Visualização de endosome Dynamics em Viver terminais nervosos com quatro-dimensional imagens de fluorescência

Resumo

Quadridimensional (4D) de imagem é utilizada para estudar o comportamento e as interacções entre os dois tipos de endossomas em terminais nervosos vertebrado vivo. O movimento destas pequenas estruturas é caracterizado em três dimensões, permitindo a confirmação de eventos, tais como a fusão do endossoma e exocitose.

Resumo

Quadridimensional (4D) Luz de imagem tem sido usada para estudar o comportamento de pequenas estruturas dentro de terminais nervosos do motor do transverso abdominal muscular magra da cobrinha. Os dados brutos compreende as sequências de lapso de tempo de z-stacks 3D. Cada pilha contém 4-20 imagens adquiridas com óptica de epifluorescência a planos focais separados por 400-1,500 nm. Etapas na aquisição de pilhas de imagens, tais como o ajuste de foco, de comutação de comprimentos de onda de excitação, e o funcionamento da câmara digital, são automatizados, tanto quanto possível para maximizar a taxa de imagem e para minimizar danos nos tecidos da exposição à luz. Após aquisição, um conjunto de pilhas de imagens é deconvolved para melhorar a resolução espacial, convertido para o formato 3D desejado, e utilizado para criar um 4D "filme" que é adequado para diversas análises baseadas em computador, dependendo dos dados experimentais pretendidos. Uma aplicação é o estudo do comportamento dinâmico de duas classes de endosomes encontrados em terminais nervosos-macroendosomes (MES)e endossomas ácidas (AEs), cujos tamanhos (200-800 nm para ambos os tipos) estão em ou próximo do limite de difracção. O acesso à informação 3D em cada momento fornece várias vantagens sobre imagens de lapso de tempo convencional. Em particular, o tamanho e a velocidade de movimento das estruturas podem ser quantificados ao longo do tempo sem perda de foco. Exemplos de dados de imagens 4D revelam que MEs aproximar da membrana plasmática e desaparecem, o que sugere que eles são exocytosed em vez de um simples movimento, afastado verticalmente, a partir de um único plano de foco. Também é revelado fusão putativo de MEs e AES, através da visualização de sobreposição entre as duas estruturas que contêm corante como visto em cada três projeções ortogonais.

Introdução

Time-lapse de imagem de tecidos vivos proporciona acesso visual para as relações estrutura-função dinâmicos que não podem ser apreciados em preparações que vivem fixos ou fotografada em um único ponto no tempo. Muitas vezes, no entanto, a desvantagem de acesso a informação temporal é uma redução na resolução óptica. Objetivos de imersão em óleo alta abertura numérica são impraticáveis ​​em tecidos vivos por causa de sua estreita faixa de foco, deixando de imersão em água ou objetivos secos como as únicas alternativas. Além disso, o aumento da resolução proporcionada pelo óptica confocal não pode ser utilizado em algumas preparações de vida devido a fototoxicidade dos níveis relativamente elevados de iluminação necessárias ^1,2. Por fim, enquanto várias técnicas ópticas em tempo real ou time-lapse estão disponíveis que oferecem uma melhor resolução, a sua aplicabilidade é limitada às preparações onde as estruturas de interesse podem ser posicionados dentro de algumas centenas de nanômetros do objectivo ^1. O método descritofaz uso de equipamentos de custo relativamente baixo, é versátil, mas oferece melhor resolução em comparação com técnicas de lapso de tempo mais comumente usados. Ele é destinado para uso em laboratórios individuais, bem como instalações de imagem.

