네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화

요약

사차원 (4D) 영상은 척추 신경 터미널을 살고있는 엔도 좀의 두 가지 유형 사이의 행동과 상호 작용을 연구하기 위해 사용된다. 이 작은 구조의 이동은 같은 엔도 좀의 융합과 세포 외 유출 등의 이벤트의 확인을 허용, 세 가지 차원을 특징으로한다.

초록

가터 뱀의 근육을 abdominis 사차원 (4D) 빛의 영상은 얇은 transversus의 모터 신경 터미널에서 작은 구조의 행동을 연구하는 데 사용되었습니다. 원시 데이터는 3D의 Z-스택의 시간 경과 시퀀스를 포함한다. 각 스택은 400-1,500 nm의로 구분 초점 평면에서 표면 형광 광학으로 획득 한 4-20 이미지가 포함되어 있습니다. 이러한 포커스의 조정 등의 화상 스택의 입수 단계는, 여기 파장의 스위칭, 및 디지털 카메라의 동작은, 화상 비율을 최대화하고, 노광에서의 조직 손상을 최소화하기 위해 가능한 한 자동화된다. 인수 후, 이미지 스택의 세트가 공간 해상도를 향상시킬 수 deconvolved되어, 원하는 3D 형식으로 변환하고, 4D "영화"그 노력 실험 데이터에 따라, 컴퓨터 기반 분석의 다양한 적합을 만드는 데 사용됩니다. 하나의 응용 프로그램은 신경 터미널 - macroendosomes에서 발견 엔도 좀의 두 클래스 (MES)의 동적 거동의 연구이다및 (AES) - 누구의 크기 (두 가지 유형 200 ~ 800 nm의) 산성 엔도 좀은 회절 한계에 또는 근처에 있습니다. 각 시점에서의 3D 정보에 대한 액세스는 종래의 시간 경과 이미징에 비해 여러 장점을 제공한다. 특히, 크기 및 구조의 이동 속도는 날카로운 초점의 손실없이 시간을 통해 정량화 할 수있다. 4D 촬상 데이터의 예로는 그들이 exocytosed보다는 단순히 수직 거리에 초점이 하나의 평면에서 이동하는 것을 제안, MES는 원형질막 접근 사라지는 것으로 나타났다. 또한 각 3 직교 전망에서 볼 때 두 염료를 포함하는 구조에 대한 중복 시각화하여 MES 및 AES의 추정 융합입니다 밝혔다.

서문

조직 생활의 시간 경과 영상은 시간의 한 지점에서 이미지가 고정 또는 생활 준비에 알 수없는 동적 구조 - 기능 관계에 대한 시각에 대한 액세스를 제공합니다. 그러나, 종종 시간 정보에 액세스하기위한 트레이드 오프는 광학 해상도의 감소이다. 높은 수치 조리개 기름 침지 목표는 유일한 대안으로 침수 또는 건조 목적을두고 있기 때문에 초점이 자신의 좁은 범위의 조직 생활에 실용적이다. 또한, 공 초점 광학에 의해 제공 증가 된 해상도는 조명의 상대적으로 높은 수준의 ^1,2 필요한에서 광독성 환경에 따라 약간의 생활 준비에 활용 될 수 없습니다. 여러 실시간 또는 시간 경과 광학 기술이 제공하는 향상된 해상도를 사용할 수있는 동안 마지막으로, 자신의 적용은 그 구조가 목표 ^1의 몇 백 나노 미터 내에 위치 할 수있는 준비로 제한됩니다. 기재된 방법상대적으로 저가의 장비를 사용한다 다목적, 아직 더 일반적으로 사용되는 시간 경과 기술에 비해 향상된 해상도를 제공합니다. 그것은 개인의 실험실뿐만 아니라 영상 시설에서 사용하기위한 것입니다.

