an der Mikroskopobjektiv.
2. Wenn ein inverses Mikroskop verwendet wird, nutzen eine Kammer, deren Boden enthält eine dünne runde Deckglas. Typischerweise sollte die Abbildungskammer haben eine dünne Edelstahlboden mit einem Durchmesser von 25 mm Dicke Nr. 1 Deckglas in der Mitte. Wenn ein aufrechtes Mikroskop verwendet wird, wird eine Unterdeck nicht erforderlich, aber ist nützlichBildgebung mit Durchlicht ermöglichen (zB Differentialinterferenzkontrast, DIC), um die Probe zu orientieren und suchen Objekte von Interesse.
3. Wählen Sie einen geeigneten Ziel, die höchstmögliche 3D Auflösung zu erhalten. Es gibt Kompromisse zwischen numerischen Apertur (NA), Arbeitsabstand, Vergrößerung und Objektivtyp (trocken, Wasser-und Ölimmersion). Für dünne Präparate wie Gewebekulturen, sind Öl Ziele am besten. Mit einem aufrechten Mikroskop, schweben ein Deckglas auf dem wässrigen Bad, und verwenden Immersionsöl zwischen der Oberseite des Deckglases und dem Ziel.
4. Wenn Entfaltungs Software verwendet wird, kann der Verkäufer vorbestimmten Punktbildfunktionen (PSF) für bestimmte Ziele zu liefern. Wenn keine solche Informationen zur Verfügung gestellt, oder wenn eine nicht unterstützte Ziel gewählt wird, bestimmen die PSF durch bildgebende Fluoreszenzmikropunkte oder ähnliche Objekte beugungsbegrenzten ^7,8.

3. Stellen Sie die gewünschte Schärfentiefe und Anzahl der Images Wunsch pro Zeitraffer-Rahmen

1. Wählen Sie die Gesamttiefe, so dass die Interaktion bewegt oder Strukturen der Interessen nicht verschwinden oder gehen aus dem Fokus, wie sie in der z-Richtung zu bewegen. Die z-Bereich sollte die vertikale Abmessung der Zelle oder Zellfort abzubildenden leicht übersteigen. Für Wirbelmotorklemmen, ist 15-20 um typisch.
2. Berechnen der Z-Achsen-Stufe für jedes Inkrement des Fokus nötig. Auflösung entlang der z-Achse variiert in Abhängigkeit von Eigenschaften des Ziels; es ist etwa ein Viertel der xy-Ebene Auflösung. Wenn entweder konfokale Bildgebung oder Entfaltungs Software verwendet wird, wird der z-Achsenauflösung verbessert. Verbessern endgültige Auflösung durch gezielte Oversampling in der z-Richtung ^5, siehe aber auch unter Schritt 3.3. Eine typische Schrittintervall ist im Bereich von 40 nm für 400-1,500-100X Ziele. Licht sollte während jeder z-Schritt-Bildschalt werden.
3. Wählen Sie die Anzahl der Bilder pro Z-Stapel, nämlich die gewünschte Schärfentiefe geteiltdurch den Schritt Intervall. Zeit, um eine typische Z-Stapel abzuschließen 1-10 sek. Schnell bewegten Objekten (100 nm / s) erscheinen kann in einer 3D-Bildstapel unscharf, da jeder Bildebene entspricht einem etwas anderen Zeitpunkt. Außerdem trägt jede weitere Bild, um Photobleaching und mögliche Phototoxizität (siehe Diskussion). Wenn eine Situation bezieht, wählen Sie eine größere z-Schritt zu weniger Bilder pro Stapel zu sammeln. Kompensieren Sie später mit Bild-Interpolation-Software (Schritt 6.3).

4. Wählen Sie die Zeitraffer-Bildrate

Wählen Sie durch Experimentieren eine Rate, die gerade ausreichend ist, um sich mit der Zeit wie Bewegung, Wechselwirkungen oder Fusionsereignisse ⁹ reibungslos zu lösen. Unter Probenahme von Bewegungsartefakten (Stichprobenfehler) produzieren kann, während Oversampling erhöht unnötigerweise die Belichtung. Sammeln entweder eine einzige lange Sequenz oder mehrerer Wiederholungssequenzen aus der gleichen Zubereitung, die jeweils mit einer relativ kleinen Gesamtzeitintervall ( zB 10 Zeitpunkte x 30 sec Intervall = 5 min). Wenn möglich, zeigen Sie die Vorbereitung mit kontinuierlicher Epifluoreszenz Beleuchtung rund Schätzung Bewegungsgeschwindigkeiten, einschließlich Drift der gesamten Zubereitung, falls vorhanden.

5. Füllen Sie alle Live-Imaging für eine bestimmte Zubereitung

Reptilien-Präparate in der Regel robust bleiben für ca. 1-2 Stunden, länger, wenn gekühlt.