O método utiliza microscopia de epifluorescência convencional, combinado com uma câmera digital sensível e com hardware projetado para adquirir rapidamente conjuntos de imagens a um nível ligeiramente diferentes planos focais (Z-pilhas). Cada pilha z digitalmente é deconvolved para aumentar a resolução. Uma característica do 3D time-lapse (4D) de imagem é o acompanhamento preciso das organelas ou outras estruturas em movimento. Quando configurado corretamente, as estruturas fotografadas não saem de foco, eo movimento em todas as três direções podem ser observados e quantificados. Assim, é impossível para uma estrutura manchado a desaparecer em um ou mais quadros de lapso de tempo apenas por deriva acima ou abaixo de um plano focal estreita. O método também serve como uma ferramenta sensível para avaliar as interações e possíveis fução de pequenas estruturas. Epifluorescência Convencional ou imagens confocal de estruturas perto do limite de difração (algumas centenas de nm) não confirmam fusão mesmo que as imagens fundidas mostram sobreposição das respectivas etiquetas ^3. Fusão é sugerida, mas permanece a possibilidade de que os objectos estão separados horizontalmente ou verticalmente por uma distância que é inferior ao limite de difracção. Três ou quatro imagiologia tridimensional, em contraste, permite a visualização dos objectos em cada uma de três direcções ortogonais. O aparecimento de fusão em todos os três pontos de vista aumenta o nível de segurança. E, em algumas preparações de vida, dirigido ou movimento browniano de objetos supostamente fundidos fornece mais uma prova quando ambos os rótulos se movem juntos no tempo. Claro que, quando perto do limite de difração o nível de certeza em estruturas mais exigentes de fundo, ou mostrando que eles contêm dois corantes (fusão), não é absoluta. Se aplicável, técnicas especializadas, tais como a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET)^4, são mais apropriadas.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. Mancha a preparação com supravital Corantes

1. Para o protocolo de dissecção liga cobra ver Stewart et al. ⁵ e Teng et al. ⁶ tecido Reptilian permanece fisiológico para tempos mais longos, e com menos contaminação bacteriana, quando mantido a baixas temperaturas (ver abaixo). Tecidos de mamíferos, é normalmente mantida a temperatura ambiente ou superior.
2. Para lisossômico vital coloração dye, dissolver o corante em frias reptilianos 1:5.000 solução de Ringer (0,2 mm). Incubar a 4 ° C durante 15 min. Lavar várias vezes com Ringer frio. Imagem tão depressa quanto possível.
3. Para FM1-43 coloração utilizando estimulação de KCl, diluir o corante em maior KCl Ringers 1:500 (7 uM). Incubar a 4 ° C durante 30-60 segundos no máximo. Lave rapidamente três vezes com Campainhas frias, ~ 1 min / lavagem. Imagem tão depressa quanto possível.
4. Para FM1-43 utilizando coloração hipertónico estimulação (sacarose), dilui-se o corante em 0,5 M de Ringer sacarose como acima. Incubar a 4 & #176; C durante 2-5 min. Lave como no passo 1.3 acima, com Campainhas frias. Imagem tão depressa quanto possível.
5. Para a coloração de FM1-43 através da estimulação eléctrica, ver Teng et al. ⁶ Resumidamente, a preparação é colocada uma placa contendo solução salina fisiológica e o corante. O nervo é estimulado com um trem pré-programado de 200 ms pulsos retangulares (~ 7 V, 30 Hz, 18 ms). Lave como no passo 1.3 acima, com Campainhas frias. Imagem tão depressa quanto possível.

2. Configure a preparação for Imaging

1. Orientar a preparação de modo a que as estruturas de interesse são o mais próximo possível para o objectivo de microscópio.
2. Se um microscópio invertido é usado, utilizar uma câmara cujo fundo contém uma fina capa de deslizamento rodada. Normalmente, a câmara de imagem deve ter um fundo de aço inoxidável fino com a 25 mm de diâmetro # 1 copo espessura tampa de deslizamento no centro. Se um microscópio vertical é utilizado, uma lamela inferior não é exigido, mas é útilpara permitir a imagem com luz transmitida (por exemplo, contraste de interferência diferencial, DIC) para orientar a amostra e localizar objetos de interesse.
3. Escolha um objetivo adequado para obter a mais alta resolução 3D possível. Existem vantagens e desvantagens entre abertura numérica (NA), distância de trabalho, ampliação, e do tipo de lente (seco, a água e de imersão em óleo). Para as preparações finas como culturas de tecidos, os objetivos do petróleo são as melhores. Usando um microscópio vertical, flutuar uma lamela no banho aquoso, e usar óleo de imersão entre a parte superior da lamínula ea objetiva.
4. Se o software de deconvolução é usado, o vendedor pode fornecer funções predeterminadas ponto spread (PSFs) para determinados objectivos. Se tal informação não é fornecida, ou se um objetivo não suportado for escolhida, determinar o PSF pela imagem micropontos fluorescentes ou limitado de difração de objetos semelhantes ^7,8.