방법은 민감한 디지털 카메라로 급속 약간 다른 초점 평면 (Z-스택)에서의 이미지 세트를 획득하기 위해 설계된 하드웨어와 함께, 종래의 표면 형광 현미경을 이용한다. 각각의 Z-스택은 디지털 해상도를 증가 deconvolved된다. 3D 시간 경과 (4D) 영상의 하나의 기능은 세포 기관 또는 다른 구조물을 이동의 정확한 추적합니다. 제대로 설정하면, 몇 군데 구조는 초점이 이동하지 않고, 세 방향으로의 움직임을 관찰하고 정량화 할 수있다. 스테인드 구조는 단지 좁은 초점 평면 위 또는 아래에 표류하여 하나 이상의 시간 경과 프레임에 사라에 따라서는 불가능하다. 방법은 또한 상호 작용 가능한 푸을 평가하기위한 중요한 툴로서 기능작은 구조의 시온. 기존의 표면 형광 또는 회절 한계 (수백 nm의)에 가까운 구조의 공 촛점 이미지가 병합 된 이미지는 각각의 라벨 ^3의 중복을 보이고도 융합을 확인하지 않습니다. 융합 제안하지만 개체 회절 한계 이하의 거리에 의해 수평 또는 수직으로 분리되어 남아있을 수있다. 3-4 차원 화상은, 대조적으로, 세 개의 직교하는 방향의 각각에 오브젝트를 볼 수있게. 모두 세 가지보기에서 융합의 모양은 확실성 수준을 증가시킨다. 그리고, 약간의 생활 준비에, 감독 또는 둘 모두 라벨이 시간에 함께 이동할 때 상상 속으로 융합 개체의 브라운 운동은 더 증거를 제공한다. 물론 때 회절 한계 근처에서 배경 엄선한 구조의 확실성 또는 그들이이 염료 (융합)가 포함되어 있음을 보여주는 수준은 절대 아니다. 만약 예컨대 형광 공명 에너지 전달 (FRET)와 같은 적용, 특수 기술^4, 더 적합합니다.

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프로토콜

1. Supravital 염료와 준비 얼룩

1. 가터 뱀 해부 프로토콜의 스튜어트 등. ^5를보고 탱 등. ⁶ 파충류 조직은 긴 시간에 대한 생리 학적 남아 있고, 적은 세균 오염과, (아래 참조) 낮은 온도로 유지합니다. 포유 동물 조직은 일반적으로 실온 또는 그 이상으로 유지된다.
2. 리소좀 중요한 염료의 염색을 위해, 차가운 파충류 링거 용액 1:5,000 (0.2 μM)에 염료를 용해. 15 분 동안 4 ° C에서 알을 품다. 차가운 링거 여러 번 씻는다. 가능한 한 빨리 이미지.
3. 의 KCl 자극을 사용하여 FM1 -​​ 43 염색의 경우, 고의 KCl 링거 1:500 (7 μM)에 염료를 희석. 30 ~ 60 초에 최대 4 ° C에서 알을 품다. ~ 1 분 / 린스, 차가운 링거 빠르게 세 번 씻으십시오. 가능한 한 빨리 이미지.
4. 고장 성 (자당) 자극을 사용하여 FM1 -​​ 43 염색의 경우, 상기와 0.5 M의 자당 링거의 염료를 희석. 4 & #을 품다176, 2-5 분 동안 C. 차가운 링거와 함께 위의 단계 1.3로 씻으십시오. 가능한 한 빨리 이미지.
5. FM1 - 43 염색에 대한 전기 자극을 통해, 탱 등. ⁶ 간단히 참조, 준비는 생리 식염수와 염료를 포함하는 요리를 배치됩니다. 신경은 200 마이크로 초 직사각형 펄스 (~ 12 V, 30 Hz에서, 18 마이크로 초)의 사전 프로그래밍 된 기차로 자극된다. 차가운 링거와 함께 위의 단계 1.3로 씻으십시오. 가능한 한 빨리 이미지.

2. 이미징을위한 준비를 구성

1. 그 구조는 현미경 대물에 최대한 가깝게되도록 준비 배향.
2. 도립 현미경을 사용하는 경우, 그 하부 라운드 얇은 커버 슬립을 포함하는 챔버를 이용한다. 전형적으로, 촬상 챔버는 중앙에 25mm 직경 중 1 두께 유리 커버 슬립으로 얇은 스텐레스 바닥을 가져야한다. 직립 현미경을 사용하는 경우, 하부 커버 슬립은 필수이지만 유용되지전송 된 빛으로 영상을 허용 (예를 들어 미분 간섭 대비, DIC)는 시편의 방향과 관심의 개체를 찾을 수 있습니다.
3. 가장 높은 3D 해상도를 얻기 위해 적절한 목표를 선택합니다. 장단점이 개구 렌즈 (NA), 작동 거리, 확대 및 유형 가운데있다 (건조, 물과 기름 침지). 조직 문화와 같은 얇은 준비를 위해, 석유 목표는 최고입니다. 직립 현미경을 사용하여, 수계 욕 커버 슬립을 띄워 커버 슬립의 상단과 대물 간의 침지 오일을 사용한다.
4. 디콘 볼 루션 소프트웨어가 사용되는 경우, 판매자는 특정 목적의 소정의 점 분포 함수 (PSFS)을 제공 할 수 있습니다. 이러한 정보가 제공되지 않거나 지원되지 않는 목적을 선택하면, 형광 마이크로 도트 또는 유사한 회절 한정 개체 ^{7,8 촬상하여} PSF를 결정하는 경우.