6. Analysieren von Daten gemäß der gewünschten Nutzung

1. Bewahren Sie alle Rohdaten-Dateien. Während digitale Speicher ist in der Regel kein Problem ist, ist die Verarbeitungszeit sogar bei schnellen PCs oder Workstations signifikant. Aus diesem Grund Zuschneiden von Bildern in einer Region von Interesse [ROI]. Sicher, dass die gesamte Region von Interesse ist der Anbau Fenster während der gesamten Zeitverlauf.
2. Zu entfalten Bildstapeln mit der entsprechenden Software und den richtigen Point-Spread-Funktion. Bestätigen Sie, dass die Auflösung verbessert und dass kein Artefakt ist durch die erzeugte wordenEntfaltungsalgorithmus. 3 zeigt Beispiele.
3. Verwenden Sie ein Interpolations-Algorithmus, um z-Achse scheinbare Auflösung erweitern. Ein 6X Expansion von einer tatsächlichen Bild 1,5 um Ebenentrennung zu einer scheinbaren 0,25 um Trennung vorgeschlagen. Alternativ können Sie eine Kombination aus Oversampling (Schritt 3.2) und Interpolation.
4. Führen Sie Kontrast, Helligkeit, Rauschfilterung, Bleichen und andere typische Bildverarbeitungs Anpassungen, falls gewünscht. Bildbearbeitungsstandards schreiben vor, dass für die meisten wissenschaftlichen Arbeiten, ist es angebracht, dass die gleichen Korrekturen sowohl innerhalb eines Stapels und zu verschiedenen Zeitpunkten auf alle Bilder angewendet werden. Die Folge einer bestimmten Einstellung sollte unter allen Bildern ⁹ beurteilt werden.
5. Wählen Sie einen bestimmten Anzeigemodus für den Export von Daten. Die einfachste Display ist mit Stereo-Video entweder Rot-Grün oder Rot-Blau-Anaglyphen (Beispiele in Abbildung 3), Stereo-Paare oder abwechselnd links / Rechtt Augenrahmen mit Shutter-Brille. Anaglyphen sind einfarbige begrenzt. Verbessern scheinbare Bildtiefe, wenn gewünscht, um z-Achse visuelle Auflösung zu verbessern.
6. Experimentieren Sie mit verschiedenen Filter-und Bildverbesserungstechniken. Zum Beispiel ist Laplace-Filterung nützlich, um den Kontrast von kleinen Strukturen über dem Hintergrund zu erhöhen. Die Helligkeit der Pixel in der Mitte eines Fensters ausgeführt wird verbessert, während die Helligkeit der Umgebung reduziert wird. Beachten Sie, dass einige Filtermethoden nicht gut in Kombination zu arbeiten.
7. Bewerben Driftkorrektur, wenn es wesentliche Bewegung der Zubereitung über die Zeit. Diese Bewegung ist in lebenden Muskel häufig, auch mit Drogen gegeben, um Aktionspotentiale und synaptische Potentiale zu unterdrücken. Ein Pixel Registrierungsalgorithmus (z. B.. Imaris, Adobe Aftereffects, TURBOREG Plugin für ImageJ) richtet Zeitraffer-Bilder und kann zu reduzieren, aber in der Regel nicht vollständig beseitigen, wie Bewegung.

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Ergebnisse

Die dargestellten Daten sind aus Schlangenneuromuskuläre Terminals (siehe niedriger und hoher Vergrößerung Blick in Abbildung 3, die endozytischen Farbstoff (FM1-43)-Aufnahme erzeugt eine Trübung, die jeden bouton füllt) und insbesondere macroendosomes (MES) und sauren Endosomen (AEs) innerhalb dieser Klemmen ^5. KU werden von Groß Endozytose neuronale Aktivität während ¹⁰ erstellt, und ihre Zahl sinkt exponentiell mit der Zeit nach Aktivität ⁶ eingestellt. Verwe...

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Diskussion

Der wichtigste Aspekt der 4D-Bildgebung ist das Management von der Dauer und Intensität der Lichteinwirkung. Photobleichen abnimmt Bildsignal-zu-Rausch-Verhältnis und kann problematisch oder nicht in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren, einschließlich der Auswahl der Fluorophore sein. Unspezifische Schäden an lebendem Gewebe (Phototoxizität) auf Photobleaching bezogen, und kann manchmal mit Fluoreszenzsonden für die Zwecke ^2,12 oder durch Prüfung der Morphologie mit geeigneten Hell Optik, wie Diff...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
SGC5	Biotium, Hayward, CA	70057	Final conc: 10 mM
FM1-43FX	Invitrogen, Carlsbad, CA	F35335	Final conc: 7 mM
LysoTracker Red	Invitrogen, Carlsbad, CA	L7528	Final conc: 0.2 mM
Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl			145 mM
KCl			2.5 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
High KCl Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl			86 mM
KCl			60 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
High Sucrose Ringers pH 7.2
NaCl			145 mM
KCl			2.5 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
Sucrose			0.5 M (17.1 g/50 ml)
Axioplan 200 inverted microscope	Carl Zeiss, Thornwood, NY		www.zeiss.com
N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm	Carl Zeiss, Thornwood, NY		www.zeiss.com
DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher	Sutter Instruments, Novato, CA	175W Xenon arc lamp	www.sutter.com
Lambda 10-2  emission filterwheel switcher	Sutter Instruments, Novato, CA		www.sutter.com
Sensicam CCD camera	Cooke Instruments, Tonawanda, NY		www.cookecorp.com
Cascade 512 CCD camera	Photometrics, Tucson, AZ		www.photometrics.com
Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins
Software
Slidebook 5.0	Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO	Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation	www.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2	Bitplane, South Windsor, CT	Drift correction; 3D and 4D data presentation	www.bitplane.com
AfterEffects CS6	Adobe, San Jose, CA	Drift correction	www.adobe.com
ImageJ 1.46	National Institutes of Health, Bethesda, MD	Multiple plugins available; Stereo pair construction	http://rsbweb.nih.gov/ij
Zeiss LSM	Carl Zeiss, Thornwood, NY	Stereo pair construction	www.zeiss.com