3. Estabelecer a profundidade de campo desejada e Número de Images desejados por Quadro Time-lapse

1. Selecione a profundidade de campo total, de modo que se deslocam ou interagindo estruturas de interesse não desaparecer ou sair de foco à medida que avançam na direção z. O campo z deve exceder ligeiramente a dimensão vertical do processo de células ou célula que está sendo trabalhada. Para os terminais do motor de vertebrados, 15-20 um é típico.
2. Calcula-se a etapa de eixo z necessária para cada incremento de focagem. Resolução ao longo do eixo z varia dependendo de propriedades da objectiva; é cerca de um quarto da resolução do plano xy. Se qualquer imagem confocal ou software de deconvolução é usado, a resolução do eixo z é melhorada. Melhorar a resolução final por oversampling deliberada em direção z ^5, mas ver também o passo 3.3 abaixo. Um intervalo típico etapa está no intervalo de 400-1,500 nm para objectivos 40-100X. Luz deve ser fechada fora de cada imagem z-passo entre os dois.
3. Selecione o número de imagens por z-stack, ou seja, a profundidade de campo desejada divididopelo intervalo de passo. Tempo para completar um z-pilha típica é de 1-10 seg. Objetos em movimento rápido (100 nm / seg) pode aparecer desfocada em uma pilha de imagens em 3D, pois cada plano de imagem corresponde a um ponto no tempo um pouco diferente. Além disso, cada imagem adicional contribui para a fotodegradação e fototoxicidade possível (ver Discussão). Se uma ou outra situação diz respeito, escolha um z-passo maior para coletar menos imagens por pilha. Compensar mais tarde usando o software de interpolação de imagem (passo 6.3 abaixo).

4. Selecione o Time-lapse Frame Rate

Escolha pela experimentação uma taxa que é apenas adequado para resolver problemas muda com o tempo, como movimento, interações ou eventos de fusão ^9. Sob amostragem pode produzir artefatos de movimento (erros de amostragem), enquanto oversampling aumenta desnecessariamente a exposição à luz. Coletar uma única seqüência longa ou várias seqüências repetidas da mesma preparação, cada um com um pequeno intervalo de tempo total ( por exemplo, 10 pontos de tempo de 30 seg x intervalo = 5 min.) Se possível, ver a preparação com iluminação epifluorescência contínuo para estimar aproximadamente velocidades de movimento, incluindo o desvio de toda a preparação se presente.

5. Conclua Todos Imagens ao vivo para uma preparação especial

Preparações reptilianos geralmente permanecem robustos para ~ 1-2 horas, mais tempo se resfriado.