3. 원하는 필드의 깊이와 이마의 번호를 설정시간 경과 프레임 당 원하는 GES

1. 필드의 전체 깊이를 선택하는 것이 너무 이동하거나 그 구조가 사라지거나 그들이 Z-방향으로 이동 초점이 이동하지 않는 상호 작용. Z 필드는 약간 군데 중의 셀 또는 셀 공정의 수직 치수를 초과해야한다. 척추 모터 단자의 경우, 15 ~ 20 μm의는 일반적입니다.
2. 포커스의 각 증가에 필요한 Z-축 단계를 계산한다. Z-축을 따르는 해상도의 목적 특성에 따라 변화한다; 이것은 XY 플레인의 해상도의 약 네번째이다. 공 촛점 이미징 또는 컨볼 루션 소프트웨어 중 하나를 사용하는 경우, Z-축 해상도가 향상된다. z 방향 ⁵ 의도적으로 오버 샘플링에 의해 최종 해상도를 향상뿐만 아니라, 아래 3.3 단계를 참조하십시오. 전형적인 스텝 간격은 40-100X 목적의 400-1,500 nm 내지 범위이다. 빛은 각각의 Z-단계의 이미지에 사이 문을 닫았해야합니다.
3. Z-스택 당 이미지 수를 선택, 즉 필드의 원하는 깊이는 분할스텝 간격으로. 일반적인 Z-스택을 완료하는 시간은 1-10 초이다. 각각의 이미지 비행기가 약간 다른 시점에 해당하기 때문에 빠른 속도로 움직이는 물체 (100 ㎚ / 초) 3D 이미지 스택에서 흐리게 나타날 수 있습니다. 또한, 각각의 추가 이미지는 광표백 가능한 광독성 (토론 참조)에 기여한다. 어느 상황이 속하는 경우, 스택 당 적은 수의 이미지를 수집하는 더 큰 Z-단계를 선택합니다. 이미지 보간 소프트웨어 (아래 단계 6.3)를 사용하여 나중에 보정합니다.

4. 시간 경과 프레임 속도를 선택합니다

부드럽게 같은 움직임, 상호 작용 또는 융합 이벤트를 ^9로 시간 변화를 해결하기 위해 단지 충분 속도를 실험에 의해 선택합니다. 오버 샘플링이 불필요하게 빛에 대한 노출이 증가하면서 샘플링에서 모션 아티팩트 (표본 오차)를 생성 할 수 있습니다. 하나의 긴 시퀀스 나 같은 준비, 상대적으로 작은 총 시간 간격으로 각 (에서 몇 가지 반복되는 시퀀스 중 하나를 수집 예를 들어 10 시간의 점 X 30 초 간격 = 5 분). 가능하면, 전체 제제의 드리프트를 포함하여, 대략 추정 동작 속도로 연속적인 표면 형광 조명 제제를 본 경우에.

5. 특정 준비를 위해 모든 라이브 영상을 완료

파충류 준비는 일반적으로 냉각 긴 경우, ~ ~ 2 시간 동안 강력한 남아있다.

6. 원하는 용도에 따라 데이터 분석

1. 모든 원시 데이터 파일을 유지합니다. 디지털 저장은 일반적으로 문제가되지 않지만, 처리 시간도 빠른 개인용 컴퓨터 나 워크 스테이션과 함께 중요하다. 이러한 이유로,이자 [투자 수익 (ROI)]의 영역에 자르기 이미지. 관심의 전체 영역이 전체 시간의 과정 동안 자른 창에 있음을 확신합니다.
2. Deconvolve 콘텐츠 적절한 소프트웨어 및 정확한 점 분포 함수를 사용하여 스택. 그 해상도가 향상 확인하고 아무 유물에 의해 생성되지 않았디컨 볼 루션 알고리즘. 그림 3은 예를 들어 이미지를 보여줍니다.
3. z 축 명백한 해상도를 확장 보간 알고리즘을 사용합니다. 명백한 0.25 μm의 분리에 실제 1.5 μm의 이미지 평면 분리에서 배의 확장을 제안한다. 또한, 오버 샘플링의 조합 (단계 3.2) 및 보간을 사용합니다.
4. 원하는 경우, 콘트라스트, 밝기, 노이즈 필터링, 광표백 유용한 일반적인 화상 처리의 조정을 수행한다. 이미지 처리 표준은 대부분의 과학적인 작업을 위해, 그것은 동일한 수정을 스택 내의 서로 다른 시점에서 모두, 모든 화상에 적용되는 것이 적절하다는 것을 지시. 특정 조정의 결과는 모든 이미지 ⁹ 사이에서 평가되어야한다.
5. 데이터의 수출을 위해 특정 표시 모드를 선택합니다. 가장 간단한 디스플레이는 녹색 - 빨강 또는 빨강 - 파랑 입체 사진 (그림 3의 예), 스테레오 쌍, 또는 교대를 사용하여 스테레오 영상입니다 맞 왼쪽 /T 눈은 셔터 안경 프레임. 입체 사진은 단일 색상으로 제한됩니다. Z 축 시각적 해상도를 향상시키기 위해 필요한 경우 겉보기 화상 농도를 향상시킨다.
6. 다양한 필터링 및 이미지 향상 기술을 실험. 예를 들어, 라플라스 필터링을 배경 위의 작은 구조의 대비를 증가하는 데 유용합니다. 주변 영역의 밝기가 감소하는 동안 실행되는 윈도우의 중심 화소의 밝기가 향상된다. 몇 가지 필터링 방법은 조합에서 잘 작동하지 않습니다.
7. 시간에 따른 제제의 상당한 움직임이있을 경우, 드리프트 보정을 적용한다. 이러한 운동은 약이 활동 전위와 시냅스 전위를 억제하기 위해 추가 심지어, 근육을 생활에 일반적입니다. 픽셀 등록 알고리즘 (예. IMARIS, 어도비 애프터 이펙 츠, ImageJ에 대한 TurboReg 플러그인) 시간 경과 이미지를 정렬 줄일 수 있지만, 일반적으로 완전히 같은 동작을 제거하지.

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결과

표시 데이터 (그림 3에서 낮은 고배율 뷰를 볼 수 있으며, 세포 내 이입 염료 (FM1-43) 흡수는 각 부통을 채우는 안개를 만듭니다) 뱀 신경 근육 터미널에서이고, 특히, macroendosomes (MES) 및 산성 엔도 좀 (AES) 이 터미널 ⁵ 이내. MES는 신경 활동 ^10시 대량 엔도 시토 시스에 의해 만들어지고 활동이 ^6을 중단 한 후 자신의 수는 시간이 기하 급수적으로 감소된다. 4D 라이?...

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토론

4D 영상의 가장 중요한 측면은 노광의 지속 시간 및 강도의 관리이다. 광표백은 화상 신호 대 잡음비를 감소 및 형광체의 선택을 포함하는 다양한 요인에 따라 문제 여부 일 수있다. 생체 조직 (광독성)에 비특이적 손상 photobleaching에 관련되어, 때로는 목적 ^2,12 나 미분 간섭 대비 (DIC)로서 적합한 시야 광학계와 형태의 시험에 의해 설계 형광 프로브를 이용하여 식별 될 수있다.

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
SGC5	Biotium, Hayward, CA	70057	Final conc: 10 mM
FM1-43FX	Invitrogen, Carlsbad, CA	F35335	Final conc: 7 mM
LysoTracker Red	Invitrogen, Carlsbad, CA	L7528	Final conc: 0.2 mM
Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl			145 mM
KCl			2.5 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
High KCl Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl			86 mM
KCl			60 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
High Sucrose Ringers pH 7.2
NaCl			145 mM
KCl			2.5 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
Sucrose			0.5 M (17.1 g/50 ml)
Axioplan 200 inverted microscope	Carl Zeiss, Thornwood, NY		www.zeiss.com
N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm	Carl Zeiss, Thornwood, NY		www.zeiss.com
DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher	Sutter Instruments, Novato, CA	175W Xenon arc lamp	www.sutter.com
Lambda 10-2  emission filterwheel switcher	Sutter Instruments, Novato, CA		www.sutter.com
Sensicam CCD camera	Cooke Instruments, Tonawanda, NY		www.cookecorp.com
Cascade 512 CCD camera	Photometrics, Tucson, AZ		www.photometrics.com
Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins
Software
Slidebook 5.0	Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO	Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation	www.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2	Bitplane, South Windsor, CT	Drift correction; 3D and 4D data presentation	www.bitplane.com
AfterEffects CS6	Adobe, San Jose, CA	Drift correction	www.adobe.com
ImageJ 1.46	National Institutes of Health, Bethesda, MD	Multiple plugins available; Stereo pair construction	http://rsbweb.nih.gov/ij
Zeiss LSM	Carl Zeiss, Thornwood, NY	Stereo pair construction	www.zeiss.com