6. Analisar dados de acordo com uso desejado

1. Guarde todos os arquivos de dados brutos. Embora o armazenamento digital geralmente não é um problema, o tempo de processamento é ainda significativa com computadores pessoais rápidas ou estações de trabalho. Por esta razão, as imagens das culturas para uma região de interesse [ROI]. Assegurar que toda a região de interesse é a janela cortada ao longo de todo o curso do tempo.
2. Deconvolve imagem pilhas usando software apropriado ea função de propagação do ponto correto. Confirme que a resolução é melhorada e que nenhum artefato foi gerado pelaalgoritmo de desconvolução. Figura 3 mostra exemplos de imagens.
3. Use um algoritmo de interpolação para expandir eixo z aparente resolução. Uma expansão 6X de uma separação real do plano de imagem de 1,5 um para um de 0,25 mM de separação aparente é sugerido. Como alternativa, use uma combinação de oversampling (passo 3.2) e interpolação.
4. Realize contraste, brilho, filtragem de ruído, fotodegradação e outros ajustes típicos de processamento de imagem, se desejar. Normas de manipulação de imagem determinam que para a maioria dos trabalhos científicos, é conveniente que as mesmas correções ser aplicada a todas as imagens, tanto dentro de uma pilha e em momentos diferentes. A conseqüência de um ajustamento especial deve ser avaliada entre todas as imagens ^9.
5. Selecione um modo de exibição específico para exportação de dados. A exibição mais simples é de vídeo estéreo usando tanto anaglyphs vermelho-verde ou vermelho-azul (exemplos na Figura 3), pares estéreo, ou alternando esquerda / right olho quadros com óculos. Anaglyphs estão limitados a uma única cor. Melhore a profundidade da imagem aparente se desejado para melhorar a resolução visual-eixo z.
6. Experimentar várias técnicas de aprimoramento de filtragem e de imagem. Por exemplo, a filtragem de Laplace é útil para aumentar o contraste de pequenas estruturas acima do fundo. O brilho dos pixels no centro de uma janela de correr é melhorada enquanto a luminosidade das áreas circundantes é reduzida. Note-se que alguns métodos de filtragem não funcionam bem em combinação.
7. Aplicar correção de desvio se não houver movimento substancial da preparação ao longo do tempo. Tal movimento é comum no músculo vivo, mesmo com medicamentos adicionados para suprimir os potenciais de ação e potenciais sinápticos. Um algoritmo de registro de pixel (eg. Imaris, Adobe After Effects, TurboReg plugin para o ImageJ) alinha imagens de lapso de tempo e pode reduzir, mas geralmente não eliminar completamente, tal movimento.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Os dados apresentados são a partir de terminais de cobra neuromusculares (ver as vistas de baixo e de alta ampliação na Figura 3, o corante endocítica (FM1-43) absorção cria uma neblina que enche cada Bouton) e, em particular, macroendosomes (MES) e endossomas ácidas (EAs) dentro destes terminais ^5. MEs são criados por endocitose massa durante a atividade neural ¹⁰ e seu número diminui exponencialmente com o tempo após a atividade cessou ^6. Uso de imagens 4D vi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

O aspecto mais crítico de 4D de imagem é a gestão da duração e intensidade da exposição à luz. Fotodegradação diminui imagem relação sinal-ruído e pode ser problemático ou não, dependendo de vários fatores, incluindo a escolha de fluoróforos. Danos não específica para o tecido vivo (fototoxicidade) está relacionada com a fotodegradação, e, por vezes, pode ser identificada utilizando sondas fluorescentes concebidos para o efeito ou ^2,12 por exame da morfologia com ópticas de campo claro ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
SGC5	Biotium, Hayward, CA	70057	Final conc: 10 mM
FM1-43FX	Invitrogen, Carlsbad, CA	F35335	Final conc: 7 mM
LysoTracker Red	Invitrogen, Carlsbad, CA	L7528	Final conc: 0.2 mM
Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl			145 mM
KCl			2.5 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
High KCl Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl			86 mM
KCl			60 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
High Sucrose Ringers pH 7.2
NaCl			145 mM
KCl			2.5 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
Sucrose			0.5 M (17.1 g/50 ml)
Axioplan 200 inverted microscope	Carl Zeiss, Thornwood, NY		www.zeiss.com
N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm	Carl Zeiss, Thornwood, NY		www.zeiss.com
DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher	Sutter Instruments, Novato, CA	175W Xenon arc lamp	www.sutter.com
Lambda 10-2  emission filterwheel switcher	Sutter Instruments, Novato, CA		www.sutter.com
Sensicam CCD camera	Cooke Instruments, Tonawanda, NY		www.cookecorp.com
Cascade 512 CCD camera	Photometrics, Tucson, AZ		www.photometrics.com
Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins
Software
Slidebook 5.0	Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO	Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation	www.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2	Bitplane, South Windsor, CT	Drift correction; 3D and 4D data presentation	www.bitplane.com
AfterEffects CS6	Adobe, San Jose, CA	Drift correction	www.adobe.com
ImageJ 1.46	National Institutes of Health, Bethesda, MD	Multiple plugins available; Stereo pair construction	http://rsbweb.nih.gov/ij
Zeiss LSM	Carl Zeiss, Thornwood, NY	Stereo pair construction	www.zeiss.com